JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

Аннотация

Ингибитор кальциневрина такролимуса является краеугольным камнем большинства иммуносупрессивных протоколов лечения после трансплантации солидных органов в Соединенных Штатах. Циклоспорин представляет собой узкий терапевтический индекс наркотиков и, соответственно, требует терапевтического мониторинга наркотиков и корректировка дозы на основе всей его концентрации корыто крови. Для облегчения домашнего терапевтический препарат и контроля за соблюдением, сбор сухих пятен крови является привлекательным понятием. После прокола пальца, пациент собирает капли крови на фильтровальной бумаге в домашних условиях. После того, как кровь сушат, она по почте в аналитическую лабораторию, где циклоспорин количественно с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС / МС) в сочетании с простой ручной стадии осаждения белка и экстракции онлайн колонки.

Для анализа такролимус, 6-мм диск выбиты из насыщенного центре пятна крови. Пятно крови гомогенизируют, используя пули смесителе сЗатем белки й осаждают метанолом / 0,2 М ZnSO 4, содержащий внутренний стандарт D 2, 13 С-такролимус. После вихревого и центрифугирования добавляли 100 мкл супернатанта вводят в колонну онлайн экстракции и промывают 5 мл / мин 0,1 муравьиной кислоты / ацетонитрила (7: 3, по объему) в течение 1 мин. Далее, переключающий клапан активируется и аналиты обратно промыть на аналитической колонке (и разделяли, используя 0,1% муравьиной кислоты / ацетонитрил градиент). Циклоспорин количественно в положительном режиме реакции несколькими (MRM) с использованием тандемной масс-спектрометра.

Анализ линейной от 1 до 50 нг / мл. Вариабельность-анализ (3,6% -6,1%) и точность (91,7% -101,6%), а проверяется в течение 20 дней отвечают критериям приемлемости. Средняя восстановление добыча 95,5%. Там нет соответствующих перенос, матричные помехи и матричные эффекты. Циклоспорин является стабильным в сухой капли крови при комнатной температуре и при + 4 ° С в течение 1 недели. Извлеченные образцы впробоотборник стабильны при температуре +4 ° С в течение, по крайней мере 72 часов.

Введение

Циклоспорин является мощным immonosuppressant 1-7, который имеет структуру макролидное 8 (рис 1). Благодаря цис - транс изомерии связей CN образует два ротамеров в растворе 9, которые могут быть разделены с обращенной фазой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Циклоспорин обладает липофильными и растворим в спиртах (метанол: 653 г / л, этанол: 355 г / л), галогенированные углеводороды (хлороформ: 573 г / л) и эфир. Это редко растворимы в алифатических углеводородов (гексан: 0,1 г / л и воды (рН 3:. 0,0047 г / л) 9 молекула не содержат каких-либо хромофора и его максимум УФ-поглощения 192 нм Циклоспорин действует через ингибирование кальцинейрина. . Механизм его действия был рассмотрен в ссылках 10,11. В настоящее время используется более чем в 80% больных после трансплантации твердых органов в Соединенных Штатах 12.

Терапевтический индекс такролимуса составляет considered, чтобы быть узкой 13. Кроме того, корреляция между такролимуса доз и концентрации в крови низкое, и фармакокинетики является переменной 14,15. Терапевтический лекарственный мониторинг, чтобы направлять циклоспорин дозирования у пациентов после трансплантации поэтому вообще клинической практике 16-20. Целью является, чтобы держать концентрацию такролимуса в крови в течение заранее определенного терапевтического диапазона. Концентрации Циклоспорин крови ниже терапевтического диапазона может привести к повышенной активности хронических или острых алло-иммунных реакций, в то время как при концентрации выше терапевтического окна увеличивают риск избыточного иммунитета, рак и токсичность, например, нефротоксичности, нейротоксичность, гипертензию и сахарный диабет. Высокая Фармакокинетические внутри индивидуальная изменчивость такролимуса может быть вредным для обоих пересадки органов и выживаемость пациентов 21,22. В то время как между индивидуальная изменчивость фармакокинетики такролимуса в основном вызвано CYP3A5 полиморфизмов, причин внутрииндивидуальнаяИзменчивость включают, но не ограничиваются ими, межлекарственных, болезни лекарственного средства и пищевого наркотиков взаимодействий 14,15. Также не хватает приверженности к иммуносупрессивной терапевтического лечения наркотиков является фактором, и одной из основных причин потери трансплантата 23,24.

Эти соображения показывают, что частое домашнего терапевтическое лекарственное средство и соблюдение контроль такролимуса целых концентрации в крови может быть полезным для того, чтобы пациенты имеют циклоспорин экспозицию в желаемой терапевтической окна в любой момент времени. Тем не менее, логистика и стоимость чаще терапевтического лекарственного мониторинга, как это текущий клинической практики 15 является запретительной. Одной из причин является то, что пациент должен видеть Phlebotomist иметь необходимую образце венозной крови обращается. Сухих пятен крови недавно появились в качестве привлекательного концепции 25-28. После простой пальца придерживаться пациента собирает капли крови на специальный бумажный фильтр карты и после пятно крови DРид, он может быть отправлен по почте в центральную лабораторию для анализа такролимуса и любой другой иммунодепрессант, что пациент может принимать в данный момент. Это стало возможным благодаря разработке высокочувствительных и конкретных ЖХ-МС / МС анализов для количественного такролимуса и других иммунодепрессантов в очень малых объемах крови, таких как сушеные пятна крови (обычно 20 мкл крови) 25,29-43. Еще одним преимуществом является то, что минимально инвазивные, низкие стратегии сбора образцов, таких как объем сухих пятен крови значительно облегчит лекарственного мониторинга и фармакокинетические исследования у маленьких детей 28.

Циклоспорин, как правило, измеряется в венозной крови с ЭДТА всей 15. Причины в том, что такролимус широко распространяет в клетки крови и клинические исследования показали, лучшую корреляцию между концентрациями такролимуса в крови корыто, чем в плазме с клиническими событиями 15,18. Для сравнения, анализ таcrolimus в сухой капли крови на основе капиллярной крови, который смешивается с фильтровальной бумаги матрицы. Это создает проблемы с точки зрения солюбилизации такролимуса и потенциальных помех с анализом ЖХ-МС / МС. Здесь мы представляем установленную и проверенную анализа, основанного на усреднении высушенного месте в крови, используя пули блендер в сочетании с высокой пропускной образца онлайн колонки очистить процедуры и анализа ЖХ-МС / МС. На сегодняшний день, этот анализ был успешно использован для количественного определения более пяти тысяч такролимуса сушат точечных проб крови для мониторинга приверженности в клинических испытаниях.

протокол

Де-идентифицированные образцы крови от здоровых лиц были из университета Колорадо больницы (Аврора, Колорадо). Использование образцов крови банковских обезличенной для исследований по валидации, а также для подготовки калибраторов и контрольных образцов качества считалась "освобождаются" от Колорадо нескольких Экспертный совет (COMIRB, Аврора, Колорадо).

1. Подготовка справки и решения

  1. Покупка такролимус и внутренний стандарт D 2, 13 С-такролимус от поставщиков, перечисленных в Списке материалов.
    1. Подготовка исходных растворов в чистого метанола в концентрации 1 мг / мл для такролимуса и концентрации 10 мкг / мл для D 2, 13 С-такролимуса. Сделайте растворы справочных материалов на основе трех независимых весов. Кратные растворы и хранят при -70 ° С или ниже.
  2. Приготовьте раствор для осаждения белкови извлекать такролимус, используя метанол / 0,2М ZnSO 4 в воде (7: 3, по объему). Это решение также содержит внутренний стандарт D 2, 13 С-такролимус в концентрации 2,5 нг / мл и используется для извлечения всех образцов для извлечения образцов, кроме пустых (см 1.3.3).
    1. Подготовьте осаждения белка раствор свежей каждый день экстракции и установить истечение раствора при 12 ч.
  3. Подготовка калибровочной кривой и (КК) образцов контроля качества
    1. Подготовка исходных растворов такролимуса, выполняя соответствующие разведения исходного раствора использовании чистого метанола.
    2. Чтобы приготовить калибраторов и контрольных образцов качества, шип 20 мкл соответственно разбавленного раствора в ЭДТА цельной крови, инкубируют при 37 ° С при осторожном встряхивании на водяной бане, чтобы обеспечить однородное распределение такролимуса в клеточных компонентов крови в течение 20 минут и аликвоты в 1,5 мл полипаropylene трубки с коническим днищем и оснастки крышками. Убедитесь, что относительный объем органического растворителя не превышает 5%.
    3. Пятно 50 мкл цельной крови шипами в середине каждого круга на фильтре карт с использованием пипетки.
    4. Сушат пятна крови на фильтровальной карт при комнатной температуре в течение 3 часов.
    5. Подготовка калибровочных такролимус стандарты человеческого ЭДТА цельной крови при концентрации такролимуса 1, 2.5, 5, 10, 25, и 50 нг / мл. Приготовьте чистый образец для извлечения как калибровочных с осаждения белка раствора, содержащего внутренний стандарт D 2, 13 C-такролимус ("нулевой образец").
    6. Подготовка образцов QC в человеческой цельной крови EDTA в концентрации 0, 2, 4, 20, 40 нг / мл. Приготовьте чистый образец. В отличие от образцов QC, которые извлекаются с осадками, содержащего внутренний стандарт D 2, 13 С-циклоспорин, извлечь этот холостой пробе с осаждения белка решение, котороене содержит внутреннего стандарта D 2, 13 C-такролимус ("пустой образец").
  4. Коллекция образцов клинических
    1. Соберите высушенные пятна крови, как описано в 43,44.

2. Добыча такролимуса засохшей крови пятна Образцы

  1. Осмотрите сухой капли крови, чтобы обеспечить приемлемое качество образца и объем 45.
  2. Удар центре пятна крови на фильтровальной карты с 6-мм дырокола.
    Примечание: Качество ударов может контролироваться путем взвешивания. Пробивки насыщенный фильтр диска весит в среднем 5,02 мг ± 0,09 мг (диапазон: 4.83- 5.14 мг, N = 12).
  3. Место диски в 1,5 мл полипропиленовые пробирки с коническим дном и оснастки крышками.
  4. Добавить 20-30 пули в каждую пробирку.
  5. Добавить 500 мкл раствора осаждения белка (метанол: 0,2 М ZnSO 4, 7: 3, по объему с 2,5 нг / мл внутреннего стандарта) в каждую пробирку. Для ОтбораДействие холостых проб, используйте белка осадков решение без внутреннего стандарта.
  6. Перемешать диски в блендере пули за 1 мин (максимальная скорость, установив "10").
  7. Взболтать образцы при комнатной температуре на несколько труб вихря (максимальной скорости, установив "10") в течение 10 мин.
  8. Центрифуга образцов при 16000 х г и 4 ° С в течение 10 мин.
  9. Передача супернатанты в стеклянные флаконы для ВЭЖХ, оснащенных 300 мкл вставки. Используйте предварительно щели тефлоновые уплотнения.
    Примечание: Выдержки пробы могут храниться при температуре -20 ° С или ниже до анализа ЖХ-МС / МС.

3. ЖХ-МС / МС анализ

  1. Нагрузка 100 мкл супернатанта извлеченного образца на экстракционной колонне С8 картриджа и мыть с 7: 3 соотношение 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле: воде при скорости потока 5 мл / мин в течение 1 мин. Соединения переключающего клапана показаны на рисунке 2, а градиент ведении экстракции насосом в таблице 1 .
  2. Далее, активировать клапан переключения в результате обратной промывки аналитов из предварительно колонке на аналитической колонке.
  3. Установите термостат колонки 65 ° С.
  4. Элюируйте анализируемых из аналитической колонки, используя скорость потока и градиента, показанные в таблице 1.
  5. Подключение аналитической колонки с помощью масс-спектрометра тандеме с помощью источника ионизации электрораспылением турбо. Отрегулируйте основные параметры масс-спектрометра в соответствии с таблицей 2.
  6. Обнаружение положительных ионов ([M + Na] +) в режиме множественного реакционного (MRM). Используйте следующие ионные переходы для количественного: циклоспорин: M / Z (масса / заряд) = 826,6 → 616,2 и D 2, 13 C-такролимус: м / г = 829.6 → 619,2.
    Примечание: Общее время работы составляет 4,6 мин.

4. Количественное

  1. Для каждого прогона, генерировать калибровочную кривую на основе калибраторов, полученных в 1.3.5 ивключать в каждый аналитической перспективе.
    1. Создание калибровочный график, откладывая концентрации номинальные против фактора отклика анализируемого (площадь пика [Аналит] / площадь пика [внутренний стандарт]) с помощью программного обеспечения масс-спектрометра.
    2. Установите калибраторы использованием квадратичной аппроксимации в сочетании с 1 / X взвешивания.
  2. Для количественной такролимуса в сухих пятен крови интегрировать такролимус и внутренний стандарт пики в извлеченных MRM хроматограмм. Рассчитать коэффициент отклика для такролимуса (площадь пика [аналита] / площадь пика [внутренний стандарт]) и сравнить с калибровочной кривой с использованием масс-спектрометрии программное обеспечение.

5. Процедуры валидации

  1. Нижний предел обнаружения (LLOD) и нижний предел количественного (LLOQ).
    1. Рассмотрим самую низкую концентрацию такролимусом с соотношением пик-шум 4: 1 в качестве нижнего предела обнаружения (LLOD). Определить нижний предел количественного (LLOQ) в качественизкая концентрация по калибровочной кривой с точностью, равной или лучшей, чем ± 20% отклонения от номинальной концентрации и точности, равной или выше, чем 20% (коэффициент дисперсии).
  2. Внутри- и дня точность и уточнений.
    1. Испытание точность и четырех уровней концентрации 2 нг / мл (QC1), 4 нг / мл (QC2), 20 нг / мл (QC3) и 40 нг / мл (Qc4).
    2. Подготовка образцов КК на каждый день проверки в человеческой цельной крови с ЭДТА, сушат на фильтрующих карт, экстракта и анализируют, как описано выше.
    3. Определить точность внутри-дневной и точность, с 6 образцов в уровне концентрации КК.
    4. Оценка точности между дневной и точность в течение 20 дней. Измерьте каждый уровень контроля качества с 4 образцов каждый день.
    5. Анализ двух калибровочных кривых вместе с образцами КК на каждый день.
    6. Рассчитать точность внутри-дневной как% от номинальной концентрации (шесть образцов на уровне концентрации, пожалуйста, см 5.2.2). CalcУлате точность как коэффициент дисперсии (CV%).
    7. Рассмотрим точность внутри дня приемлемым, если он попадает в принятие ограничивает 85% до 115% от номинальной концентрации. Рассмотрим внутри-дневной точность приемлемым, если он равен или лучше, чем CV (коэффициент дисперсии) в 15%.
    8. Рассчитать точность среди дня и точность как среднее для каждого уровня концентрации анализируемого QC над 20 дней проверки.
    9. Рассмотрим среднее точность между день приемлемой, если она попадает в принятие ограничивает 85% до 115% от номинальной концентрации. Рассмотрим между день точности приемлемо, если он равен или лучше, чем CV (коэффициент дисперсии) в 15%.
  3. Исключение матричных помех.
    1. Для исключения помех, которые могут быть вызваны матричных сигналов, анализа пустые сухих пятен крови (8 разных людей, предпочтительно 4 мужчин и 4 женщины).
    2. Осмотрите ионные хроматограммы. Если пики в пределах времени удерживанияОкно такролимуса обнаружены, интегрировать и сравнивать их площади под кривой с тех такролимуса пиков в чистых проб с шипами такролимуса в LLOQ. Площадь пиков в чистых проб не должны превышать 15% от тех, такролимуса в LLOQ.
  4. Ион подавление / усиление ионом.
    1. Используйте протокол вливания пост-столбца, как описано 45 для оценки потенциального вмешательства повышения ионной подавление / ионов, вызванные совместно элюирование компонентов матрикса.
    2. Наполните такролимус в концентрации 10 мкг / мл, растворенные в 0,1% муравьиной кислоты: метанол (30:70, об / об) пост-колонки со скоростью 10 мкл / мин.
      1. Подключение шприцевого насоса через тройник между аналитической колонки и электрораспылением источник масс-спектрометра.
      2. Монитор интенсивности МС / МС сигнала MRM переходов для такролимуса и его внутренний стандарт (м / Z = 826,6 → 616,2 и м / Z = 829,6 → 619,2) после инъекции ExtracТед пустые образцы (N = 8 образцов из разных людей).
        Примечание: При отсутствии улучшения ионный подавление / ионов непрерывный сигнал вызван вливанием анализируемых не должны быть затронуты инъекции пустой матрицы, в то время как подавление ионного вызывает падение сигнала и ионов повышения пика.
  5. Переноситься.
    1. Оценка потенциального перенесение анализируя извлечены пустые образцы после самых высоких калибраторов (50 нг / мл, п = 6).
    2. Осмотрите ионные хроматограммы. Если пики в пределах времени удерживания окне такролимуса обнаружены, интегрировать и сравнивать их площади под кривой с тех такролимуса пиков в чистых проб с шипами такролимуса в LLOQ. Площадь пиков в чистых проб не должны превышать 15% от тех, такролимуса в LLOQ.
  6. Добыча восстановление.
    1. Определить извлечения путем сравнения сигналов аналитов после извлечения QC СэмаПлес на всех четырех уровнях концентрации (п = 6) за концентрации с тем, пустых сухих пятен крови шипами с соответствующими количествами такролимуса после экстракции.
    2. Подготовьте четыре набора КК (уровни концентрации: 2, 4, 20, 40 нг / мл).
    3. Подготовьте еще 4 комплекта соответствующих испытательных образцов "восстановления", определяя 50 мкл ЭДТА заготовки цельной крови на фильтровальной бумаги карт и сушки в течение 2 ч.
    4. Далее, как для контроля качества и пустых "тестовых образцов восстановления", вырезать всю пятно крови на фильтровальной карты с ножницами и поместить в результате диски в полипропиленовую трубку с коническим днищем и оснастки на крышке.
    5. Извлечение всех образцов.
    6. Передача супернатанты (400 мкл) в стеклянные флаконы ВЭЖХ.
    7. Добавить такролимус маточного раствора с пустыми »образцов экстрагировали восстановления" для достижения концентрации 2, 4, 20 и 40 нг / мл (4 мкл 200, 400, 2000, 4000 нг / мл циклоспорин фондовой зольutions к 400 мкл надосадочной жидкости).
    8. После анализа ЖХ-МС / МС, сравнить сигналы в обоих образцах КК и «образцов восстановления" в соответствующей концентрации (восстановление% = сигнал образцы шипами, прежде чем образцы добыча / сигнал шипами после экстракции х 100).
  7. Целостность Разведение.
    1. Установление целостности разбавления с помощью пробы с шипами аналитов в 500, 250 и 100 нг / мл.
    2. После экстракции разбавленным образцы, используя осаждение белка решение (1:10, п = 3 на уровень концентрации).
    3. Рассчитать отклонения от номинальных концентрациях. Рассмотрим результаты, которые находятся в пределах 85% -115% от номинального приемлемым.
  8. Стабильность.
    1. Исследовать стабильностью, используя образцы QC на всех четырех уровней концентрации (N = 4 в концентрации) анализировали в различных временных точках и при различных условиях хранения.
    2. Сравните результаты после хранения с номинальными значениями. Рассмотрим RРЕЗУЛЬТАТЫ, которые входят в 85% -115% от номинального приемлемым.
    3. Установление стабильности образцов в течение 1 недели при температуре окружающей среды, 1 неделю при 4 ° С, 1 месяца при -20 ° С и 1 месяц при -80 ° С.
    4. Тест на стабильность при замораживании-оттаивании в течение трех циклов (20 ° C). Тест извлечены выборки и стабильность пробоотборник путем размещения образцов в термостатированный пробоотборником доводили до 4 ° С. Вводите образцы после 72 часов.

Результаты

Типичные ионные хроматограммы холостой пробе, образец шипами на нижнем пределе квантификации и образца пациента показаны на рисунке 3.

Калибровочные кривые

Нижний предел обнаружения был 0,5 нг / мл, а нижний предел количественного соста?...

Обсуждение

Хотя, как указано выше, концепция терапевтического препарата и приверженности мониторинга такролимуса на основе сухих пятен крови является привлекательным, есть аналитические проблемы, которые выходят за рамки тех, как правило, связаны с анализом ЖХ-МС / МС такролимуса в венозной ЭДТА...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
TacrolimusU.S. Pharmacopeial Convention1642802
D2,13C-TacrolimusToronto Research Chemicals Inc.F370002
Red blood cellsUniversity of Colorado HospitalW20091305500 V
PlasmaUniversity of Colorado HospitalW2017130556300Q
Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9%Sigma-Aldrich439126-4 L
Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificA955-4
Isopropanol 99.9%, HPLCFisher ScientificBP2632-4
Methanol Optima LC/MSThermo Fisher ScientificA452-4
Water Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificW6-4
Formic acidThermo Fisher ScientificA118P-500
Phosphate-buffered saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Zinc sulfateThermo Fisher ScientificZ68-500
0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008649
1.5 ml Eppendorf tubeThermo Fisher Scientific02-682-550
10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008651
10 μl pipet tips with filter, sterileNeptuneBT 10XLS3
100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008653
100 μl pipet tips with filter, sterileNeptuneBT 100
1,000 μl pipet tips with filter, sterileMultimax2940
2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008650
2 ml Eppendorf tubeThermo Fisher Scientific02-681-258
20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008652
20 μl pipet tips with filter, sterileGeneMateP-1237-20
200 μl pipet tips with filterMultimax2938T
200 μl pipet tips with filter, sterileMultimax2936J
50 ml Falcon tubeBD Falcon352070
300 μl inserts for HPLC vialsPhenomenexARO-9973-13
Balance PR2002Mettler Toledo1117050723
Balances AX205 Delta RangeMettler Toledo1119343379
Bullet Blender HomogenizerNext AdvanceBBX24
Centrifuge Biofuge FrescoHeraeus290395
Disposable WipesPDIQ55172
Glass v ials, 4 mlThermo Fisher Scientific14-955-334
Glass vials, 20 mlThermo Fisher ScientificB7800-20
Gloves, nitrileTitan Brand Gloves44-100S
HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clearPhenomenexARO- 9921-13
Lids for HPLC vialsPhenomenexARO- 8952-13-B
Needle, 18 G 1.5Precision Glide305196
Rack for Eppendorf tubesThermo Fisher Scientific03-448-11
Rack for HPLC VialsThermo Fisher Scientific05-541-29
Steel beads 0.9 – 2 mmNext AdvanceSSB14B
Storage boxes for freezers / refrigeratorsThermo Fisher Scientific03-395-464
Standard multi-tube vortexerVWR Scientific Products658816-115
Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PKGE Whatman 2016-05
AutosamplerCTC PAL PAL.HTCABIx1
Binary pump, Agilent 1260 InfinityAgilent Technologies1260 G1312B
Binary pump, Agilent 1290 InfinityAgilent Technologies1290 G4220A
Micro vacuum degasser, Agilent 1260Agilent Technologies1260 G13798
Column oven,  Agilent 1290 with 2 position Agilent Technologies1290 G1216C
Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valveAgilent Technologies1290 G1316C
HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mmPhenomenex820950-926
HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mmPhenomenex993967-906
Tandem Mass Spectrometer
API5000 MS/MS with TurboIonspray sourceAB Sciex4364257
Mass spectrometry softwareAB SciexAnalyst 1.5.1

Ссылки

  1. Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
  2. Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
  3. Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
  4. . Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
  5. . A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
  6. Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
  7. Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group.. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
  8. Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
  9. Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
  10. Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
  11. Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
  12. Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
  13. Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L., Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. e. b. b. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. , 529-562 (2005).
  14. Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
  15. Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
  16. Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
  17. Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
  18. Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
  19. Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
  20. Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
  21. Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10 (6), 712-720 (2006).
  22. Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
  23. Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
  24. Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
  25. Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
  26. Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
  27. Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
  28. Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
  29. Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
  30. Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
  31. Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
  32. Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
  33. Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
  34. Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
  35. Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
  36. Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
  37. Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
  38. Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
  39. Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
  40. Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
  41. Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
  42. Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
  43. Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
  44. Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
  45. Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
  46. Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
  47. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

105

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены