Il<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick corioallantoidea membrana (CAM) Saggio come un efficiente dello xenotrapianto Modello di carcinoma epatocellulare

Riepilogo

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

Abstract

La membrana corioallantoidea pulcino (CAM) comincia a sviluppare il giorno 7 dopo la fecondazione e matura di giorno 12. Il CAM è naturalmente immunodeficienti e altamente vascolarizzato, che lo rendono un sistema ideale per tumore impianto. Inoltre, il CAM contiene proteine ​​della matrice extracellulare, come fibronectina, laminina, collagene, integrina alfa (v) beta3, e MMP-2, che lo rendono un modello attraente per studiare invasione tumorale e metastasi. Gli scienziati hanno a lungo approfittato della fisiologia del CAM usandolo come modello di angiogenesi. Più di recente, il test CAM è stato modificato per lavorare come in vivo xenotrapianto sistema modello per vari tipi di cancro che colma il divario tra il lavoro di base in vitro e modelli di cancro animali più complessi. Il test permette CAM per lo studio della crescita tumorale, terapie anti-tumorali, e percorsi molecolari pro-tumorali in un sistema biologicamente rilevante che è sia in termini di costi e di tempo efficace. Qui, descriviamo lo sviluppo di Xen CAMModello ograft del carcinoma epatocellulare (HCC), con tassi di sopravvivenza embrionali fino al 93% e tumore affidabile take che porta alla crescita dei tumori vascolarizzati tridimensionali.

Introduzione

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è la ³ ° causa principale di mortalità per cancro nel mondo ^1. Attualmente solo il 30% dei pazienti con carcinoma epatico sono ammissibili per i trattamenti chirurgici potenzialmente curative ^2, e la chemioterapia sistemica non è efficace ^3. Pertanto, vi è una pressante necessità clinica insoddisfatta di terapie HCC romanzo, e lo sviluppo di sistemi modello adatti efficiente sperimentazione di nuovi agenti. Il corioallantoidea test pulcino membrana (CAM) fornisce una riproducibilità, costo-efficacia, e veloce metodo di medio-throughput di testare potenziali farmaci antitumorali in vivo.

Il saggio CAM è stato ampiamente utilizzato per studiare l'angiogenesi ^4. E 'stato anche sviluppato con successo in un modello di xenotrapianto di tumore di tumori, tra cui ⁵ glioblastoma, cancro al pancreas ^6, il melanoma ^7-9, e osteosarcoma ^10-11. Sia in ovo ¹² ed ex ovo^{13 tecniche} sono state utilizzate in letteratura, con dettagli variano da protocollo protocollo. Una sfida importante per il modello CAM xenotrapianto è relativamente alta incidenza di morte embrionale dopo la manipolazione delle uova, con tassi di mortalità embrione di pulcino pubblicati vanno 25-50 per cento ^11-14.

In questo articolo, si descrive lo sviluppo di un modello di xenotrapianto in ovo di HCC che produce in modo affidabile la crescita di tridimensionali, tumori vascolarizzati che istologicamente assomigliano HCC indifferenziata. Abbiamo adattato un protocollo prima descritto da Ossowski et al. ¹⁴ e abbiamo raggiunto pulcino embrionale tassi di sopravvivenza fino al 93% con altissima attecchimento del tumore.

Protocollo

Incubazione 1. Egg

1. Ottenere 8 giorni vecchi specifici uova embrionate esenti da organismi patogeni.
2. Mettere le uova in rotazione vassoio dell'uovo, estremità stampati rivolti verso l'alto, e posizionare il vassoio rotante all'interno di un incubatore uovo. Incubare le uova per 48 ore a 36 ° C e 50% di umidità.

2. Far cadere il CAM e apertura le uova

1. Raccogliere le uova da incubatrice. Luogo uova in portauova, timbrato rivolta verso l'alto, e portare alla cappa a flusso laminare.
2. Spegnere le luci in camera e il cappuccio.
3. Tenere l'estremità stampata di uovo leggermente al candler uovo per esporre la vascolarizzazione del CAM nonché il sacco aereo.
   NOTA: Il Candler uovo è una fonte di luce usato per visualizzare l'embrione in via di sviluppo e sacco aereo associati e vascolare.
4. Mettere un segno di matita tra due grandi vasi sanguigni.
5. Accendere le luci e utilizzare una puntina sterile per ottenere un foro sulla punta dell'uovo sopra il sacco aereo (fine stampati) e un foro al pemark ncil. Non spingere la puntina tutto il percorso attraverso; un foro di circa 3 mm di profondità è generalmente sufficiente.
6. Spegnere le luci. Stringere la lampadina di sicurezza, premendo con forza l'estremità aperta contro il buco sopra la sacca d'aria. Applicare il vuoto per tirare l'aria nel foro in corrispondenza del segno di matita, causando il CAM a cadere lontano dal serbatoio in segno di matita.
7. Controllare che il sacco d'aria si è spostato dalla fine timbrata del uovo al foro matita marcata con il candler. Se non lo ha, utilizzare il bottone per fare entrambi i fori leggermente più profondo e poi ri-applicare il vuoto con la lampadina di sicurezza.
8. Accendere le luci. Tenendo l'uovo in una mano, accendere lo strumento rotativo Dremel con una ruota di taglio 15/16 pollici attaccato e fare due tagli trasversali solo abbastanza in profondità per tagliare attraverso il guscio, ma non abbastanza in profondità per tagliare tutta la strada fino al depresso CAM. Fare i tagli intorno a 2 cm di lunghezza e 1 cm di distanza l'uno dall'altro. Fare i tagli sufficientemente ampia in modo che un anello di silicone 1 cm di diametro può passare attraversoma più sottile rispetto alla larghezza del nastro adesivo standard.
9. Successivamente, fare 1 taglio longitudinale e tra le estremità dei due tagli trasversali toccando leggermente il disco di taglio per il guscio.
10. Far scorrere pinza sterile sotto il pezzo di guscio e parallelamente alla shell. Prendete il pezzo shell con le pinze e rimuovere l'intero pezzo in modo pulito.
11. Posizionare lo scotch sopra la finestra appena aperta, facendo attenzione a piegare una estremità su se stesso per facilità di rimozione.
12. Luogo uova indietro in incubatrice nel vassoio uovo (non nei rack uovo rotanti) fino al momento dell'inoculazione.

3. Inoculazione

1. Mantenere seminterrato miscela proteina di membrana, quali matrigel, in ghiaccio (per prevenire la polimerizzazione) e posto in cappuccio.
2. Utilizzare 2 mM EDTA per staccare le cellule (4 - 5 ml per pallone T75) e posto fiasche nel tessuto cultura incubatore per 5 min.
3. Risospendere le cellule staccate nei media e contare con un emocitometro e trypan blu. Utilizzare tra 500.000 t2.000.000 o celle per l'innesto sulla CAM, seconda linea cellulare. Ottimizzare il numero corretto di esperimenti preliminari.
4. Volume di misura necessaria per numero di cella appropriata e centrifugare a 500 xg per 5 min.
5. Gettare il surnatante e poi risospendere pellet cellulare in 40 μ l di PBS ++ e 20 μ l di miscela membrana basale.
   NOTA: A questo punto, le cellule possono essere trattati con farmaci o altri agenti di test come necessario per esperimenti risospendendo nella cellula / seminterrato sospensione miscela membrana. In alternativa, gli agenti possono essere pipettati sul cellulare / seminterrato sospensione miscela membrana dopo l'innesto.
6. Recupera portauova con le uova dal termostato e posto nella cappa a flusso laminare.
7. Staccare il nastro della finestra, recuperare un anello di silicone 1 mm dal tappo di una fiala criogenico con pinze sterili, e rilasciare l'anello attraverso la finestra.
8. Preparare la soluzione di cellule l 60 μ di PBS ++ e membrana basale Mixture direttamente al centro del cilindro di silicone appoggiato sul CAM.
9. Re-tape finestra e spostare portauova torna incubatrice. A questo punto, fare attenzione quando si spostano le uova, come l'anello e la sospensione cellulare può facilmente diventare sfollati.
10. Lasciare i tumori a crescere per 5 a 7 giorni.

4. raccolta tumori

1. Mettere sotto-pad in cappuccio. Preparare 35 x 10 mm piatti e contenitori paraformaldeide come necessario per l'istologia. Mettere 1 ml di PBS ++ in ogni piatto mm 35 x 10.
2. Mettere sacchetto in cappa. Prendete le forbici dissezione sterili e inserire l'estremità appuntita nell'uovo al foro vicino alla fine timbrato.
3. Tagliare tutto l'uovo intero longitudinalmente.
   NOTA: il CAM e il tumore con l'anello dovrebbero attenersi per la metà superiore del guscio con la finestra.
4. Utilizzando forbici dissezione e pinze, sezionare il tumore dal CAM e posizionare tumore nel piatto mm 35 x 10. Misurare e pesare i tumori. Tumori fissi in paraformaldehyli de e poi paraffina incorporare per l'uso in istologia ed immunoistochimica esperimenti.

5. (Facoltativo): Tumore delle cellule Dissociazione

1. Usare le forbici dissezione per tritare il tumore nel piatto mm 35 x 10. Versare tumore tritati in una provetta da centrifuga da 15 ml e rimuovere quanto più PBS ++ possibile attraverso pipettaggio.
2. Aggiungere 2 ml di collagenasi (1 mg / ml in PBS ++), girare il tubo più volte, e incubare tubo a 37 ° C per almeno 30 min (fino a diverse ore).
3. Aggiungere 5 ml media per ciascuna provetta e sospendere nuovamente accuratamente pipettando su e giù 20 - 40x. Pipettaggio accurata è fondamentale per la dissociazione cellulare completo.
4. Lasciare sedimento di stabilirsi, e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti. Rimuovere il surnatante, lasciando dietro di pellet dissociato.
   NOTA: A questo punto, pellet cellulari possono essere utilizzati per vari esperimenti (citofluorimetria, lisi per uso in Western blotting, isolamento dell'RNA, etc). Totale conteggio delle cellule tumorali può essere ottenuta anche utilizzando un emocitometro e trypan colorazione blu. Si noti che, cellule di forma ovale più piccole sono cellule di pollo dal CAM e non devono essere considerati come cellule tumorali. Ci dovrebbe essere un numero minimo di contaminare cellule non tumorali (CAM) se il tumore è sezionato dal CAM accuratamente.

Risultati

Immagini rappresentative di passaggi chiave nel protocollo sono mostrati qui. Figura 1A mostra l'uso del candler di visualizzare l'embrione in via di sviluppo, il sacco aereo, e la vascolarizzazione della CAM. Figura 1B-1C mostrano il processo di caduta del CAM facendo i due fori e quindi applicando pressione negativa con il bulbo della sicurezza, e la Figura 1D mostra una cancellati correttamente CAM con una bolla d'aria sotto il foro matit...

Discussione

Diversi passaggi chiave di questo protocollo molto probabilmente rappresentano il miglioramento della sopravvivenza embrionale così come una maggiore affidabilità della crescita tumorale. Lasciando il CAM lontano dal serbatoio applicando aspirazione al sacco aereo è meno invasivo rispetto ad altri metodi esistenti (utilizzando un ago per rimuovere l'albumina dall'uovo, smussa, ecc). Utilizzando una puntina sterile per creare due piccoli fori necessari per questo metodo è la parte più impegnativa del protoco...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Premium incubated eggs	Charles River	N/A	http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx
Egg incubators	GQF	Hova-Bator 2362N
Rotating egg trays	GQF	1611 Automatic Egg Turner
Egg candler	Lyon	Hi-Power 950-070
Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel	Dremel	100-N/7
Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape
Matrigel	BD Biosciences	356234
Cryogenic vials, external thread with silicone washer	Corning	430659
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C9891