<em&gt; В Ово</em&gt; Хорионалантоисной Мембрана (САМ) Анализ как эффективный ксенотрансплантата модели гепатоцеллюлярной карциномы

Резюме

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

Аннотация

Хорионалантоисной мембрана (CAM) начинает развиваться на 7 день после оплодотворения и созревает день 12. САМ естественно иммунодефицитом и высокой васкуляризации, что делает его идеальной системой для имплантации опухоли. Кроме того, CAM содержит белки внеклеточного матрикса, таких как фибронектин, ламинин, коллаген, интегринового альфа (v) Beta3 и ММР-2, что делает его привлекательным модель для изучения опухолевой инвазии и метастазированию. Ученые давно воспользовались физиологии CAM, используя его в качестве модели ангиогенеза. Совсем недавно, САМ-анализ был изменен, чтобы работать, как в естественных условиях ксенотрансплантанта модельной системы для различных видов рака, что устраняет разрыв между основной работой в пробирке и более сложных моделях рака животное. Анализе САМ позволяет для изучения роста опухоли, противоопухолевых терапий, и про-опухолевых молекулярных путей в биологически соответствующей системы, которая одновременно экономически и время эффективным. Здесь мы опишем развитие CAM Xenograft модель гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) с эмбриональными выживаемости до 93% и надежной опухоли занимают ведущие к росту трехмерных, васкуляризированных опухолей.

Введение

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является ^3-й ведущей причиной смертности от рака в мире ^1. В настоящее время только 30% пациентов с ГЦК из имеют право на потенциально лечебных хирургических методов лечения ^{2 и} системная химиотерапия не эффективна ^3. Таким образом, существует настоятельная неудовлетворенная клиническая необходимость в новых ГЦК терапии, и развитие модельных систем, пригодных для эффективного тестирования новых агентов. Хорионалантоисной мембрана (CAM) анализ обеспечивает воспроизводимое, экономически эффективной, и быстрый метод средней пропускной тестирования потенциальных лекарств против опухолевых в естественных условиях.

САМ тест широко используется для изучения ангиогенеза ^4. Это также успешно превратилась в модели ксенотрансплантата опухоли раковых заболеваний, в том числе глиобластомы ^5, рак поджелудочной железы, меланомы ^{6 7-9} и ^10-11 остеосаркомы. И в яйце ¹² и экс ово¹³ методы были использованы в литературе, с деталями из различных протокола для протокола. Одна из основных задач в модели CAM ксенотрансплантанта является относительно высокий уровень эмбриональной смерти после манипуляций с яйцом, с опубликованным тарифам куриных эмбрионов смертности, начиная от 25 - 50 процентов ^11-14.

В этой статье мы опишем разработку ин ово модели ксенотрансплантата ГЦК, которые надежно производит рост трехмерных, васкуляризированных опухолей, которые гистологически напоминают недифференцированные HCC. Мы адаптировали протокол, впервые описанного Ossowski соавт. ¹⁴ и добились куриных эмбриональных выживаемости до 93% с чрезвычайно высокой приживления опухоли.

протокол

1. Яйцо Инкубационный

1. Получить 8 день старые конкретного патогена яиц с эмбрионами.
2. Поместите яйца в яйца лоток вращения, штампованные концы вверх, и поместите поднос вращающийся внутри яичной инкубатора. Выдержите яйца в течение 48 ч при 36 ° С и 50% влажности.

2. Падение CAM и открытие яйца

1. Соберите яйца из инкубатора. Место яйца в яйца стойки, штамп стороной вверх, и довести до ламинарный.
2. Выключите в комнате и капот фары.
3. Держите штамп конец яйца слегка яйца Кандлер подвергать сосудистой САМ, а также воздушный мешок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: яйцо Кандлер является источником света для визуализации развивающийся эмбрион и связанного воздушный мешок и сосудистую.
4. Поставьте карандашом отметку в между двумя крупными кровеносными сосудами.
5. Включите свет и использовать стерильные толчок булавку, чтобы сделать одно отверстие на кончике над воздушный мешок (отметка конца) яйца и одно отверстие в реncil знак. Не нажимайте нажимной штифт весь путь через; отверстие около 3 мм глубиной, как правило, достаточно.
6. Выключите свет. Сожмите безопасности лампы, нажав открытый конец плотно к отверстию над воздушным мешком. Применить всасывания тянуть воздух в отверстие на карандаш марки, в результате чего САМ отказаться от оболочки на карандаш марки.
7. Убедитесь, что воздушный мешок переехала из штампованной конце яйца в карандашом отмечены отверстие с помощью Candler. Если это не так, используйте толчок штифт, чтобы оба отверстия чуть глубже, а затем повторно применить всасывание с помощью безопасности лампу.
8. Включить свет. Проведение яйцо в одной руке, включите Dremel вращающегося инструмента с 15/16 дюйма светотеневой колесо, прикрепленное и сделать два поперечных разрезов только достаточно глубоко, чтобы прорезать оболочку, но не достаточно глубоко, чтобы сократить весь путь вниз к депрессии CAM. Сделать разрезы около 2 см в длину и 1 см друг от друга. Сделайте разрезы достаточно широк, так что силиконовые кольца на 1 см в диаметре может пройти черезно тоньше, чем ширина стандартной скотча.
9. Далее, чтобы сократить 1 между продольной и на концах двух поперечных разрезов, слегка касаясь отрезной круг к оболочке.
10. Slide стерильного пинцета под оболочки элемента и параллельно к корпусу. Возьмите кусок раковины с пинцетом и удалить весь кусок чисто.
11. Поместите скотч на вновь открытом окне, убедившись, что складывать один конец более на себе для простоты удаления.
12. Место яйца в инкубаторе назад в яичном лотке (а не в вращающихся стоек яиц) до времени прививки.

3. Прививка

1. Держите базальную мембрану белка смесь, например, матригеле, на льду (для предотвращения полимеризации) и место в шкафу.
2. Использование 2 мМ ЭДТА, чтобы отделить клетки (4 - 5 мл на колбу Т75) и поместите в колбах культуры тканей инкубаторе в течение 5 мин.
3. Ресуспендируют отдельные клетки в средствах массовой информации и рассчитывать с использованием гемоцитометра и трипановым синим. Используйте между 500000 тO 2000000 клеток для прививки на САМ, в зависимости от клеточной линии. Оптимизация нужное количество в предварительных экспериментах.
4. Измерьте объем требуется для соответствующего числа клеток и центрифуге при 500g в течение 5 мин.
5. Удалите супернатант и затем ресуспендируют осадок клеток в 40 μ л PBS ++ и 20 μ л базальной мембраны смеси.
   Примечание: В этот момент клетки могут лечить с помощью препаратов или других агентов испытаний при необходимости для экспериментов путем ресуспендирования клеток в / базальной мембраны смеси суспензии. Кроме того, агенты могут быть пипеткой на сотовый / базальной мембраны смеси суспензии после прививки.
6. Получить яйцо стойку с яйцами из инкубатора и место в капюшоне ламинарного потока.
7. Пил ленты от окна, получить 1 мм силиконовой кольцо с крышки криогенного флаконе с использованием стерилизованных пинцетом, и падение кольцо через окно.
8. Внесите 60 μ л раствора ячейка PBS ++ и базальной мембраны Mixturе непосредственно в центре кольца силиконовой покоится на САМ.
9. Re-лента окно и перейти яйцо стойку обратно в инкубатор. В этот момент, соблюдайте осторожность при перемещении яйца, как кольца и клеточной суспензии может легко стать перемещенными лицами.
10. Разрешить опухоли расти в течение 5 до 7 дней.

4. Сбор Опухоли

1. Место под-площадку в капот. Подготовка 35 х 10 мм пластин и ПАРАФОРМАЛЬДЕГИДОМ контейнеры по мере необходимости для гистологического исследования. Положите 1 мл PBS ++ в каждом 35 х 10 мм пластины.
2. Поместите биологически опасных сумку в капот. Возьмите ножницы рассечение стерильные и вставьте заостренный конец в яйце в отверстие рядом с печатью конца.
3. Сокращение вокруг всей яйца в продольном направлении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: САМ, и опухоль с кольцом должны придерживаться верхней половине корпуса с окном.
4. Использование рассечение ножницами и щипцами, рассекать опухоль от CAM и поместите опухоль в мм пластины 35 х 10. Измерьте и весят опухоли. Исправлены опухоли в paraformaldehyде, а затем парафин-вставлять их для использования в гистологии и иммуногистохимии экспериментов.

5. (Необязательно): опухоль сотовый Диссоциация

1. Используйте рассечение ножницами, чтобы фарш опухоль в мм пластины 35 х 10. Налейте измельченным опухоль в 15 мл центрифужную пробирку и удалить столько PBS ++, как это возможно через пипетки.
2. Добавляют 2 мл коллагеназы (1 мг / мл в PBS ++), повернуть трубку несколько раз, и инкубируют трубку при 37 ° С в течение не менее 30 мин (до нескольких часов).
3. Добавьте 5 мл средства массовой информации в каждую пробирку и ресуспендируют тщательно с помощью пипетки вверх и вниз 20 - 40х. Тщательное пипетки является критическим для полной диссоциации клеток.
4. Разрешить оседать, и передавать супернатант в новую пробирку. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант, оставляя позади диссоциированного гранул клеток.
   Примечание: В этот момент, клеточные осадки могут быть использованы для различных экспериментов (проточной цитометрии, лизиса для использования в вестерн-блоттинга, выделения РНК, и т.д.), Общее количество опухолевых клеток может быть также получено с помощью гемоцитометра и окрашивания трипановым синим. Следует отметить, что мелкие, овальные клетки клетки кур от CAM и не должны считаться опухолевых клеток. Там должно быть минимальное количество загрязняющих неопухолевые (САМ) клетки, если опухоль отсечен от CAM тщательно.

Результаты

Представительства фотографии основных этапов в протоколе приведены здесь. 1А демонстрирует использование Кандлер визуализации развивающийся эмбрион, воздушный мешок, и сосудистую САМ. 1В-1С показывают процесс падения CAM путем два отверстия, а затем применяя отрицате...

Обсуждение

Несколько ключевых шагов в этом протоколе, скорее всего, приходится улучшенной эмбрионального выживания, а также повышенной надежностью роста опухоли. Падение CAM от оболочки путем применения всасывания воздуха мешка менее агрессивна, чем другие существующие методы (с помощью иглы для...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Premium incubated eggs	Charles River	N/A	http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx
Egg incubators	GQF	Hova-Bator 2362N
Rotating egg trays	GQF	1611 Automatic Egg Turner
Egg candler	Lyon	Hi-Power 950-070
Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel	Dremel	100-N/7
Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape
Matrigel	BD Biosciences	356234
Cryogenic vials, external thread with silicone washer	Corning	430659
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C9891