JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

Abstract

Tacrolimus מעכב calcineurin הוא אבן הפינה של רוב פרוטוקולי טיפול מדכא חיסון לאחר השתלת איברים מוצקה בארצות הברית. Tacrolimus הוא תרופת מדד טיפולית צרה וכגון דורש ניטור תרופה טיפולי והתאמת מינון המבוסס על ריכוזי שוקת דם כולה. כדי להקל על תרופה טיפולית בית וניטור דבקות, האוסף של כתמי דם יבשים הוא מושג אטרקטיבי. אחרי אצבע מקל, המטופל אוסף טיפת דם על נייר סינון בבית. אחרי הדם מיובש, הוא ישלח למעבדה אנליטית שבי tacrolimus הוא לכמת באמצעות ספקטרומטר מסת כרומטוגרפיה הנוזלי-טנדם ביצועים גבוהים (HPLC-MS / MS) בשילוב עם צעד פשוט מדריך למשקעי חלבון ומיצוי טור מקוון.

לניתוח tacrolimus, דיסק 6 מ"מ אגרוף מהמרכז הרווי של נקודת הדם. נקודת הדם הומוגני באמצעות בלנדר כדורND אז חלבונים הם זירז עם מתנול / 0.2 M 4 ZnSO מכיל הסטנדרטי D הפנימי 2, 13 C-tacrolimus. לאחר vortexing וצנטריפוגה, של supernatant 100 μl מוזרק לתוך עמודת חילוץ מקוונת ונשטפה עם 5 מיליליטר / דקה של 0.1 חומצה / אצטוניטריל פורמית (7: 3, v: v) עבור 1 דקות. מכאן והלאה, שסתום המיתוג מופעל וanalytes-סמוק בחזרה על טור אנליטי (ומופרד באמצעות 0.1% שיפוע חומצה / אצטוניטריל פורמית). Tacrolimus הוא לכמת במצב החיובי רב התגובה (MRM) באמצעות ספקטרומטר מסת טנדם.

Assay הוא ליניארי 1-50 ng / ml. שונות הבין-assay (3.6% -6.1%) ודיוק (91.7% -101.6%) כפי שהוערכו על 20 ימים עומדים בקריטריוני קבלה. התאוששות החילוץ הממוצעת היא 95.5%. אין לשאת על, הפרעות מטריצה ​​ואפקטי מטריצה ​​רלוונטיות. Tacrolimus הוא יציב בכתמי דם יבשים ב RT ובמעלות צלזיוס +4 לשבוע 1. דגימות שחולצו בautosampler יציבה במעלות צלזיוס +4 לפחות 72 שעות.

Introduction

Tacrolimus הוא immonosuppressant חזק 1-7 שיש לו מבנה macrolide 8 (איור 1). בשל חבר העמים - איזומרים טרנס של אגרות חוב CN הוא יוצר שתי rotamers בפתרון 9 שיכולים להיות מופרד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים שלב הפוך (HPLC) Tacrolimus הוא lipophilic ומסיס באלכוהול (מתנול: 653 גר '/ ל', אתנול: 355 g / L), פחמימנים הלוגנים (כלורופורם: 573 גר '/ ל') ואתר. זה במשורה מסיס בפחמימנים אליפטי (הקסאן: 0.1 גר '/ L ומים (pH 3:. .0047 G / L) 9 המולקולה אינה מכילה chromophore ומקסימום UV-הקליטה שלו הוא 192 ננומטר מעשי Tacrolimus באמצעות עיכוב של calcineurin. . מנגנון פעולתה נבדק באזכור 10,11. הוא משמש כיום בלמעלה מ -80% ממושתלי איברים מוצקים בארצות הברית 12.

המדד הטיפולי של tacrolimus הוא considereד להיות צר 13. בנוסף, הקשר בין מינוני tacrolimus וריכוזי דם הוא עני והפרמקוקינטיקה משתנה 14,15. ניטור תרופה טיפולי להנחות מינון tacrolimus במושתלים הוא פרקטיקה קלינית ולכן כללית 16-20. המטרה היא לשמור על ריכוזי דם tacrolimus בטווח טיפולי מוגדר מראש. ריכוזי דם tacrolimus מתחת לטווח הטיפולי עלולים לגרום לפעילות מוגברת של תגובות allo-חיסוני כרוניות או אקוטיות, בעוד ריכוזים מעל החלון הטיפולי להגביר את הסיכון לסרטן ורעילות, כגון Nephrotoxicity, רעילויות, יתר לחץ דם, סוכרת ועל-דיכוי חיסוני. שונות התוך-אישיות pharmacokinetic גבוהות של tacrolimus עלולות לפגוע בשני איברים להשתלה והישרדות חולה 21,22. בעוד שונות הבין-אישיות של הפרמקוקינטיקה tacrolimus נגרמות בעיקר על ידי פולימורפיזם CYP3A5, סיבות לתוך אישיהשתנות כוללות, אך אינם מוגבלות ליחסי גומלין, תרופתיות, מחלות-סמים ומזון תרופתיים 14,15. גם חוסר הדבקות במשטר התרופה לדיכוי מערכת החיסון הטיפולי הוא גורם תורם וסיבה עיקרית לאובדן 23,24 שתל.

שיקולים אלה מצביעים על כך שתרופה טיפולית הבית תכוף וניטור דבקות של ריכוזי דם כל tacrolimus עשויה להיות מועילות כדי להבטיח שיש לי חולים חשיפת tacrolimus בתוך החלון הטיפולי הרצוי בכל העת. עם זאת, הלוגיסטיקה ועלות ניטור תרופה טיפולית תכוף יותר כפי שהוא פרקטיקה קלינית נוכחית 15 היא מונע. אחת הסיבות הוא שהחולה צריך לראות phlebotomist יש דגימת דם ורידים הנדרשת נמשכת. כתמי דם יבשים צמחו לאחרונה כקונספט אטרקטיבי 25-28. אחרי אצבע פשוטה מקל החולה אוסף טיפת דם על כרטיס נייר סינון מיוחד ולאחר נקודת דם דRied, זה יכול להיות בדואר למעבדה מרכזית לניתוח של tacrolimus וכל החיסון אחר שהמטופל יכול כרגע לקחת. זה הפך להיות אפשרי בשל הפיתוח של מבחני LC-MS / MS רגישים והספציפיים ביותר עבור כימות של tacrolimus ומערכת חיסון אחר בכמויות דם קטנות מאוד כגון כתמי דם יבשים (בדרך כלל 20 μl דם) 25,29-43. יתרון נוסף הוא שנפח דגימת אסטרטגיות פולשנית, נמוכות אוסף כגון כתמי דם יבשים להקל ניטור טיפולי סמים ומחקרי פרמקוקינטיקה בילדים קטנים מאוד 28.

Tacrolimus נמדד בדרך כלל בכל דם ורידי EDTA 15. סיבות לכך הן שtacrolimus מפיץ בהרחבה לתאי דם וכי מחקרים קליניים דיווחו מתאם טוב יותר בין ריכוזי שוקת tacrolimus בדם מאשר בפלזמה עם אירועים קליניים 15,18. לשם השוואה, הניתוח של ת"אcrolimus בכתמי דם יבש מבוסס על דם נימים כי הוא מעורבב עם מטריצת נייר סינון. זה מציב אתגרים במונחים של solubilization של tacrolimus והפרעות פוטנציאליות עם ניתוח LC-MS / MS. כאן אנו מציגים assay הוקם ומאומתים על בסיס הומוגניזציה של נקודת הדם היבש באמצעות בלנדר כדור בשילוב עם מדגם גבוהה זרימת טור מקוון הליך לנקות וניתוח LC-MS / MS. נכון להיום, assay זה בהצלחה משמש לכימות של יותר מחמישה אלף דגימות דם נקודת tacrolimus מיובשות לניטור דבקות בניסויים קליניים.

Protocol

דגימות דם שזוהו-דה מאנשים בריאים היו מאוניברסיטת קולורדו בבית החולים (אורורה, קולורדו). השימוש בדגימות בנק דם-מזוהה דה ללימודי אימות, כמו גם להכנת כיול דגימות בקרת האיכות נחשבה "פטור" על ידי המועצה לביקורת קולורדו רב-המוסדית (COMIRB, אורורה, קולורדו).

1. הכנת הערות ופתרונות

  1. tacrolimus רכישה והתקן הפנימי D 2, 13 C-tacrolimus מהספקים המופיעים ברשימת חומרים.
    1. הכן פתרונות מניות במתנול הטהור בריכוז של 1 מ"ג / מיליליטר לtacrolimus וריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר לD 2, 13 C-tacrolimus. הפוך פתרונות מניות של חומרי עזר המבוסס על שלוש משקולות עצמאיות. פתרונות Aliquot מניות ולאחסן ב -70 ° C או מתחת.
  2. הכן את הפתרון כדי לזרז חלבוניםולחלץ tacrolimus באמצעות מתנול / 0.2 M 4 ZnSO במים (7: 3, v: v). פתרון זה מכיל גם את תקן D הפנימי 2, 13 C-tacrolimus בריכוז של 2.5 ng / ml, והוא משמש להפקת כל דגימות פרט למיצוי של דגימות ריקות (ראה 1.3.3).
    1. הכן פתרון משקעים חלבון זה טרי בכל יום חילוץ ולהגדיר את התפוגה של הפתרון בשעה 12.
  3. הכנת עקומה כיול ובקרת איכות דגימות (QC)
    1. הכן פתרונות מניות של tacrolimus ידי ביצוע דילולים מתאימים של פתרון המניות באמצעות מתנול הטהור.
    2. כדי להכין כיול דגימות בקרת איכות, ספייק 20 μl של פתרון מניות בדילול כראוי לכל דם EDTA, דגירה על 37 מעלות צלזיוס מתחת הרעד עדין באמבט מים, כדי לאפשר הפצה הומוגנית של tacrolimus למרכיבי דם הסלולריים במשך 20 דקות וaliquot לפוליפ 1.5 מיליליטרצינורות ropylene עם תחתית חרוטי וsnap-על עפעפיים. ודא שעוצמתו היחסית של ממס אורגני אינה עולה על 5%.
    3. ספוט 50 μl של כל הדם ממוסמר למרכז של כל עיגול על כרטיסי המסנן בעזרת פיפטה.
    4. ייבש את כתמי הדם על כרטיסי מסנן ב RT עבור 3 שעות.
    5. הכן סטנדרטים כיול tacrolimus בדם כל EDTA אדם בריכוזים tacrolimus של 1, 2.5, 5, 10, 25, ו -50 ng / ml. הכן מדגם ריק להפקה כמו הסטנדרטים כיול עם פתרון המשקעים חלבון המכיל הסטנדרטי D הפנימי 2, 13 C-tacrolimus ("אפס מדגם").
    6. הכן דגימות QC בדם כל EDTA אדם בריכוזים של 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. הכן מדגם ריק. בניגוד לדוגמאות QC שמופקות עם משקעים המכילים הסטנדרטי D הפנימי 2, 13 C-tacrolimus, לחלץ מדגם ריק זה עם פתרון משקעים חלבון שעושהלא מכיל הסטנדרטי D הפנימי 2, 13 C-tacrolimus ("מדגם ריק").
  4. איסוף דגימות קליניות
    1. לאסוף נקודות מיובשות דם כפי שמתואר ב43,44.

2. דוגמאות ספוט דם הפקה של Tacrolimus מיובשים

  1. ראייה לבדוק את מקום הדם היבש על מנת להבטיח איכות מדגם מקובלת ונפח 45.
  2. מרכז אגרוף של כתם הדם על כרטיס המסנן עם אגרוף חור 6 מ"מ.
    הערה: איכות האגרופים עשויה להיות במעקב על ידי שקילה. אגרוף דיסק מסנן רווי שוקל מ"ג 5.02 הממוצע ± 0.09 מ"ג (טווח: 4.83- 5.14 מ"ג, n = 12).
  3. דיסקי מקום לתוך צינורות 1.5 מיליליטר פוליפרופילן עם תחתית חרוטי ומכסי snap-על.
  4. להוסיף 20-30 כדורים לכל צינור.
  5. הוסף 500 μl של פתרון המשקעים חלבון (מתנול: 0.2 M 4 ZnSO, 7: 3, v: v 2.5 ng / תקן פנימי מיליליטר) לתוך צינור אחד. לextrפעולה של דגימות ריקות, להשתמש בפתרון משקעים חלבון ללא התקן הפנימי.
  6. Homogenize הדיסקים בבלנדר כדור דקות 1 (מהירות המרבית, הגדרה "10").
  7. Shake דגימות ב RT על מערבולת רב-צינור (מהירות המרבית, הגדרה "10") במשך 10 דקות.
  8. צנטריפוגה דגימות 16,000 XG ו- C ° 4 במשך 10 דקות.
  9. העבר את supernatants לתוך צלוחיות זכוכית HPLC מצוידות בהוספת 300 μl. השתמש באטמי טפלון מראש חריץ.
    הערה: דגימות שחולצו ניתן לאחסן ב -20 ° C או מתחת עד ניתוח LC-MS / MS.

3. LC-MS / MS ניתוח

  1. עומס של supernatant של המדגם שחולץ 100 μl על טור חילוץ מחסנית C8 ולשטוף עם 7: 3 יחס של 0.1% חומצה פורמית במים: אצטוניטריל בזרימה של 5 מיליליטר / דקה 1 דקות. הקשרים של שסתום המיתוג מוצגים באיור 2 והשיפוע המנוהל על ידי משאבת החילוץ בטבלה 1 .
  2. מכאן והלאה, להפעיל את שסתום המיתוג וכתוצאה מכך גב הסומק של analytes ממראש הטור על טור אנליטי.
  3. הגדר את התרמוסטט הטור עד 65 מעלות צלזיוס.
  4. Elute analytes מהעמודה אנליטיים תוך שימוש בשיעורי הזרימה והשיפוע שמוצגים בטבלה 1.
  5. חבר את הטור אנליטיים לספקטרומטר מסת טנדם באמצעות מקור יינון electrospray הטורבו. להתאים את הפרמטרים העיקריים של ספקטרומטר המסה לפי טבלה 2.
  6. זיהוי יונים חיוביים (+ [M + Na]) במצב מרובה התגובה (MRM). השתמש במעברי היון הבאים לכימות: tacrolimus: מ '/ z (מסה ​​/ מטען) = 826.6 616.2 → ו- D 2, 13 C-tacrolimus: מ' / z = 829.6 → 619.2.
    הערה: סך הכל זמן הריצה הוא 4.6 דקות.

4. כימות

  1. לכל ריצה, ליצור עקומת כיול המבוסס על כיילי מוכן ב1.3.5 וכולל בכל ריצת אנליטיות.
    1. ליצור עקומת כיול על ידי התוויית ריכוזים נומינליים לעומת גורם תגובה של אנליטי (אזור השיא [אנליטי] / אזור השיא [תקן פנימי]) באמצעות תוכנת ספקטרומטר המסה.
    2. התאם את כיילי באמצעות ריבועית בכושר בשילוב עם שקלול 1 / X.
  2. לtacrolimus כמות בכתמי הדם היבש לשלב tacrolimus ופסגות סטנדרטיים פנימיות בchromatograms MRM חילוץ. חשב את הגורם לתגובת tacrolimus (אזור שיא [אנליטי] / שיא פינת [תקן פנימי]) ולהשוות עם עקומת הכיול באמצעות תוכנת ספקטרומטר המסה.

5. נהלי אימות

  1. גבול תחתון של זיהוי (LLOD) וגבול תחתון של כימות (LLOQ).
    1. קחו למשל את ריכוז tacrolimus הנמוך ביותר עם יחס שיא לרעש של 4: 1 לגבול התחתון של זיהוי (LLOD). הגדר את הגבול התחתון של כימות (LLOQ) כהריכוז הנמוך ביותר של עקומת הכיול עם דיוק שווה או טוב יותר מ± סטיית 20% מהריכוז והדיוק שווה או טוב יותר מ- 20% (מקדם של שונות) הנומינליים.
  2. התוך ודיוקים בין-יום ודקדקנות.
    1. לבדוק את הדיוק ודיוק בארבע רמות ריכוז של 2 מיליליטר ng / (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) ו -40 מיליליטר ng / (QC4).
    2. הכן את דגימות QC בכל יום בכל אימות דם EDTA האנושי, יבש על כרטיסי מסנן, לחלץ, ולנתח כפי שתואר לעיל.
    3. לקבוע דיוק תוך היום ודיוק עם 6 דגימות לרמת ריכוז QC.
    4. להעריך את דיוק בין-יום ודיוק מעל 20 ימים. למדוד כל רמת QC עם 4 דגימות כל יום.
    5. לנתח שתי עקומות כיול יחד עם דגימות QC בכל יום.
    6. חישוב דיוק תוך היום כ% מהריכוז הנומינלי (שש דגימות לרמת ריכוז, אנא ראו 5.2.2). Calcדיוק ulate כמקדם של שונות (% קורות חיים).
    7. שקול דיוק תוך היום מקובל אם הוא נופל לקבלה מגבילה 85% ל -115% מהריכוז הנומינלי. שקול דיוק תוך היום מקובל אם הוא שווה או טוב יותר מאשר קורות חיים (מקדם של שונות) של 15%.
    8. חישוב דיוק בין-יום ודיוק כממוצע עבור כל רמת ריכוז QC ניתחה יותר מ -20 ימי אימות.
    9. שקול דיוק בין יום ממוצע מקובל אם הוא נופל לקבלה מגבילה 85% ל -115% מהריכוז הנומינלי. שקול דיוק בין-יום מקובל אם הוא שווה או טוב יותר מאשר קורות חיים (מקדם של שונות) של 15%.
  3. הרחקה של הפרעות מטריצה.
    1. להדרה של הפרעות שעלולות להיגרם על ידי אותות מטריצה, לנתח כתמים ריקים מיובשים דם (8 אנשים שונים, רצוי 4 זכרים ונקבות 4).
    2. ראייה לבדוק chromatograms יונים. אם פסגות בזמן השמירהחלון של tacrolimus מזוהים, לשלב ולהשוות האזורים שלהם מתחת לעקומה עם אלו של פסגות tacrolimus בדגימות ריקות ממוסמר עם tacrolimus בLLOQ. האזור של פסגות בדגימות ריקות לא אמור יעלה על 15% מאלה של tacrolimus בLLOQ.
  4. דיכוי יון / שיפור יון.
    1. השתמש בפרוטוקול עירוי הודעה טור-כמתואר 45 להעריך הפרעה אפשרית של שיפור דיכוי / יון יון שנגרם על ידי רכיבי מטריצת משחררי שיתוף.
    2. להשרות tacrolimus בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר מומס בחומצה פורמית 0.1%: מתנול (30:70, V / V) הודעה טור-בשיעור של 10 μl / דקה.
      1. חבר משאבת מזרק באמצעות T-חתיכה בין העמודה אנליטיים ומקור electrospray של ספקטרומטר המסה.
      2. צג עוצמת אות MS / MS של מעברי MRM לtacrolimus והתקן הפנימי שלה (m / z = 826.6 → 616.2 וm / z = 829.6 → 619.2) לאחר ההזרקה של extracדגימות טד ריקות (n = 8 דגימות מאנשים שונים).
        הערה: בהיעדר שיפור דיכוי / יון יון האות רציפה הנגרמת על ידי עירוי של analytes לא אמור להיות מושפעת על ידי הזרקה של המטריצה ​​ריקה, תוך דיכוי יון גורם טבילה של שיפור האות ויון שיא.
  5. לשאת על.
    1. להעריך לשאת על פוטנציאל על ידי ניתוח דגימות שחולצו ריקות לאחר כיילי הגבוה ביותר (50 ng / ml, n = 6).
    2. ראייה לבדוק chromatograms יונים. אם פסגות בתוך החלון של tacrolimus זמן שמירה מזוהות, לשלב ולהשוות האזורים שלהם מתחת לעקומה עם אלו של פסגות tacrolimus בדגימות ריקות ממוסמר עם tacrolimus בLLOQ. האזור של פסגות בדגימות ריקות לא אמור יעלה על 15% מאלה של tacrolimus בLLOQ.
  6. החלמה חילוץ.
    1. לקבוע החלמה על ידי השוואת האותות של analytes לאחר החילוץ של QC סםPles בכל ארבע רמות הריכוז (n = 6 לריכוז) עם אלה של כתמי דם יבשים ריקים ממוסמר עם הסכומים המקביל של tacrolimus לאחר החילוץ.
    2. הכן ארבעה סטים של QCs (רמות ריכוז: 2, 4, 20, 40 ng / ml).
    3. הכן עוד 4 סטים של מקביל "דגימות בדיקת התאוששות" על ידי איתור 50 μl של כל דם EDTA הריק על כרטיסי נייר הסינון וייבוש עבור שעה 2.
    4. מכאן והלאה, לשניהם QC ו" דגימות בדיקת התאוששות "ריקות, לחתוך את כל כתם הדם על כרטיס המסנן עם מספריים ולמקם את הדיסקים וכתוצאה מכך לתוך צינור פוליפרופילן עם תחתית חרוטי ומכסה snap-על.
    5. לחלץ את כל הדגימות.
    6. העבר את supernatants (400 μl) לתוך צלוחיות הזכוכית HPLC.
    7. להוסיף פתרון מניות tacrolimus ל" דגימות התאוששות חילוץ מבחן "ריקות כדי להגיע ריכוזים של 2, 4, 20 ו -40 ng / ml (4 μl של 200, 400, 2,000, 4,000 סול ng / ml מניית tacrolimusutions 400 μl של supernatant).
    8. לאחר ניתוח LC-MS / MS, להשוות את האותות בשתי דגימות QC ו" דגימות בדיקת התאוששות "של הריכוז המקביל (% = דגימות אות התאוששות זינקו לפני דגימות חילוץ / אות זינקו לאחר חילוץ x 100).
  7. שלמות דילול.
    1. דגימות להקים שלמות דילול באמצעות ממוסמרות עם analytes ב 500, 250 ו- 100 ng / ml.
    2. לאחר חילוץ, לדלל דגימות באמצעות פתרון משקעים חלבון (01:10, n = 3 לרמת ריכוז).
    3. לחשב סטיות מהריכוזים הנומינליים. שקול תוצאות שנופלות בתוך 85% -115% ממקובל נומינלי.
  8. Stabilities.
    1. לחקור stabilities באמצעות דגימות QC בכל ארבע רמות הריכוז (n = 4 לריכוז) נותחו בנקודתי זמן שונות ובתנאי האחסון השונים.
    2. להשוות את התוצאות לאחר אחסון עם הערכים הנומינליים. שקול results שנופלים בתוך 85% -115% ממקובל נומינלי.
    3. להקים יציבות לדוגמה עבור השבוע 1 בטמפרטורת הסביבה, שבוע 1 ב 4 ° C, 1 חודש ב -20 ° C וחודש 1 ב -80 מעלות צלזיוס.
    4. יציבות להקפיא להפשיר מבחן בשלושה מחזורים (-20 ° C). מדגם בדיקת חילוץ ויציבות autosampler על ידי הצבת דגימות לתוך autosampler thermostatted המותאמת ל4 מעלות צלזיוס. הזרק דגימות לאחר 72 שעות.

תוצאות

chromatograms יון נציג של מדגם ריק, מדגם זינק בגבול התחתון של כימות ומדגם חולה מוצג באיור 3.

עקומות כיול

הגבול התחתון של זיהוי היה 0.5 ng / ml והגבול התחתון של כימות היה 1.0 ng / ml. חמישים ng / ml נבחר ככ...

Discussion

אמנם, כאמור, את הרעיון של תרופה טיפולית ומעקב דבקות של tacrolimus מבוסס על כתמי דם יבשים הוא אטרקטיבי, יש אתגרים אנליטיים שהולכים מעבר לאלו שבדרך כלל קשורים לניתוח LC-MS / MS של tacrolimus בדגימות דם כל EDTA ורידים. אלה כוללים, אך לא רק, את העובדה שהמטריצה ​​היא כל נימי הדם נספג חומר lin...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
TacrolimusU.S. Pharmacopeial Convention1642802
D2,13C-TacrolimusToronto Research Chemicals Inc.F370002
Red blood cellsUniversity of Colorado HospitalW20091305500 V
PlasmaUniversity of Colorado HospitalW2017130556300Q
Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9%Sigma-Aldrich439126-4 L
Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificA955-4
Isopropanol 99.9%, HPLCFisher ScientificBP2632-4
Methanol Optima LC/MSThermo Fisher ScientificA452-4
Water Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificW6-4
Formic acidThermo Fisher ScientificA118P-500
Phosphate-buffered saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Zinc sulfateThermo Fisher ScientificZ68-500
0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008649
1.5 ml Eppendorf tubeThermo Fisher Scientific02-682-550
10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008651
10 μl pipet tips with filter, sterileNeptuneBT 10XLS3
100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008653
100 μl pipet tips with filter, sterileNeptuneBT 100
1,000 μl pipet tips with filter, sterileMultimax2940
2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008650
2 ml Eppendorf tubeThermo Fisher Scientific02-681-258
20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008652
20 μl pipet tips with filter, sterileGeneMateP-1237-20
200 μl pipet tips with filterMultimax2938T
200 μl pipet tips with filter, sterileMultimax2936J
50 ml Falcon tubeBD Falcon352070
300 μl inserts for HPLC vialsPhenomenexARO-9973-13
Balance PR2002Mettler Toledo1117050723
Balances AX205 Delta RangeMettler Toledo1119343379
Bullet Blender HomogenizerNext AdvanceBBX24
Centrifuge Biofuge FrescoHeraeus290395
Disposable WipesPDIQ55172
Glass v ials, 4 mlThermo Fisher Scientific14-955-334
Glass vials, 20 mlThermo Fisher ScientificB7800-20
Gloves, nitrileTitan Brand Gloves44-100S
HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clearPhenomenexARO- 9921-13
Lids for HPLC vialsPhenomenexARO- 8952-13-B
Needle, 18 G 1.5Precision Glide305196
Rack for Eppendorf tubesThermo Fisher Scientific03-448-11
Rack for HPLC VialsThermo Fisher Scientific05-541-29
Steel beads 0.9 – 2 mmNext AdvanceSSB14B
Storage boxes for freezers / refrigeratorsThermo Fisher Scientific03-395-464
Standard multi-tube vortexerVWR Scientific Products658816-115
Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PKGE Whatman 2016-05
AutosamplerCTC PAL PAL.HTCABIx1
Binary pump, Agilent 1260 InfinityAgilent Technologies1260 G1312B
Binary pump, Agilent 1290 InfinityAgilent Technologies1290 G4220A
Micro vacuum degasser, Agilent 1260Agilent Technologies1260 G13798
Column oven,  Agilent 1290 with 2 position Agilent Technologies1290 G1216C
Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valveAgilent Technologies1290 G1316C
HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mmPhenomenex820950-926
HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mmPhenomenex993967-906
Tandem Mass Spectrometer
API5000 MS/MS with TurboIonspray sourceAB Sciex4364257
Mass spectrometry softwareAB SciexAnalyst 1.5.1

References

  1. Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
  2. Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
  3. Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
  4. . Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
  5. . A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
  6. Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
  7. Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group.. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
  8. Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
  9. Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
  10. Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
  11. Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
  12. Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
  13. Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L., Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. e. b. b. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. , 529-562 (2005).
  14. Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
  15. Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
  16. Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
  17. Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
  18. Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
  19. Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
  20. Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
  21. Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10 (6), 712-720 (2006).
  22. Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
  23. Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
  24. Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
  25. Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
  26. Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
  27. Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
  28. Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
  29. Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
  30. Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
  31. Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
  32. Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
  33. Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
  34. Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
  35. Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
  36. Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
  37. Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
  38. Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
  39. Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
  40. Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
  41. Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
  42. Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
  43. Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
  44. Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
  45. Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
  46. Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
  47. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

105TacrolimusLC MS MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved