JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

Özet

Kalsineurin inhibitörü takrolimus ABD'de solid organ naklinden sonra en immunosupresif tedavi protokollerinin temel taşıdır. Takrolimus dar bir terapötik indeks ilaçtır ve gibi tedavi amaçlı ilaç izleme ve tam kan çukur konsantrasyonları dayalı doz ayarlaması gerektirir. Ev tedavi ilaç ve bağlılık izlenmesini kolaylaştırmak için, kurutulmuş kan lekeleri koleksiyonu cazip bir kavramdır. Bir parmak sopa sonra hasta evde filtre kağıdı üzerinde bir kan damlası toplar. Kan, kurutuldu sonra, takrolimus, yüksek performanslı sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi kullanılarak ölçülür analiz laboratuvarına gönderilecek (HPLC-MS / MS), basit bir el kitabı, protein çökeltme adımında online kolon ekstraksiyon ile kombinasyon halinde.

Takrolimus analizi için, 6 mm'lik bir disk kan nokta doymuş merkezi kesilerek çıkarılır. Kan nokta bir kurşun blender a kullanılarak homojenize edilirnd sonra proteinler metanol / 0.2 M ZnSO 4 internal standart D 2, 13 C-takrolimus içeren çöktürülür. Vorteks ve santrifüj edilmesinden sonra, yüzer 100 ul bir online ayırma kolonuna enjekte edilir ve 5 ml / 0.1 formik asit / asetonitril dakika ile yıkandı (7: 3, hacim: hacim) 1 için min. Bundan sonra, sviçleme valfi harekete analitleri analitik kolona geri temizlendi (ve% 0.1 formik asit / asetonitril gradyanı kullanılarak ayrılmıştır) vardır. Takrolimus, tandem kütle spektrometresi kullanılarak pozitif çoklu reaksiyon modu (MRM) ölçülür.

Deney 1 ila 50 ng / ml ile doğrusaldır. Olarak 20 gün içinde değerlendirilen Inter-tahlil değişkenliği (% 3.6 -6.1%) ve doğruluk (% 91.7 -101,6%) kabul kriterlerini karşılayan. Ortalama çıkarma kurtarma 95.5% 'dir. Carry-over, matris müdahaleler ve matriks etkileri ilgili hiçbir bulunmamaktadır. Takrolimus, oda sıcaklığında ve 1 hafta boyunca 4 ° C de kurutulur, kan lekeleri stabildir. Ayıklanan örneklerotomatik numune alma cihazı, en az 72 saat süre ile 4 ° C'de stabildir.

Giriş

Takrolimus makrolid yapısına 8, bir (Şekil 1) güçlü bir immonosuppressant 1-7. 653 g / L, etanol: - cis nedeniyle CN bağların trans izomerizm de ters fazlı yüksek-performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılabilmektedir çözelti 9 iki rotamerden oluşturur (HPLC) Takrolimus alkoller (metanol, lipofilik ve çözünür olan 355 g / L), halojenlenmiş hidrokarbonlar (kloroform: 573 g / L) ve eter. . 0.1 g / L ve su (pH 3: Bu alifatik hidrokarbonların (heksan içinde yavaş yavaş çözülür. Molekülü herhangi bir kromoforu ve UV-emme fazla içermez 9 0.0047 g / L) kalsinörinin önlenmesi ile 192 nm Takrolimus davranır . Etki mekanizması referanslar 10,11 gözden geçirilmiştir. Şu anda Amerika Birleşik Devletleri'nde 12 katı organ nakli hastalarının% 80'inden fazlasında kullanılmaktadır.

Takrolimusun terapötik indeksi olan considered 13 dar olması. Buna ek olarak, takrolimus dozu ve kan konsantrasyonları arasındaki ilişki zayıf ve farmakokinetik 14,15 değişkendir. Transplant hastalarında takrolimus dozu rehberlik Terapötik ilaç izleme, bu nedenle genel klinik pratikte 16-20 olduğunu. Hedef, bir önceden belirlenmiş terapötik aralıkta takrolimus kan konsantrasyonlarını tutmaktır. Terapötik pencere üzerindeki konsantrasyonlar aşırı bağışıklık bastırma, kanser ve nefrotoksisite, nörotoksisite, hipertansiyon ve diyabet gibi toksisite için riskini arttırdığı da terapötik aralığının altında Takrolimus kan konsantrasyonları, kronik veya akut allo-bağışıklık reaksiyonlarının aktivitesinde artış ile sonuçlanabilir. Takrolimus Yüksek farmakokinetik içi bireysel değişkenlik nakli ve organ hasta sağkalımı 21,22 hem zararlı olabilir. Takrolimus farmakokinetik bireylerarası yüksek değişkenlik esas olarak CYP3A5 polimorfizmleri, içi birey için nedenlerden kaynaklanan ikendeğişkenliği arasında, ancak, ilaç-ilaç, hastalığa ilaç ve besin ile-ilaç etkileşimleri 14,15 bunlarla sınırlı değildir. Ayrıca immünosupressif terapötik ilaç rejimine bağlılık eksikliği katkıda bulunan bir faktör ve greft kaybı 23,24 için önemli bir nedenidir.

Bu düşünceler sık ​​sık ev terapötik ilaç ve takrolimus tam kan konsantrasyonlarının izlenmesi bağlılık hastalar her zaman istenen terapötik pencere içindeki takrolimus maruziyetini sahip olmasını sağlamak için yararlı olabileceğini düşündürmektedir. Ancak, şu anki klinik uygulama 15 engelleyici lojistik ve daha sık terapötik ilaç izleme maliyeti olarak. Bunun nedenlerinden biri hasta flebotomist çizilmiş gereken venöz kan örneği var görmek olmasıdır. Kurutulmuş kan lekeleri son zamanlarda cazip bir kavram 25-28 olarak ortaya çıkmıştır. Hastayı sopa basit bir parmağı sonra özel bir filtre kağıdı kartında ve kan nokta d sonra bir kan damlası toplarried, bu takrolimus analizi ve hasta şu anda çekici olabilir diğer herhangi bir immünosupresan için merkezi laboratuara gönderilecek edilebilir. Bu, kurutuldu kan lekeleri (kan, tipik olarak 20 ul) 25,29-43 olarak, çok küçük kan hacminde takrolimus ve diğer bağışıklık bastırıcı maddelerin miktar tayini için son derece hassas ve spesifik LC-MS / MS testlerin geliştirilmesi mümkün hale gelmiştir. Diğer bir avantajı gibi kurutulmuş kan lekeleri gibi minimal invaziv, düşük hacimli numune toplama stratejileri büyük ölçüde küçük çocukların 28 terapötik ilaç izleme ve farmakokinetik çalışmaları kolaylaştırmak olduğunu.

Takrolimus, genellikle venöz EDTA tam kan 15 ölçülür. Nedenleri takrolimus yoğun kan hücrelerine dağıtır ve klinik çalışmalar klinik olayların 15,18 ile plazmada daha kanda takrolimus çukur konsantrasyonları arasında iyi korelasyon bildirmişlerdir vardır. Buna karşılık, ta analizikurutuldu kan lekelerinde crolimus filtre kağıdı matris ile karıştırılır ve kılcal kan dayanır. Bu LC-MS / MS analizi ile takrolimus ve potansiyel etkileşimler çözünürleştirme bakımından zorlukları sunmamaktadır. Burada yüksek akış çevrimiçi kolon numunesi temizlemek usul ve LC-MS / MS analizi ile birlikte bir mermi blender kullanılarak kurutulmuş kan spot homojenizasyon dayalı kurulu ve onaylanmış test sunuyoruz. Bugün itibariyle, bu deney başarılı klinik çalışmalarda bağlılık izlenmesi için beş binden fazla takrolimus kurutulmuş kan nokta örneklerinin ölçümü için kullanılır olmuştur.

Protokol

Sağlıklı bireylerden de tanımlanan kan örnekleri Colorado Hastanesi University (Aurora, Colorado) satın alındı. Validasyon çalışmalarına yanı sıra kalibratör ve kalite kontrol örneklerinin hazırlanması için de tanımlanan kan bankası örneklerinin kullanılması Colorado Çok kurumsal Değerlendirme Kurulu (COMIRB, Aurora) tarafından "muaf" olarak kabul edildi.

Kaynaklar ve Çözümleri 1. Hazırlık

  1. Satınalma takrolimus ve iç standart D 2, Malzeme Listesi'nde belirtilen satıcılardan 13C-takrolimus.
    1. Takrolimus için 1 mg / ml'lik bir konsantrasyonda ve D 2 10 ug / ml, 13 C-takrolimusun bir konsantrasyonda saf metanol içinde stok çözelti hazırlayın. Üç bağımsız ağırlıkları dayalı referans malzemelerin stok çözümleri olun. Kısım stok çözeltileri ve mağaza -70 ° C veya altında.
  2. Proteinlerini çökeltmek için çözeltisi hazırlayın(: 3 h: 7 hacim) ve su içinde metanol / 0,2 M ZnSO 4 kullanılarak takrolimus ekstrakte edin. Bu çözüm aynı zamanda, iç standart D 2, 2.5 ng / ml arasında bir konsantrasyonda 13 C-takrolimus ihtiva eder ve boş numune ekstre haricinde tüm örnekler, (1.3.3 bakınız) bir çıkarma işlemi için kullanılmıştır.
    1. Her çıkarma gününde taze bu proteinin yağış çözüm hazırlayın ve 12 saatte çözümün bitiminden ayarlayın.
  3. Kalibrasyon eğrisi ve kalite kontrol (QC) numuneleri hazırlanması
    1. Saf metanol kullanılarak stok çözeltisinin uygun seyreltiler gerçekleştirerek takrolimusun stok çözelti hazırlayın.
    2. , Kalibratörler ve kalite kontrol örnekleri hazırlamak EDTA tam kana uygun şekilde seyreltilmiş stok çözeltisi 20 ul başak için, 20 dakika karıştırıldı ve kısım için hücresel kan bileşenlerine takrolimusun homojen bir dağılım sağlamak için bir su banyosu içinde nazik çalkalama altında 37 ° C'de inkübe 1.5 ml polip içinekonik dipli ropylene tüpler ve geçmeli kapaklar. Organik çözücünün nispi hacmi 5% aşmamaktadır emin olun.
    3. Nokta bir pipet kullanarak filtre kartlarında her dairenin ortasına çivili tam kan 50 ul.
    4. 3 saat boyunca oda sıcaklığında filtre kartları kan lekeleri kurutun.
    5. 1, 2.5, 5, 10, 25 ve 50 ng / ml takrolimus konsantrasyonlarında insan EDTA tam kandaki takrolimus kalibrasyon standartları hazırlayın. Iç standart D 2, 13 C-takrolimusu ("sıfır örnek") içeren protein yağış çözelti ile kalibrasyon standartları gibi çıkarılması için boş bir örneği hazırlayın.
    6. 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml konsantrasyonlarda insan EDTA tam kandaki QC örnekleri hazırlanır. Boş bir örnek hazırlayın. İç standart D 2 ihtiva eden çökeltme ile ekstre edilmiştir QC örneklerinin aksine, 13 C-takrolimus yapar protein çökeltme çözeltisi ile boş bir numunesi alıriç standart D 2, 13 C-takrolimusu ("boş örneği") içermez.
  4. Klinik örneklerin toplanması
    1. 43,44 açıklandığı gibi kurutulmuş kan lekeleri toplayın.

2. Tacrolimus Ekstraksiyon Kurutulmuş Kan Noktası Örnekleri

  1. Görme kabul edilebilir örnek kalitesini ve hacmini 45 sağlamak için kurutulmuş kan nokta kontrol edin.
  2. 6 mm delik yumruk ile filtre kartındaki kan spot Punch merkezi.
    Not: zımbaların kalitesi tartılarak izlenebilir. Bir delikli doymuş filtre diski 0.09 mg (: 4.83- 5.14 mg, n = 12 aralık) ortalama ± 5.02 mg ağırlığındadır.
  3. Konik alt ve geçmeli kapaklı, 1.5 ml polipropilen tüpler içine yerleştirin diskler.
  4. Her tüpe 20-30 mermi ekleyin.
  5. Her tüpe (2.5 ng / ml dahili standart v: 0,2 M ZnSO 4, 7: 3, hac metanol) bir protein çökeltme çözeltisinin 500 ul ekle. Extr içinBoş numunelerin eylem iç standart olmadan protein yağış çözümü kullanın.
  6. ("10" ayarı, maksimum hızı) 1 dakika için mermi blender Diskleri homojenize.
  7. 10 dakika boyunca ("10" ayarı, maksimum hızı) çoklu tüp vorteks üzerinde oda sıcaklığında örnekleri çalkalayın.
  8. Santrifüj örnekleri 16.000 x g'de 10 dakika süreyle 4 ° C 'de.
  9. 300 ul eki ile donatılmış cam HPLC şişe içine süpernatantlar aktarın. Ön yarık teflon contaları kullanın.
    Not: Çıkarılan numuneler -20 ° C'de ya da altında LC-MS / MS analizi kadar depolanabilir.

3. LC-MS / MS Analizi

  1. Yük 100 C8 kartuşu ekstraksiyon kolonuna ekstre numunenin süpernatant ul ve 7 ile yıkayın: su içinde% 0.1 formik asit: 3 oranında 5 ml 'lik bir akış hızında asetonitril / dk, 1 dakika boyunca. Sviçleme vana bağlantılar Şekil 2 de gösterilmiştir ve gradyan Tablo 1 'de çekme pompası ile işletilen Rong.
  2. Ahiret, analitik kolona öncesi sütundan Analitlerin geri gömme sonuçlanan anahtarlama valfi etkinleştirin.
  3. 65 ° C kolon termostatı ayarlayın.
  4. Tablo 1 'de gösterilen akış oranları ve gradyanı kullanılarak, analitik sütundan analitlerin Zehir.
  5. Turbo elektrosprey iyonizasyon kaynağı üzerinden tandem kütle spektrometresi analitik sütun bağlayın. Tablo 2'ye göre kütle spektrometresi önemli parametreleri ayarlayın.
  6. Birden çok reaksiyon modu (MRM) pozitif iyonları ([M + Na] +) algılar. Ölçümü için, aşağıdaki iyon geçişler kullanın: takrolimus: m / z (kütle / şarj) = 826.6 616.2 ve D2, 13 C-takrolimus →: m / z = 619.2 → 829.6.
    Not: Toplam çalışma süresi 4.6 dakikadır.

4. sayısallaştırılması

  1. Her bir çalışma için 1.3.5 ve hazırlanan kalibratörler göre bir kalibrasyon eğrisi oluşturmakHer analitik vadede sayılabilir.
    1. Kütle spektrometresi yazılımını kullanarak (Tepe Alanı [analit] / Tepe Alanı [internal standart]) analitin tepki faktörü karşısında, nominal konsantrasyonları çizilerek bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
    2. 1 / X ağırlığı ile bir arada bir ikinci dereceden bir montajı kullanarak kalibratörler monte edin.
  2. Kurumuş kan lekelerinde miktar takrolimus ayıklanır MRM Kromatogramlarda takrolimusu ve iç standart doruklarına entegre. Takrolimus için tepki faktörü (Tepe Alanı [analit] / Tepe Area [internal standart]) hesaplayın ve kütle spektrometresi yazılımını kullanarak kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırın.

5. Doğrulama Prosedürleri

  1. Algılama (LLOD) alt sınırı ve miktar (LLOQ) alt sınırı.
    1. Algılama (LLOD) alt limit olarak 1: 4 bir zirve-gürültü oranı ile en düşük takrolimus konsantrasyonu düşünün. Olarak kantitatif (LLOQ) alt limitini tanımlareşit ya da nominal konsantrasyon ve eşit veya daha iyi% 20 hassasiyet (varyans katsayısı) için ±% 20 sapma daha iyi bir hassasiyetle, kalibrasyon eğrisinin en düşük konsantrasyon.
  2. Içi ve günler arası doğruluk ve kesinliklerini.
    1. 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) ve 40 ng / ml (QC4) dört konsantrasyon seviyelerinde doğruluğu ve hassasiyeti test edin.
    2. Insan EDTA tam kan, her doğrulama gününde QC örnekleri hazırlamak filtre kartları, özü kuru ve yukarıda tarif edildiği gibi analiz edin.
    3. QC konsantrasyon seviyesi başına 6 örnekleri ile gün içi doğruluk ve hassasiyet belirleyin.
    4. 20 gün boyunca günler arası doğruluk ve hassasiyet değerlendirin. 4 örneklerin her gün her QC düzeyini ölçün.
    5. Her gün QC örnekleri ile birlikte iki kalibrasyon eğrileri analiz edin.
    6. Nominal konsantrasyon (% konsantrasyon seviyesi başına altı numune, 5.2.2 bakınız) olarak gün içi doğruluğu hesaplayın. Kireçvaryans (% CV) katsayısı olarak ulate hassas.
    7. Kabul Nominal konsantrasyon% 85 ila% 115 sınırlar içine düşerse gün içi doğruluğu kabul edilebilir düşünün. O% 15 CV (varyans katsayısı) eşit veya daha kabul edilebilir ise gün içi hassasiyet düşünün.
    8. 20 doğrulama gün içinde analiz her QC konsantrasyon seviyesi için ortalama olarak günler arası doğruluk ve hassasiyet hesaplayın.
    9. Kabul Nominal konsantrasyon% 85 ila% 115 sınırlar içine düşerse ortalama arası günlük doğruluğu kabul edilebilir düşünün. O% 15 CV (varyans katsayısı) eşit veya daha kabul edilebilir olmadığını arası günlük hassasiyet düşünün.
  3. Matris müdahalelerden dışlama.
    1. Matris sinyalleri neden olabilir etkileşimler dışlanması için, boş kurutulmuş kan lekeleri (8 farklı bireyler, tercihen 4 erkek ve 4 kadın) analiz.
    2. Görme iyon kromatogramlar kontrol edin. Eğer tutma süresi olan tepe değeritakrolimus pencere LLOQ de takrolimusla çivili entegre ve boş örneklerinde takrolimus zirveleri olanlar ile eğrinin altında kalan alanlarını karşılaştırmak, tespit edilir. Boş örneklerinde piklerin alanı LLOQ de takrolimus olanların% 15'ini gerekiyordu değildir.
  4. İyon bastırma / iyon geliştirme.
    1. Ko salınımlı matris bileşenleri nedeniyle iyon bastırma / iyon artışının potansiyel bir girişimi değerlendirmek için 45 anlatıldığı gibi bir post-kolon infüzyon protokolü kullanın.
    2. % 0.1 formik asit içinde çözülmüş 10 mg / ml arasında bir konsantrasyonda, takrolimusu infüze: metanol (30:70, v / v) sütun sonrası 10 ul / dk'lık bir hızda doldurulur.
      1. Analitik kolon ve elektrosprey kütle spektrometresi kaynağı arasında T parçası ile bir şırınga pompası bağlayın.
      2. Takrolimus için MRM geçişleri MS / MS sinyal yoğunluğu Monitör ve iç standart (m / z = 616.2 m / z = 829,6 → 619,2 → 826,6) Extrac enjeksiyonundan sonrated boş örnekleri (n = farklı bireylerden 8 örnek).
        Not: İyon-bastırma-sinyali ve iyon geliştirme bir zirve bir daldırma neden olurken iyon bastırılması / iyon geliştirme yokluğunda analitlerin infüzyon neden olduğu, sürekli sinyal boş matris enjeksiyonu ile etkilenmemelidir.
  5. Devam etmek.
    1. En yüksek kalibratörlerinin sonra boş örnekleri ekstre analiz ederek olası carry-over değerlendirin (50 ng / ml, n = 6).
    2. Görme iyon kromatogramlar kontrol edin. Takrolimusun tutulma süresi penceresi içinde doruklarına tespit edilirse, LLOQ de takrolimusla çivili entegre ve boş örneklerinde takrolimus zirveleri olanlar ile eğrinin altında alanlarını karşılaştırır. Boş örneklerinde piklerin alanı LLOQ de takrolimus olanların% 15'ini gerekiyordu değildir.
  6. Ekstraksiyon kazanımları.
    1. QC sam çıkarıldığı sonra Analitlerin sinyalleri karşılaştırarak geri kazanımlar belirlemeples boş kurutulmuş kan lekeleri olanlar ile dört konsantrasyon seviyeleri (n = konsantrasyon başına 6) de ekstraksiyonu sonrası takrolimusun gelen miktarda çivili.
    2. QCS dört set (: 2, 4, 20, 40 ng / ml konsantrasyon seviyelerini) hazırlayın.
    3. Filtre kağıdı kartları üzerine boş olarak EDTA tam kan 50 ul tespit ve 2 saat süre ile kurutulması "bir geri kazanım test örnekleri" karşılık gelen bir 4 setleri hazırlayın.
    4. Bundan sonra, QC ve boş "Kurtarma test örnekleri" hem makasla filtre kartında tüm kan nokta kesip konik alt ve geçmeli kapaklı bir polipropilen tüp içine sonuçlanan diskleri yerleştirin.
    5. Tüm örnekler ayıklayın.
    6. Cam HPLC şişe içine süpernatantlar (400 ul) aktarın.
    7. 2, 4, 20 ve 40 ng / ml (200, 400, 2000, 4000 ng / ml stok çözeltisi, takrolimus 4 ul konsantrasyonları elde etmek için boş bir "ekstre geri test örnekleri" olarak takrolimus stok solüsyonu ekleyinsüpernatan 400 ul) ile utions.
    8. LC-MS / MS analizinden sonra, QC örneklerinin ve ilgili konsantrasyon "Kurtarma test örnekleri" hem sinyalleri karşılaştırmak (ekstraksiyon / sinyal örnekleri çıkarma x 100 sonra çivili önce kurtarma% = sinyal örnekleri çivili).
  7. Sulandırma bütünlüğü.
    1. Kullanılarak seyreltme bütünlüğü kurmak örnekler, 500, 250 ve 100 ng / ml'de analit ile çivili.
    2. Ekstraksiyon işleminden sonra, protein, bir çökeltme çözeltisi kullanarak örnekleri seyreltik (1:10, n = 3 konsantrasyon düzeyinde başına).
    3. Nominal konsantrasyonlarda sapmaları hesaplayın. % 85 içinde anma kabul edilebilir bir -115% düşüş sonuçları düşünün.
  8. Kararlılıkları.
    1. Dört konsantrasyon seviyelerinde (n = konsantrasyon başına 4), farklı zaman noktalarında ve farklı depolama şartları altında analiz de QC örnekleri kullanarak stabiliteleri araştırılması.
    2. Nominal değerleri ile depolandıktan sonra sonuçları karşılaştırın. R düşünün% 85 içinde anma kabul edilebilir bir -115% düşüş sonuçları · Borçlar.
    3. 4 ° C, -20 ° C de 1 ay ve -80 ° C de 1 ay 1 hafta çevre sıcaklığında 1 hafta Örnek stabilitesini oluşturulması.
    4. Üç döngü üzerinde test donma-çözülme stabilitesi (-20 ° C). 4 ° C'ye ayarlanır termostatlı bir otomatik numune alıcı içinde numuneler yerleştirilerek test ekstre numune ve otomatik numune stabilitesi. 72 saat sonra numune enjekte edilir.

Sonuçlar

Boş numune Örnek iyon kromatogramları, örnek, Şekil 3 'de gösterilmiştir miktar ve bir hasta numunesinin alt limitte çivili.

Kalibrasyon Eğrileri

En düşük algılama sınırı ml 0,5 ng / ve kantifikasyonunun alt sınırı 1,0 ng / ml olmuştur. Yüksek konsantrasyonlar normal şartlar altında klinikte ulaşılacak muhtemel olarak Elli ng / ml, en yüksek kalibratör olarak seçildi.

Kalibrasyon eğril...

Tartışmalar

Anılan olarak, kurutulmuş kan lekeleri dayalı terapötik ilaç ve takrolimus bağlılık izlenmesi kavramı çekici rağmen, genellikle venöz EDTA tam kan örneklerinde takrolimus LC-MS / MS analizi ile ilişkili ötesinde analitik zorluklar vardır. Bunlar arasında, ancak matris Burada kullanılan filtre kart malzemeyi ve düşük kan hacmi (20 ul) pamuk linterleri malzemesi içine batırılmış kapiler tam kan olması, bunlarla sınırlı değildir. Bununla birlikte, merkezi bir laboratuarda yüksek verimlilik a...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
TacrolimusU.S. Pharmacopeial Convention1642802
D2,13C-TacrolimusToronto Research Chemicals Inc.F370002
Red blood cellsUniversity of Colorado HospitalW20091305500 V
PlasmaUniversity of Colorado HospitalW2017130556300Q
Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9%Sigma-Aldrich439126-4 L
Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificA955-4
Isopropanol 99.9%, HPLCFisher ScientificBP2632-4
Methanol Optima LC/MSThermo Fisher ScientificA452-4
Water Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificW6-4
Formic acidThermo Fisher ScientificA118P-500
Phosphate-buffered saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Zinc sulfateThermo Fisher ScientificZ68-500
0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008649
1.5 ml Eppendorf tubeThermo Fisher Scientific02-682-550
10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008651
10 μl pipet tips with filter, sterileNeptuneBT 10XLS3
100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008653
100 μl pipet tips with filter, sterileNeptuneBT 100
1,000 μl pipet tips with filter, sterileMultimax2940
2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008650
2 ml Eppendorf tubeThermo Fisher Scientific02-681-258
20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008652
20 μl pipet tips with filter, sterileGeneMateP-1237-20
200 μl pipet tips with filterMultimax2938T
200 μl pipet tips with filter, sterileMultimax2936J
50 ml Falcon tubeBD Falcon352070
300 μl inserts for HPLC vialsPhenomenexARO-9973-13
Balance PR2002Mettler Toledo1117050723
Balances AX205 Delta RangeMettler Toledo1119343379
Bullet Blender HomogenizerNext AdvanceBBX24
Centrifuge Biofuge FrescoHeraeus290395
Disposable WipesPDIQ55172
Glass v ials, 4 mlThermo Fisher Scientific14-955-334
Glass vials, 20 mlThermo Fisher ScientificB7800-20
Gloves, nitrileTitan Brand Gloves44-100S
HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clearPhenomenexARO- 9921-13
Lids for HPLC vialsPhenomenexARO- 8952-13-B
Needle, 18 G 1.5Precision Glide305196
Rack for Eppendorf tubesThermo Fisher Scientific03-448-11
Rack for HPLC VialsThermo Fisher Scientific05-541-29
Steel beads 0.9 – 2 mmNext AdvanceSSB14B
Storage boxes for freezers / refrigeratorsThermo Fisher Scientific03-395-464
Standard multi-tube vortexerVWR Scientific Products658816-115
Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PKGE Whatman 2016-05
AutosamplerCTC PAL PAL.HTCABIx1
Binary pump, Agilent 1260 InfinityAgilent Technologies1260 G1312B
Binary pump, Agilent 1290 InfinityAgilent Technologies1290 G4220A
Micro vacuum degasser, Agilent 1260Agilent Technologies1260 G13798
Column oven,  Agilent 1290 with 2 position Agilent Technologies1290 G1216C
Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valveAgilent Technologies1290 G1316C
HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mmPhenomenex820950-926
HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mmPhenomenex993967-906
Tandem Mass Spectrometer
API5000 MS/MS with TurboIonspray sourceAB Sciex4364257
Mass spectrometry softwareAB SciexAnalyst 1.5.1

Referanslar

  1. Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
  2. Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
  3. Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
  4. . Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
  5. . A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
  6. Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
  7. Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group.. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
  8. Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
  9. Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
  10. Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
  11. Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
  12. Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
  13. Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L., Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. e. b. b. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. , 529-562 (2005).
  14. Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
  15. Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
  16. Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
  17. Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
  18. Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
  19. Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
  20. Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
  21. Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10 (6), 712-720 (2006).
  22. Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
  23. Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
  24. Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
  25. Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
  26. Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
  27. Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
  28. Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
  29. Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
  30. Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
  31. Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
  32. Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
  33. Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
  34. Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
  35. Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
  36. Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
  37. Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
  38. Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
  39. Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
  40. Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
  41. Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
  42. Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
  43. Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
  44. Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
  45. Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
  46. Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
  47. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 105Takrolimuskurutulmu kan lekeleriy ksek performansl s v kromatografisitandem k tle spektrometresiLC MS MSkolon anahtarlama online karmaterap tik ila izlemeev izlemeba l l k izleme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır