JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

Abstract

وتاكروليموس الكالسينيورين المانع هو حجر الزاوية في معظم بروتوكولات العلاج المثبطة للمناعة بعد زرع الأعضاء الصلبة في الولايات المتحدة. تاكروليماس هو ضيق مؤشر المخدرات العلاجية ومثل يتطلب مراقبة الأدوية العلاجية وتعديل الجرعة بناء على تركيزات كلها في الحوض الصغير الدم. لتسهيل المخدرات العلاجية الداخل ومراقبة الالتزام، وجمع من بقع الدم المجفف هو مفهوم جذابا. بعد عصا إصبع، والمريض بجمع قطرة دم على ورق الترشيح في المنزل. بعد تجفيفها الدم، وإرساله إلى المختبر التحليلي حيث كميا تاكروليماس باستخدام السائل عالي الأداء اللوني، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (HPLC-MS / MS) في توليفة مع يدوية بسيطة من البروتين هطول خطوة واستخراج العمود الانترنت.

لتحليل تاكروليماس، واللكم 6 ملم القرص من مركز المشبعة من بقعة الدم. والمتجانس بقعة الدم باستخدام رصاصة خلاط لالثانية ثم يتم عجلت البروتينات مع الميثانول / 0.2 M ZnSO 4 التي تحتوي على مستوى D الداخلي 2، 13 C-تاكروليماس. بعد vortexing لوالطرد المركزي، ويتم حقن 100 ميكرولتر من طاف في عمود استخراج الانترنت وغسلها مع 5 مل / دقيقة 0.1 الفورميك حمض / الأسيتونتريل (7: 3، ت: ت) لمدة 1 دقيقة. الآخرة، يتم تنشيط صمام التحويل وتحليلها يتم مسح الظهر على العمود التحليلي (وفصلها باستخدام 0.1٪ حمض الفورميك / الأسيتونتريل التدرج). وكميا تاكروليماس في وضع إيجابي متعدد رد فعل (MRM) باستخدام مطياف الكتلة جنبا إلى جنب.

فحص خطي 1-50 نانوغرام / مل. التباين بين فحص (3.6٪ -6.1٪) والدقة (91.7٪ -101.6٪) وفقا لتقييم أكثر من 20 أيام تلبية معايير القبول. متوسط ​​الانتعاش الاستخراج 95.5٪. لا توجد صلة المرحل، التدخلات المصفوفة والآثار المصفوفة. تاكروليماس مستقر في بقع الدم الجافة في RT وفي +4 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع. العينات المستخرجة فيالاوتوماتيكى مستقرة في +4 درجة مئوية لمدة 72 ساعة على الأقل.

Introduction

تاكروليماس هو immonosuppressant قوية 7/1 التي لديها بنية ماكروليد 8 (الشكل 1). نظرا لرابطة الدول المستقلة - تصاوغ العابر للسندات CN أنها تشكل اثنين rotamers في حل 9 التي يمكن أن تكون مفصولة مرحلة عكس الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) التاكروليموس هو محبة للدهون وقابل للذوبان في الكحول (الميثانول: 653 غرام / لتر، والإيثانول: 355 ز / L)، والهيدروكربونات الهالوجينية (كلوروفورم: 573 غرام / لتر) والأثير. وهو قابل للذوبان لماما في الهيدروكربونات الأليفاتية (الهكسان: 0.1 جرام / لتر والمياه (درجة الحموضة 3: 0.0047 جم / L) 9 لا يحتوي جزيء أي حامل اللون والحد الأقصى للأشعة فوق البنفسجية امتصاصه هو 192 نانومتر التاكروليموس الأعمال عن طريق تثبيط الكالسينيورين. وقد تم استعراض آلية العمل في المراجع 10،11. ويستخدم حاليا في أكثر من 80٪ من مرضى زرع الأعضاء الصلبة، في الولايات المتحدة 12.

المؤشر العلاجي للتاكروليماس هو considereد أن يكون ضيقا 13. وبالإضافة إلى ذلك، فإن العلاقة بين الجرعات تاكروليماس وتركيزات الدم ضعيف والدوائية هو متغير 14،15. مراقبة الأدوية العلاجية لتوجيه تاكروليماس الجرعات في مرضى زرع هو الممارسة السريرية ولالعامة 16-20. الهدف هو الحفاظ على تركيزات تاكروليماس الدم ضمن نطاق العلاجية المحددة مسبقا. تركيزات تاكروليماس الدم أقل من المستوى العلاجي قد يؤدي إلى زيادة نشاط التفاعلات ألو المناعة المزمنة أو الحادة، بينما تركيزات أعلى من النافذة العلاجية تزيد من خطر الإفراط في كبت المناعة والسرطان والسميات، مثل الكلوي، العصبية، ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري. عالية التباين داخل الفرد الدوائية التاكروليموس قد يكون ضارا لكلا زرع الأعضاء وبقاء المريض 21،22. في حين تقلب بين الفردية الدوائية تاكروليماس تسببه أساسا الأشكال CYP3A5، أسباب داخل الفردتقلب تشمل، ولكنها لا تقتصر على، المخدرات المخدرات، والمرض للعقاقير والمخدرات التفاعلات الغذاء 14،15. تفتقر أيضا الانضمام إلى مناعة العلاجية نظام المخدرات هو أحد العوامل المساهمة والسبب الرئيسي لفقدان الكسب غير المشروع 23،24.

وتشير هذه الاعتبارات أن المخدرات العلاجية المنزل المتكرر ومراقبة التزام تاكروليماس تركيزات الدم كله قد يكون مفيدا للتأكد من أن المرضى الذين لديهم التعرض تاكروليماس ضمن إطار العلاجي المطلوب في جميع الأوقات. ومع ذلك، والخدمات اللوجستية وتكلفة أكثر تواترا مراقبة الأدوية العلاجية كما هو الممارسة السريرية الحالية 15 باهظة. أحد الأسباب هو أن المريض لديه لمعرفة فصاد أن يكون عينة من الدم الوريدي المطلوب استخلاصها. وقد ظهرت مؤخرا بقع الدم الجافة كمفهوم جذابة 25-28. بعد إصبع بسيطة عصا المريض بجمع قطرة دم على ورقة ورقة فلتر خاصة وبعد أن د بقعة الدمرييد، فإنه يمكن أن ترسل إلى المختبر المركزي لتحليل تاكروليماس وأي مناعة أخرى أن المريض قد تكون آخذة في الوقت الراهن. وقد أصبح هذا ممكنا بفضل تطور فحوصات LC-MS / MS حساسة للغاية ومحددة لتقدير حجم تاكروليماس ومناعة أخرى في حجم الدموية الصغيرة جدا مثل بقع الدم المجفف (عادة 20 ميكرولتر من الدم) 25،29-43. ميزة أخرى هي أنه، استراتيجيات جمع الغازية الحد الأدنى منخفضة عينة حجم مثل بقع الدم المجفف يسهل إلى حد كبير مراقبة الأدوية العلاجية والدراسات الدوائية في الأطفال الصغار 28.

وعادة ما تقاس تاكروليماس في EDTA وريدي كله الدم 15. الأسباب التي تاكروليماس يوزع على نطاق واسع في خلايا الدم وأن الدراسات السريرية وأفادت علاقة أفضل بين تركيزات تاكروليماس الحوض الصغير في الدم من البلازما في الأحداث السريرية 15،18. في المقارنة، وتحليل تاويستند crolimus في بقع الدم المجفف على الدم الشعرية التي يختلط مع مصفوفة ورق الترشيح. هذه تحديات من حيث الإذابة التاكروليموس والتدخلات المحتملة مع تحليل LC-MS / MS. هنا نقدم مقايسة إنشاء والتحقق من صحتها على أساس تجانس بقعة الدم المجفف باستخدام خلاط رصاصة في توليفة مع ارتفاع تدفق عينة العمود الانترنت تنظيف الداخلي وتحليل LC-MS / MS. اعتبارا من اليوم، وقد تم بنجاح استخدام هذا الاختبار لتقدير حجم أكثر من خمسة آلاف تاكروليماس المجففة عينات بقعة الدم لرصد الالتزام في التجارب السريرية.

Protocol

وحددت دي عينات الدم من أشخاص أصحاء من مستشفى جامعة كولورادو (أورورا، كولورادو). واعتبر استخدام الدم عينات البنك التي تم تحديدها دي للدراسات المصادقة وكذلك لإعداد معايرة وعينات مراقبة الجودة "معفاة" من قبل مجلس كولورادو متعدد المؤسسي مراجعة (COMIRB، أورورا، كولورادو).

1. إعداد المراجع وحلول

  1. تاكروليماس الشراء ومستوى داخلي D 2، 13 C-تاكروليموس من الموردين المدرجين في قائمة المواد.
    1. إعداد الحلول الأسهم في الميثانول النقي بتركيز 1 ملغ / مل لتاكروليماس وتركيز 10 ميكروغرام / مل لD 2، 13 C-تاكروليماس. جعل الحلول الأسهم من المواد المرجعية على أساس ثلاثة أوزان مستقلة. قسامة حلول الأسهم وتخزينها في -70 درجة مئوية أو أقل.
  2. يعد حل لترسيب البروتيناتواستخراج تاكروليماس باستخدام الميثانول / 0.2 M ZnSO 4 في الماء (7: 3، ت: ت). يحتوي هذا الحل أيضا معيار D الداخلي 2، 13 C-تاكروليماس بتركيز 2.5 نانوغرام / مل، ويستخدم لاستخراج جميع العينات إلا لاستخراج عينات فارغة (انظر 1.3.3).
    1. يعد هذا البروتين هطول حل حديثا في كل يوم الاستخراج وتعيين انتهاء صلاحية حل في 12 ساعة.
  3. إعداد منحنى المعايرة ومراقبة الجودة عينات (QC)
    1. إعداد الحلول الأسهم التاكروليموس عن طريق إجراء التخفيفات المناسبة من المحلول باستخدام الميثانول النقي.
    2. لإعداد معايرة وعينات مراقبة الجودة، وارتفاع 20 ميكرولتر من محلول المخزون مخففة بشكل مناسب في EDTA الدم كله، في احتضان 37 درجة مئوية تحت لطيف تهتز في حمام مائي للسماح للتوزيع متجانس من تاكروليماس في مكونات الدم الخلوية لمدة 20 دقيقة وقسامة إلى 1.5 مل سليلةأنابيب ropylene مع قاع مخروطي والمفاجئة على الجفن. تأكد من أن الحجم النسبي من المذيبات العضوية لا تتجاوز 5٪.
    3. بقعة 50 ميكرولتر من الدم الكامل ارتفعت في منتصف كل دائرة على بطاقات تصفية باستخدام ماصة.
    4. تجفيف بقع الدم على بطاقات مرشح في RT لمدة 3 ساعة.
    5. إعداد معايير تاكروليماس المعايرة في EDTA البشري الدم الكامل بتركيزات تاكروليماس 1، 2.5، 5، 10، 25، و 50 نانوغرام / مل. إعداد نموذج فارغ لاستخراج مثل معايير المعايرة مع البروتين هطول محلول يحتوي على مستوى D الداخلي 2، 13 C-تاكروليماس ("صفر عينة").
    6. تحضير عينات QC في EDTA البشري الدم كله في تركيزات 0، 2، 4، 20، 40 نانوغرام / مل. إعداد نموذج فارغ. وعلى النقيض من عينات QC التي تستخرج مع هطول الأمطار التي تحتوي على مستوى D الداخلي 2، 13 C-تاكروليماس، استخراج هذه العينة فارغة مع البروتين هطول الحل الذي يفعللا يحتوي على مستوى D الداخلي 2، 13 C-تاكروليماس ("نموذج فارغ").
  4. جمع العينات السريرية
    1. جمع البقع الدموية المجففة كما هو موضح في 43،44.

2. استخراج التاكروليموس المجفف بقعة عينات الدم

  1. تفقد البصر بقعة الدم المجففة لضمان مقبول نوعية العينة وحجم 45.
  2. مركز لكمة من بقعة الدم على بطاقة التصفية مع 6 ملم ثقب كمة.
    ملاحظة: يمكن رصد جودة من اللكمات من قبل وزنها. A كمات المشبعة القرص مرشح يزن في المتوسط ​​5.02 ملغ ± 0.09 ملغ (المدى: 4.83- 5.14 ملغ، ن = 12).
  3. أقراص المكان إلى 1.5 مل أنابيب البولي بروبلين ذات القاع المخروطي والأغطية الإضافية على.
  4. إضافة 20-30 الرصاص إلى كل أنبوب.
  5. إضافة 500 ميكرولتر من البروتين هطول الحل (الميثانول: 0.2 M ZnSO 4، 7: 3، والخامس: الخامس مع 2.5 نانوغرام / مل معيار الداخلية) في كل أنبوب. لEXTRعمل عينات فارغة، واستخدام البروتين هطول حل دون المعيار الداخلي.
  6. التجانس الأقراص في الخلاط رصاصة لمدة 1 دقيقة (السرعة القصوى، ووضع "10").
  7. هزة عينات في RT على التعددية أنبوب دوامة (السرعة القصوى، ووضع "10") لمدة 10 دقيقة.
  8. عينات الطرد المركزي في 16000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  9. نقل supernatants في قوارير الزجاج HPLC مجهزة إدراج 300 ميكرولتر. استخدام ما قبل شق الأختام تفلون.
    قد يتم تخزين العينات المستخرجة في -20 درجة مئوية أو أقل حتى تحليل LC-MS / MS: مذكرة.

3. LC-MS / MS تحليل

  1. تحميل 100 ميكرولتر من طاف من العينة المستخرجة على العمود استخراج خرطوشة C8، ويغسل مع 7: 3 نسبة من حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في الماء: الأسيتونتريل في تدفق 5 مل / دقيقة لمدة 1 دقيقة. وترد اتصالات من صمام التحول في الشكل (2) والتدرج تشغيل بواسطة مضخة الاستخراج في الجدول 1 .
  2. الآخرة، وتفعيل صمام التحويل الناتجة في العودة دافق من التحاليل من قبل العمود على العمود التحليلي.
  3. ضبط ترموستات عمود إلى 65 درجة مئوية.
  4. أزل تحليلها من العمود التحليلي باستخدام معدلات التدفق والتدرج هو مبين في الجدول 1.
  5. ربط العمود التحليلي لمطياف الكتلة جنبا إلى جنب عبر مصدر التأين electrospray توربو. ضبط المعلمات الرئيسية للمطياف الكتلة وفقا للجدول 2.
  6. الكشف عن الأيونات الموجبة ([M + نا] +) في وضع رد الفعل المتعدد (MRM). استخدام التحولات ايون التالية لتقدير: تاكروليماس: م / ض (الكتلة / تهمة) = 826.6 616.2 → وD 2، 13 C-تاكروليماس: م / ض = 829.6 → 619.2.
    ملاحظة: إجمالي وقت التشغيل هو 4.6 دقيقة.

4. الكمي

  1. لكل شوط، وتوليد منحنى المعايرة استنادا إلى معايرة أعدت في 1.3.5 وتدرج في كل شوط التحليلي.
    1. إنشاء منحنى المعايرة بالتآمر تركيزات الاسمية مقابل عامل استجابة الحليلة (قمة منطقة [الحليلة] / قمة منطقة [القياسية الداخلي]) باستخدام برنامج مطياف الكتلة.
    2. تناسب معايرة باستخدام نوبة من الدرجة الثانية في تركيبة مع 1 / X الترجيح.
  2. لتاكروليماس الكمية في بقع الدم المجفف دمج تاكروليماس والقمم القياسية الداخلية في الاستشرابية MRM المستخرج. حساب معامل استجابة لتاكروليماس (قمة منطقة [الحليلة] / قمة منطقة [القياسية الداخلي]) ومقارنتها مع منحنى المعايرة باستخدام برنامج قياس الطيف الكتلي.

5. إجراءات التحقق

  1. الحد الأدنى من الكشف (LLOD) والحد الأدنى للالكمي (LLOQ).
    1. النظر في أقل تركيز تاكروليماس مع نسبة الذروة إلى الضوضاء من 4: 1 كحد ادنى للكشف عن (LLOD). تحديد الحد الأدنى للالكمي (LLOQ) كماأقل تركيز من منحنى المعايرة مع دقة تساوي أو أفضل من ± 20٪ الانحراف عن تركيز الاسمي والدقة مساوية أو أفضل من 20٪ (معامل التباين).
  2. داخل والدقة بين يوم وتوضيحات.
    1. اختبار الدقة والإحكام على أربعة مستويات تركيز 2 نانوغرام / مل (QC1)، 4 نانوغرام / مل (QC2)، 20 نانوغرام / مل (QC3) و 40 نانوغرام / مل (QC4).
    2. إعداد العينات QC في كل يوم في التحقق من صحة الإنسان EDTA الدم كله، يجف على ورق الترشيح، واستخراج وتحليل كما هو موضح أعلاه.
    3. تحديد دقة خلال اليوم والدقة مع 6 عينات في مستوى تركيز QC.
    4. تقييم دقة بين يوم والدقة أكثر من 20 يوما. قياس كل مستوى QC مع 4 عينات كل يوم.
    5. تحليل اثنين من منحنيات المعايرة جنبا إلى جنب مع عينات QC في كل يوم.
    6. حساب دقة خلال اليوم باسم٪ من تركيز الاسمية (ست عينات في مستوى تركيز، يرجى الاطلاع 5.2.2). احسبالدقة ulate كما معامل التباين (CV٪).
    7. النظر في دقة خلال اليوم مقبولا إذا ما وقعت في قبول يحد 85٪ إلى 115٪ من تركيز الاسمية. النظر بدقة خلال اليوم مقبولة إذا كانت مساوية أو أفضل من السيرة الذاتية (معامل التباين) من 15٪.
    8. حساب دقة بين يوم والدقة كمتوسط ​​لكل مستوى تركيز QC تحليلها خلال الأيام التحقق من صحة 20.
    9. النظر في متوسط ​​دقة أمور يوما مقبولا إذا ما وقعت في قبول يحد 85٪ إلى 115٪ من تركيز الاسمية. النظر في الدقة بين يوم مقبولة إذا كانت مساوية أو أفضل من السيرة الذاتية (معامل التباين) من 15٪.
  3. استبعاد التدخلات المصفوفة.
    1. لاستبعاد التدخلات التي قد تكون ناجمة عن إشارات مصفوفة وتحليل فارغة بقع الدم المجفف (8 مختلف الأفراد، ويفضل 4 ذكور و 4 إناث).
    2. تفقد البصر الاستشرابية أيون. إذا قمم في الوقت الاحتفاظتم الكشف عن نافذة تاكروليماس، ودمج ومقارنة مناطقهم تحت المنحنى مع تلك القمم تاكروليماس في عينات فارغة ارتفعت مع تاكروليماس في LLOQ. ليس من المفترض مجال قمم في العينات فارغة لتتجاوز 15٪ من تلك التاكروليموس في LLOQ.
  4. أيون قمع / تعزيز أيون.
    1. استخدام بروتوكول ضخ ما بعد العمود كما هو موضح 45 لتقييم أي تشويش محتمل لتعزيز أيون قمع / أيون الناجمة عن مكونات المصفوفة يبلغ حجمه المشترك.
    2. يبث تاكروليماس بتركيز 10 ميكروغرام / مل يذوب في حمض الفورميك بنسبة 0.1٪: الميثانول (30:70، ت / ت) بعد العمود بمعدل 10 ميكرولتر / دقيقة.
      1. توصيل ضخ حقنة عن طريق T-قطعة بين العمود التحليلي ومصدر electrospray من مطياف الكتلة.
      2. رصد كثافة إشارة MS / MS من التحولات MRM لتاكروليماس والمعيار الداخلي (م / ض = 826.6 616.2 → وم / ض = 829.6 → 619.2) بعد حقن المقتطفتيد عينات فارغة (ن = 8 عينات من مختلف الأفراد).
        ملاحظة: في حالة عدم وجود تعزيز أيون قمع / أيون لا ينبغي أن تتأثر الإشارة المستمرة الناجمة عن ضخ تحليلها عن طريق الحقن من المصفوفة فارغة، بينما أيون قمع يؤدي إلى تراجع في إشارة والأيونات تعزيز الذروة.
  5. تحمل أكثر.
    1. تقييم المحتملين المرحل من خلال تحليل عينات المستخرجة فارغة بعد أعلى معايرة (50 نانوغرام / مل، ن = 6).
    2. تفقد البصر الاستشرابية أيون. إذا تم الكشف عن قمم ضمن إطار الوقت الاحتفاظ التاكروليموس ودمج ومقارنة مناطقهم تحت المنحنى مع تلك القمم تاكروليماس في عينات فارغة ارتفعت مع تاكروليماس في LLOQ. ليس من المفترض مجال قمم في العينات فارغة لتتجاوز 15٪ من تلك التاكروليموس في LLOQ.
  6. المبالغ المستردة الاستخراج.
    1. تحديد المبالغ المستردة من خلال مقارنة إشارات من التحاليل بعد استخراج QC سامPLES على جميع المستويات التركيز الأربعة (ن = 6 في التركيز) مع تلك فارغة بقع الدم المجفف ارتفعت مع المبالغ المقابلة من تاكروليماس بعد الاستخراج.
    2. إعداد أربع مجموعات من حلقات الجودة (مستويات تركيز: 2، 4، 20، 40 نانوغرام / مل).
    3. إعداد 4 مجموعات أخرى من المقابلة "الانتعاش اختبار عينات" من خلال الكشف عن 50 ميكرولتر من EDTA فارغة الدم كله على بطاقات ورق الترشيح والتجفيف لمدة 2 ساعة.
    4. الآخرة، لكل من QC وفارغة "عينات الاختبار الانتعاش"، قطع بقعة الدم بالكامل على بطاقة مرشح مع مقص ووضع أقراص الناتجة في أنبوب البولي بروبلين ذات القاع المخروطي والمفاجئة على غطاء.
    5. استخراج جميع العينات.
    6. نقل supernatants (400 ميكرولتر) في قوارير الزجاج HPLC.
    7. إضافة محلول المخزون تاكروليماس إلى بياض "الانتعاش استخراج عينات الاختبار" للوصول إلى تركيزات 2 و 4 و 20 و 40 نانوغرام / مل (4 ميكرولتر من 200، 400، 2000، 4000 نانوغرام / مل الأسهم تاكروليماس سولutions إلى 400 ميكرولتر من طاف).
    8. بعد تحليل LC-MS / MS، مقارنة الإشارات في كل من عينات QC و "التعافي اختبار عينات" للتركيز المقابلة (٪ = عينات إشارة الانتعاش ارتفعت قبل ارتفعت عينات استخراج / إشارة بعد استخراج × 100).
  7. سلامة التخفيف.
    1. ارتفعت إنشاء النزاهة تخفيف باستخدام عينات مع تحليلها في 500 و 250 و 100 نانوغرام / مل.
    2. بعد استخراج، وتمييع العينات باستخدام بروتين هطول الحل (01:10، ن = 3 لكل مستوى التركيز).
    3. حساب الانحرافات عن تركيزات الاسمية. النظر في نتائج التي تقع ضمن 85٪ -115٪ من الاسمية مقبولة.
  8. بثبات.
    1. التحقيق بثبات باستخدام عينات مراقبة الجودة على جميع المستويات التركيز الأربعة (ن = 4 في التركيز) تحليلها في مختلف نقاط وقت وتحت ظروف التخزين المختلفة.
    2. مقارنة النتائج بعد التخزين مع القيم الاسمية. النظر صesults التي تقع ضمن 85٪ -115٪ من الاسمية مقبولة.
    3. تحقيق الاستقرار عينة ل1 أسبوع عند درجة حرارة الغرفة، 1 أسبوع في 4 درجات مئوية، 1 شهر في -20 ° C و 1 شهر في -80 ° C.
    4. اختبار الاستقرار تجميد ذوبان الجليد على مدى ثلاث دورات (-20 ° C). اختبار استخراج عينة والاستقرار الاوتوماتيكى عن طريق وضع العينات في الاوتوماتيكى thermostatted تعديلها ل4 ° C. حقن عينات بعد 72 ساعة.

النتائج

الاستشرابية أيون التمثيلية لعينة فارغة، ارتفعت عينة على الحد الأدنى من تقدير وعينة المرضى في الشكل 3.

منحنيات المعايرة

وكان الحد الأدنى للكشف 0.5 نانوغرام / مل وكان الحد الأد...

Discussion

على الرغم، كما سبق ذكره، فإن مفهوم المخدرات العلاجية ومراقبة التزام تاكروليماس بناء على بقع الدم المجفف جذابة، هناك تحديات التحليلية التي تتجاوز تلك التي ترتبط عادة مع تحليل LC-MS / MS التاكروليموس في EDTA وريدي عينات الدم الكامل. وتشمل هذه، ولكن ليس على سبيل الحصر، أن ال?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
TacrolimusU.S. Pharmacopeial Convention1642802
D2,13C-TacrolimusToronto Research Chemicals Inc.F370002
Red blood cellsUniversity of Colorado HospitalW20091305500 V
PlasmaUniversity of Colorado HospitalW2017130556300Q
Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9%Sigma-Aldrich439126-4 L
Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificA955-4
Isopropanol 99.9%, HPLCFisher ScientificBP2632-4
Methanol Optima LC/MSThermo Fisher ScientificA452-4
Water Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificW6-4
Formic acidThermo Fisher ScientificA118P-500
Phosphate-buffered saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Zinc sulfateThermo Fisher ScientificZ68-500
0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008649
1.5 ml Eppendorf tubeThermo Fisher Scientific02-682-550
10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008651
10 μl pipet tips with filter, sterileNeptuneBT 10XLS3
100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008653
100 μl pipet tips with filter, sterileNeptuneBT 100
1,000 μl pipet tips with filter, sterileMultimax2940
2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008650
2 ml Eppendorf tubeThermo Fisher Scientific02-681-258
20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008652
20 μl pipet tips with filter, sterileGeneMateP-1237-20
200 μl pipet tips with filterMultimax2938T
200 μl pipet tips with filter, sterileMultimax2936J
50 ml Falcon tubeBD Falcon352070
300 μl inserts for HPLC vialsPhenomenexARO-9973-13
Balance PR2002Mettler Toledo1117050723
Balances AX205 Delta RangeMettler Toledo1119343379
Bullet Blender HomogenizerNext AdvanceBBX24
Centrifuge Biofuge FrescoHeraeus290395
Disposable WipesPDIQ55172
Glass v ials, 4 mlThermo Fisher Scientific14-955-334
Glass vials, 20 mlThermo Fisher ScientificB7800-20
Gloves, nitrileTitan Brand Gloves44-100S
HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clearPhenomenexARO- 9921-13
Lids for HPLC vialsPhenomenexARO- 8952-13-B
Needle, 18 G 1.5Precision Glide305196
Rack for Eppendorf tubesThermo Fisher Scientific03-448-11
Rack for HPLC VialsThermo Fisher Scientific05-541-29
Steel beads 0.9 – 2 mmNext AdvanceSSB14B
Storage boxes for freezers / refrigeratorsThermo Fisher Scientific03-395-464
Standard multi-tube vortexerVWR Scientific Products658816-115
Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PKGE Whatman 2016-05
AutosamplerCTC PAL PAL.HTCABIx1
Binary pump, Agilent 1260 InfinityAgilent Technologies1260 G1312B
Binary pump, Agilent 1290 InfinityAgilent Technologies1290 G4220A
Micro vacuum degasser, Agilent 1260Agilent Technologies1260 G13798
Column oven,  Agilent 1290 with 2 position Agilent Technologies1290 G1216C
Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valveAgilent Technologies1290 G1316C
HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mmPhenomenex820950-926
HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mmPhenomenex993967-906
Tandem Mass Spectrometer
API5000 MS/MS with TurboIonspray sourceAB Sciex4364257
Mass spectrometry softwareAB SciexAnalyst 1.5.1

References

  1. Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
  2. Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
  3. Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
  4. . Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
  5. . A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
  6. Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
  7. Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group.. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
  8. Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
  9. Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
  10. Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
  11. Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
  12. Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
  13. Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L., Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. e. b. b. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. , 529-562 (2005).
  14. Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
  15. Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
  16. Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
  17. Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
  18. Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
  19. Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
  20. Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
  21. Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10 (6), 712-720 (2006).
  22. Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
  23. Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
  24. Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
  25. Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
  26. Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
  27. Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
  28. Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
  29. Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
  30. Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
  31. Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
  32. Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
  33. Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
  34. Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
  35. Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
  36. Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
  37. Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
  38. Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
  39. Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
  40. Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
  41. Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
  42. Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
  43. Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
  44. Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
  45. Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
  46. Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
  47. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

105 LC MS MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved