Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.

Abstract

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.

Introduction

الأشكال ورم أرومي دبقي (GBM) هو الأكثر شيوعا (60٪) ورم في المخ الأولية في البالغين، مع بقاء متوسط ​​15-21 شهرا عندما تعامل مع الجراحة، العلاج الإشعاعي، والعلاج الكيميائي 1. علاجات جديدة لGBM أمر لا بد منه. تتطلب العلاجات التجريبية اختبار في النماذج الحيوانية التي تتكاثر على نحو كاف السمات البارزة من الأمراض التي تصيب البشر. استراتيجيات للحث على GBM في ما يلي القوارض الطفرات الكيميائية مع وكلاء مؤلكل، سلالة الجرثومية أو تغيرات جينية جسدية، أو زرع باستخدام خطوط الخلايا دبقي 2. النماذج الأكثر شيوعا توظف غرس خطوط الخلايا دبقي، إما orthotopically، في الدماغ أو تحت الجلد باستخدام خلايا مسانج في الحيوانات مع راثى متطابقة. أو خلايا xenogeneic، خطوط الخلايا GBM الأكثر شيوعا الإنسان، مزروع في المناعي للخطر الفئران 3. Xenografts تقدم العديد من المزايا لدراسة الأورام داخل الجمجمة: راحة استنساخ، standaمعدلات النمو rdized، وقت وفاة والأورام توطين. ومع ذلك، فإن هذه النماذج لديها قيود بسبب النهج الاصطناعي، والغازية الجراحية المستخدمة لزرع وقدرة محدودة على إعادة إنتاج بدقة النسيجية السمات المميزة لGBM البشري (الصف منظمة الصحة العالمية IV): شبه pallisading نخر، atypias النووية، والغزو منتشر، الانتشار الأوعية الدموية الصغيرة وتشكيل الأوعية الدموية glomeruloid شذوذ 4-7. تحريض GBM عن طريق تغيير جينوم الخلايا الجسدية مع DNA أنكجنيك، إما مع ناقلات فيروسية 8-12، أو مع بوساطة ينقول التكامل 13، يستنسخ أكثر عن كثب مسببات الأمراض التي تصيب البشر ويلخص ميزات HISTO المرضية من GBM البشري.

تاريخيا، أورام الجهاز العصبي المركزي وقد تم تصنيفها على أساس الخلية ينظر المنشأ، والتي لوحظ، سيكون عاملا التنبؤي للبقاء على قيد الحياة 14. وتصنف GBMS في الابتدائي والثانوي. الناشئة أدلة تودAY يشير إلى طبيعة غير متجانسة للغاية من ورم أرومي دبقي الأساسي 15. GBM الثانوي (15٪)، نتيجة التحول السرطاني للastrocytomas الدرجة المنخفضة (WHO الصف الأول) وastrocytomas anaplasic (WHO الصف الثاني)، وترتبط مع بداية سابق من هذا المرض، وتحسين أحوال الطقس ونمط "proneural" في التعبير الجيني ، في حين GBM الأساسي (85٪) تظهر بداية الراحل، وسوء أحوال الطقس والدبقية (الكلاسيكية)، العصبية أو أنماط التعبير الوسيطة. إذا كانت هذه أنماط التعبير الجيني ترتبط مع الخلية الفعلية منشأ الورم لا يزال قيد التحقيق بنشاط. تراكم البيانات يدل على أن الجمع بين الطفرات الجينية المرتبطة GBMS هم التنبؤي من أجل البقاء. على سبيل المثال، ترتبط فقدان heterozygocity (LOH) من الكروموسومات 1P / 19q، والطفرات IDH1، PDGFRα التكبير، مع GBMS الثانوي، نمط التعبير proneural وأفضل التكهن، في حين EGFR overexpression، الشق وسونيك تفعيل مسار القنفذ، NFوترتبط 1 و PTEN الخسارة والطفرات من البروتين p53 مع العصبية، الكلاسيكية، أو GBM الأساسي الوسيطة وأسوأ التكهن 16،17. ظهور مشاريع التسلسل واسعة النطاق وتراكم العديد من عينات المرضى متوفرة للاختبار يجلب ثروة من المعلومات الجديدة فيما يتعلق الطفرات الوراثية ومسارات المتورطين في GBM المرضية والتقدم وإمكانية الطب الفردي، حيث العلاجات يمكن أن تكون مصممة خصيصا ل تشوهات الوراثية للمريض. في نهاية المطاف، لتقييم القيمة التنبؤية لهذه الطفرات والممرات بطريقة منهجية، واختبار العلاجات الممكنة في كل حالة، يتطلب نماذج حيوانية من GBM مع تغيرات جينية محددة مسبقا. ينقول التكامل بوساطة من الحمض النووي الجيني يقدم نهجا عمليا.

كان النوم نظام ينقول الجمال، عضو TC1 / فئة بحار من الترانسبوزونات، "أيقظ" (شيد) في متعددة الخطوات اإلجراءاتSS من الطفرات الموقع محددة من الجين ترانسبوزاز salmonoid، والتي أصبحت نائمة أكثر من 10 مليون سنة مضت 18،19. في جوهرها، الترانسبوزونات DNA يحيط بها سلاسل محددة (يكرر مقلوب / يكرر المباشرة: IR / DR) ويمكن دمجها في الجينوم في "قص ولصق" الطريقة عن طريق نشاط ترانسبوزاز الجمال النائم. وترانسبوزاز يعترف ينتهي من المواقع الأشعة تحت الحمراء، المكوس وينقول ويدمج بشكل عشوائي في الموقع DNA آخر بين القواعد T و A، والقواعد التي تتكرر في كل نهاية ينقول خلال تبديل (الشكل 1A). وتتألف ترانسبوزاز الجمال النائم من ثلاثة مجالات، وهي ملزمة ينقول المجال تسلسل توطين النووية ومجال الحفاز. يرجى ملء أربعة جزيئات ترانسبوزاز لجلب طرفي ينقول معا والسماح للتبديل، ولكن إذا الكثير من جزيئات ترانسبوزاز موجودة، فإنها يمكن أن dimerize وtetramerize لمنعرد الفعل تبديل 20. يتطلب رد فعل تبديل كفاءة والنسبة المثلى من ترانسبوزاز إلى الترانسبوزونات. يمكن أن يتم تسليم DNA ترميز ترانسبوزاز على نفس بلازميد مع ينقول (في رابطة الدول المستقلة) أو على البلازميد مختلفة (في العابرة). لضمان النسبة المثلى بين ترانسبوزاز والترانسبوزونات، المروج مع النشاط الكافي ويمكن اختيار لتعبير عن ترانسبوزاز (ل"رابطة الدول المستقلة" نموذج) أو نسبة من البلازميدات في حل الحقن يمكن أن يكون الأمثل (ل نموذج "المتحولة"). والنوم نظام ينقول الجمال يمكن استخدامها بنجاح لعلم الجينوم وظيفية، والطفرات إقحامي، transgenesis والعلاج الجيني الجسدي 21. ويجري بناء الاصطناعية إعادة تصميم لجزيء وظيفية من البديل salmonoid نائمة، وترانسبوزاز الجمال النائم لا ربط الترانسبوزونات أخرى في البشر أو غيرها من الثدييات 20. منذ اكتشافه، والهندسة الجزيئية لها تعزيز إمكانيةإد فعالية تبديل النظام ينقول SB من خلال التغييرات في تسلسل IR وإضافة dinucleotides TATA المرافقة ينقول، مما أدى في الترانسبوزونات PT2. وقد الأمثل هذه الترانسبوزونات ملزم للSB الى الموقع IR وزيادة فعالية الختان. كما خضع ترانسبوزاز SB تحسنا كبيرا. وترانسبوزاز المستخدمة في التجارب المقدمة في هذه الوثيقة هو SB100X، وهو ترانسبوزاز مفرط الناتجة عن استراتيجية خلط DNA يليها شاشة الوراثية على نطاق واسع في خلايا الثدييات 22.

في هذا التقرير نقدم طريقة سريع، وتنوعا وقابلة للتكرار للحث جوهري GBM في الفئران مع غير الفيروسية، والتكامل بوساطة ينقول من DNA البلازميد في الخلايا من منطقة البطين-فرعية من الفئران حديثي الولادة 23. نقدم طريقة بسيطة لخلق الترانسبوزونات مع جينات جديدة قابلة للتكامل الجيني باستخدام ترانسبوزاز الجمال النائم وشرح كيفية مراقبة امتصاص البلازميد وتطور المرض باستخدام تلألؤ بيولوجي. نحن أيضا تميز النسيجية والمناعية النسيجية ملامح GBM تتكرر مع هذا النموذج. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم وسيلة سريعة لتوليد خطوط الخلايا GBM الأولية من هذه الأورام. نموذج الجمال النائم، والتي تنجم أورام من الخلايا الأصلية للحيوان، ويسمح التقييم الوظيفي للدور المرشح الجينات GBM في تحريض وتطور الأورام. كما يناسب هذا النظام بشكل جيد لاختبار العلاجات GBM جديدة، بما في ذلك العلاجات المناعية في الفئران المناعية المختصة، من دون الحاجة إلى عمليات جراحية التهابات الغازية، الأمر الذي قد يغير المكروية المحلية.

Protocol

ملاحظة: وقد تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوان من جامعة ميشيغان جنة لاستخدام ورعاية الحيوانات (UCUCA).

1. الاستنساخ من تسلسل الاهتمام في نيو النوم ترانسبوزونات الجمال

ملاحظة: لإدراج الجينات أو العناصر المثبطة (كما shRNA) باستخدام نظام النوم ترانسبوزاز الجمال، استنساخ تسلسل الفائدة في العمود الفقري لPKT أو PT2 البلازميد. توجيه الاستنساخ مثل أن العناصر التنظيمية، والجينات في المصالح وعلامات تظل يحيط بها يكرر مقلوب (IR / DR). مثال على استنساخ PDGFβ إلى هو مفصل أدناه العمود الفقري PKT (انظر أيضا الشكل 1B).

  1. هضم 5 ميكروغرام من ناقلات البلازميد PKT-IRES-Katushka لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية مع 5-10 وحدات من XbaI / XhoI أنزيمات التقييد في 50 ميكرولتر من حجم رد الفعل.
  2. هضم mPDGFβ [كدنا من 5 ميكروغرام من البلازميد pGEM-T- mPDGFβ لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية مع 5-10 وحدةالصورة من جنة التحقيق الوطنية السودانية / ساسي الانزيمات قيود.
  3. ترسيب الحمض النووي الكلي بإضافة 2.5 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪، و1/10 حجم 3 M نا خلات، ودرجة الحموضة 5.8 واحتضان بين عشية وضحاها في -20 ° C.
  4. أجهزة الطرد المركزي العينات في 13،800 x ج لمدة 15 دقيقة.
  5. غسل بيليه الحمض النووي مع 500 ميكرولتر من الايثانول 70٪، الطرد المركزي في 13،800 x ج لمدة 1 دقيقة، كرر مرة واحدة واعادة تعليق في 19 ميكرولتر من المياه مجانا الدناز العقيمة.
  6. اتبع تعليمات الشركة الصانعة في تصد كيت السريع لفظة نهايات كل من ناقلات (PKT-IRES-Katushka) وتضاف (mPDGFβ).
  7. تحميل ناقلات اضعافها وتضاف على 1.2٪ بروميد إيثيديوم الملون agarose هلام وتشغيلها في 80 V لمدة 40 دقيقة. تصور العصابات، واستئصال لهم نظيفة الحلاقة شفرة وهلام تنقية الحمض النووي باستخدام طقم تنقية جل وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
  8. Ligate إدراج وناقلات DNA تنقية في الخطوة 1.7 عن طريق إضافتها في أنبوب في نسبة 4: 1 المولي (إدراج: ناقلات). في هذا الأنبوب، صipette 1 ميكرولتر من T4 يغاز و 2 ميكرولتر من T4 يغاز العازلة (التي تحتوي على ATP)، وضبط مستوى الصوت إلى 20 ميكرولتر مع الماء المعقم. احتضان رد فعل لمدة 18 ساعة ربط في 16 ° C.
  9. تحويل الخلايا البكتيرية DH5α المختصة كيميائيا مع المنتجات و ligated.
    1. ذوبان الجليد الخلايا المختصة على الجليد.
    2. إضافة وحدة التخزين بالكامل من رد فعل ربط إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة، هز بلطف أنبوب واحتضان هذا المزيج على الجليد لمدة 30 دقيقة. للحرارة صدمة البكتيريا لمدة 45 ثانية في 42 درجة مئوية، والعودة فورا إلى جليد. احتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة أخرى.
    3. إضافة 950 ميكرولتر من مرق لوريا للثقافة واحتضان مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. البكتيريا الطرد المركزي في 2،400 x ج لمدة 3 دقائق وإعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من LB.
    4. انتشار البكتيريا تتحول على طبق بتري المغلفة مع LB-الاغاروز والمضادات الحيوية المماثلة. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    5. وأخيرا، وجمع 5-10 bacteالمستعمرات الريال والثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5 مل من LB وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية.
    6. تنقية DNA البلازميد باستخدام مصغرة عدة DNA البلازميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. إجراء قيود التشخيص هضم للتحقق من التأسيس السليم للإدراج في ناقلات وتقديم استنساخ إيجابية لتسلسل الحمض النووي لضمان التوجه الصحيح للإدراج.
  10. حدد المستعمرات الصحيحة وزيادة إنتاج الحمض النووي باستخدام عالية الجودة، والذيفان الداخلي خالية بلازميد إعداد عدة.
  11. أزل الحمض النووي في الماء المعقم أو 1 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك. متجر DNA في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للحقن في حديثي الولادة.

2. البينية البطين حديثي الولادة الحقن

  1. ثلاثة إلى أربعة أسابيع قبل أن يجرب، وإنشاء الماوس تربية قفص مع ذكر واحد وأنثى واحدة الماوس، والبلاستيك الملونة القباني. وهذا يوفر بيئة غنية ويساعد في عملية التزاوج.
  2. عندما يتم تأكيد الحمل، وإزالة ممزر إلى قفص جديد. بعد ثمانية عشر يوما التزاوج، ومراقبة القفص يوميا للتسليم. أداء الحقن داخل البطين في يوم ما بعد الولادة 1 (P1).
  3. إعداد الحل الحقن
    ملاحظة: يتم حل حقن عن طريق خلط DNA البلازميد مع كاشف ترنسفكأيشن لخلق الجسيمات لترنسفكأيشن. فيما يلي مثال على إعداد الحل الحقن باستخدام ترميز البلازميد في ترانسبوزاز الجمال النائم وluciferase المراسل: PT2 / SB100x لوك واثنين من البلازميدات ينقول: PT / CAGGS-NRASV12 و PT / CMV-SV40-LGT، بنسبة 1: 2: 2. جميع البلازميدات لديها تركيز 2 ميكروغرام / ميكرولتر. يتم عرض تفاصيل مهمة على إعداد الحل الحقن في مناقشة.
    1. تحضير محلول الحمض النووي عن طريق إضافة: 4 ميكروغرام (2 ميكرولتر) من PT2 / SB100x لوك، 8 ميكروغرام (4 ميكرولتر) من PT / CAGGS-NRASV12 و 8 ميكروغرام (4 ميكرولتر) من PT / CMV-SV40-LGT و 10 ميكرولتر 10٪ نسبة الجلوكوز إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر بتركيز 1 ميكروغرام / ملDNA و 5٪ جلوكوز.
    2. إعداد الحل PEI بإضافة 2.8 ميكرولتر من المجراة طائرة PEI، 7.2 ميكرولتر من الماء المعقم، و 10 ميكرولتر من 10٪ الجلوكوز إلى تركيز النهائي من 5٪ جلوكوز.
    3. إضافة الحل PEI إلى حل DNA، ومزيج دوامة وترك الجلوس في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة. والحل هو الآن على استعداد للحقن. بعد ساعة واحدة على RT، والحفاظ على حل على الجليد.
    4. تناسب 10 ميكرولتر حقنة نظيفة مجهزة قياس 30 إبرة تحت الجلد مع 12.5 ° شطبة في micropump (الشكل 2 # 1).
  4. للتحقق من حسن سير العمل في نظام الحقن، واستخدام محقن التلقائي (الشكل 2 # 1) لسحب 10 ميكرولتر من الماء في حقنة ثم إفراغ الحقنة تماما
  5. تبريد مرحلة التجسيمي حديثي الولادة (الشكل 2 # 3) مع الطين من الجليد الجاف والكحول لدرجة حرارة 2-8 درجة مئوية.
  6. لحث التخدير عن طريق وضع الجراء على الجليد الرطبلمدة 2 دقيقة. ستواصل التخدير على الإطار التجسيمي المبردة للفترة المتبقية من هذا الإجراء. الحفاظ على درجة حرارة الإطار فوق درجة التجمد، بين 2-8 درجة مئوية وتفادي وقوع إصابات الحروق الحرارية. كما الجراء الاحتياطات الخاصة يمكن أن تكون ملفوفة في الشاش قبل وضع على الجليد الرطب.
  7. ملء المحاقن مع الحل DNA / PEI.
  8. شل الجرو في إطار التجسيمي عن طريق وضع رأسه بين الشاش تغطيها القضبان الأذن (الشكل 2B). تأكد من أن الجانب الظهري من الجمجمة هو أفقي، موازية لسطح الإطار، والتي الغرز في الجمجمة واضحة للعيان. مسح الرأس مع الايثانول 70٪.
  9. خفض إبرة المحقنة وضبط الإحداثيات التجسيمي باستخدام بطلب من الإطار التجسيمي حتى تلامس الإبرة قيمة لامدا (تقاطع خط الوسط من الجدارية القفوية والعظام) (الشكل 2B).
  10. رفع الإبرة وضبط الإحداثيات التجسيمي إلى 0.8 ملم الجانبي و 1.5 مترم منقاري إلى امدا (الشكل 2B).
  11. خفض الإبرة حتى يلمس والدمامل قليلا الجلد. قياس الإحداثيات. خفض إبرة 1.5 ملم أخرى. سوف إبرة تخترق الجلد والجمجمة، وتمر عبر القشرة لدخول البطين الجانبي (الشكل 2C).
  12. باستخدام محقن التلقائي، وضخ 0.75 ميكرولتر من محلول الحمض النووي / PEI بمعدل 0.5 ميكرولتر / دقيقة
  13. إبقاء الجرو على الإطار لمدة دقيقة أخرى لإتاحة الفرصة لإيجاد حل لتفريق إلى البطينين. في غضون ذلك، تخدير الجرو آخر، على الجليد لمدة 2 دقيقة في التحضير للحقن المقبل.
  14. بلطف وببطء رفع الإبرة، ووضع الجرو تحت مصباح التدفئة. مراقبة التنفس والنشاط. إذا لزم الأمر، وتوفير التحفيز لطيف من أطرافه حتى تستتبعه الأول التنفس.
  15. العودة الجرو لأمه بعد أن استعد، قد وصلت إلى اللون الوردي، والتنفس بانتظام ونشطة، عادة 5-7 دقيقة. إذا موإعادة من يتم حقن الجرو في وقت واحد، والحفاظ على جميع الجراء معا حتى تتم جميع الحقن. إذا الحقن يستغرق وقتا أطول من 30 دقيقة، والعودة من نصف الجراء بعد دقيقة 30 الأول وبقية في نهاية هذا الإجراء.
  16. مراقبة أن السد هو استجابة ورعاية ودعم لالجراء لها. إذا لزم الأمر، إضافة أمي البديلة إلى القفص.
  17. ضمان أن الفاصل الزمني بين وضع الجرو على الجليد ووضعه تحت مصباح الاحترار هو أقل من 10 دقيقة. وأسرع الإجراء كان ذلك أفضل للبقاء على قيد الحياة. عادة، والوقت الذي يستغرقه لتخدير وحقن الجرو هو 4 دقائق.

3. ضوء بارد رصد تشكيل الورم والتقدم

3.1) رصد البلازميد امتصاص بعد حقن

  1. 24-72 ساعة بعد الحقن، وإزالة جميع الجراء من قفص الأم ومكان في 6 نظيفة جيدا طبق زراعة الأنسجة، والجرو واحد لكل بئر.
  2. إعداد 30 ملغ / مل من حل وسيفيرين المذاب في محلول ملحي أو الفوسفاطالبريد العازلة. يعد هذا الحل مقدما والبقاء على مأخوذة صغيرة في -20 ° C.
  3. باستخدام حقنة 1 مل مجهزة قياس 30 إبرة تحت الجلد حقن 30 ميكرولتر من وسيفيرين تحت الجلد بين الكتف من الجرو. تأكد من أن إبرة لا تخترق أي أجهزة، عن طريق معسر الجلد ورفعه قليلا قبل إدخال الإبرة.
  4. الصورة فورا، وذلك باستخدام في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي نظام التصوير. لطيف IVIS، استخدام الإعدادات التالية لعمليات الاستحواذ: التعرض التلقائي، binning كبير، وفتحة F = 1.

3.2) تشكيل رصد الورم والتقدم

ملاحظة: سوف تبدأ الحيوانات تكوين الاورام العيانية للكشف من قبل تلألؤ بيولوجي والأنسجة داخل 2½-6 أسابيع، اعتمادا على البلازميدات أنكجنيك حقن.

  1. باستخدام حقنة 1 مل مزودة إبرة قياس 26 حقن 100 ميكرولتر من 30 ملغ / مل حل وسيفيرين داخل peritoneally.
  2. وضع الحيوان في غرفة التخدير. ضخ ما يصل إلى خمسة حيوانات في نفس الوقت.
  3. انتظر 5 دقائق ثم بدء تدفق الأوكسجين / الأيزوفلورين (1.5-2.5٪ الأيزوفلورين) لتخدير الحيوانات. بعد 3-4 دقائق، وإزالة الحيوانات من غرفة التخدير، وبدء تدفق الأوكسجين / الأيزوفلورين في غرفة تلألؤ بيولوجي. وضع الحيوانات في فتحات منها مجهزة المخاريط الزجاج الأنف للسماح للتخدير والمرور دون عائق للضوء.
  4. عادة، والحصول على سلسلة من 6 صور، في 2 دقيقة مع فترات ومدة التعرض التلقائي، binning متوسط ​​وفتحة المفتوحة و = 1.
  5. تعيين المنطقة من الفائدة لجميع الحيوانات تصويرها، وعادة بيضاوي على منطقة الرأس، وقياس كثافة التلألؤ باستخدام وحدات الفوتونات معايرة / ق / سم 2 / ريال.
  6. تسجيل القيمة القصوى لكل حيوان. وفي وقت لاحق، يمكن مقارنة التسجيلات خلال تطور الورم لكل حيوان و / أو بين الحيوانات، على سبيل المثال عرجن يعملون العلاجات المختلفة.

4. التركيب النسيجي والمناعى تحليل جديد GBMS

ملاحظة: عندما وصلت إلى أورام المطلوب التجريبية الوقت نقطة، والحيوانات يمكن التضحية، والعقول perfused ل، الثابتة وتحليلها. من أجل البقاء يحلل تمثل مرحلة الاحتضار نقطة نهاية التجربة، وعندما يتم التضحية الحيوانات معاملة إنسانية في أول علامات عبء الورم، على النحو المحدد في المرحلة السريرية عندما يصبح الحيوان تبين أعراض ضعف الحركة، وموقف منحنية والفراء ضيع. ويرد وصف موجز لأساليب النسيجية والمناعية النسيجية القياسية المستخدمة أدناه.

4.1) الإرواء والتثبيت

  1. تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 ملغم / كغم من زيلازين.
  2. تحقق منعكس دواسة عن طريق معسر القدم من الفأرة. عندما يتم إلغاء هذا المنعكس، مشيرا إلى التخدير العميق، IMMOBilize الماوس على لوحة التشريح مع دبابيس، وفتح تجويف البطن، تشريح الحجاب الحاجز وفتح التجويف الصدري لتصور القلب.
  3. إدراج حادة قياس 20 قنية إلى البطين الأيسر من القلب. توصيل قنية مع أنابيب بلاستيكية تمر مضخة تمعجية إلى حاوية مع حل تايرود المؤكسج وheparinized (0.8٪ كلوريد الصوديوم، 0.0264٪ CaCl 2 2H 2 O، 0.005٪ ناه 2 PO 4، 0.1٪ الجلوكوز، 0.1٪ NaHCO 3، 0.02 ٪ بوكل). بدء تدفق حل تايرود عن طريق ضبط سرعة مضخة تمعجية لضمان تدفق بطيء ومستمر، قطرة واحدة تقريبا في الثانية أو أقل إذا الحيوانات هي أصغر.
  4. إجراء شق صغير في الأذين الأيمن من القلب للسماح نزيف الدم وعلى تايرود.
  5. مراقبة كفاءة الارواء من خلال مراقبة ابيضاض من الأعضاء الداخلية (الأكثر وضوحا في الكبد والكلى) عندما تصبح خالية من الدم.
  6. عندماحل استنزاف من القلب هو واضح (3-5 دقيقة)، والتحول من الحلول لتايرود إلى 4٪ بارافورمالدهيد لتثبيت (4٪ PFA، ودرجة الحموضة 7.34 في الفوسفات مخزنة المالحة).
  7. مراقبة التثبيت الجيد للأنسجة التي كتبها جمود زيادة من الرقبة والذيل.
  8. قطع رأس الفأر وتشريح بعناية الدماغ من الجمجمة.
    1. سحب الفراء الذي يغطي الجمجمة rostrally، نحو الأنف، والاستيلاء عليها بقوة لتحقيق الاستقرار في الرأس، حتى الجانب الظهري.
    2. باستخدام مشرط حاد، وقطع أسفل على طول حافة المدار، إلى القطع العضلات المدارية والأقواس الوجني الأساسية.
    3. بدوره رئيس الجانب بطني حتى وإزالة عضلات الرقبة المرفقة باستخدام مقراض. سحق فقرة الأولى وإزالته من جذع الدماغ.
    4. تصور القوقعة، والاستيلاء على العظم الصدغي المغطي مع مقراض وخلق الافتتاح بين العظم الصدغي والقذالي. تقشر عظم القذالي من سطح المخيخ.
    5. سحق العظم المغطي الأنف مع مقراض. إزالة بعناية أمامي المتبقية والجداري العظام من سطح الدماغ لأنها تدرك عدم الإضرار سطح الدماغ. إيلاء اهتمام خاص في المنطقة المدارية.
    6. تحويل رأس بطني حتى الجانب. سوف الدماغ تنزلق من تبقى من الجمجمة، وترتبط الآن فقط من خلال الأعصاب القحفية. قطع باستخدام مقص صغير على حاسة الشم، والأعصاب البصرية مثلث التوائم. هذا وسوف الافراج عن الدماغ.
  9. وضع الدماغ في 4٪ PFA بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية لمدة ما بعد التثبيت.
  10. للتحليل النسيجي والهيماتوكسيلين يوزين تلطيخ، ونقل العقل لعازلة الفوسفات لمدة 24 ساعة ومن ثم المضي قدما إلى تضمين البارافين.
  11. لتحليل المناعية النسيجية، ونقل العقول في حل السكروز 30٪ في الفوسفات مخزنة المالحة لمدة 24-48 ساعة (حتى أدمغة تنزل الى قاع الأنبوب)
  12. أدمغة القسم في النصف عن طريق الوسط للمنطقة الورم، ووضع قطعالجانب السلبي في قالب التجميد، تضمين في وسائل الإعلام تضمين البرد (OCT المركبة)، وفلاش للتجمد في الطين من الايثانول الجاف الجليد، isopentane الجاف الثلج أو في النيتروجين السائل. إبقاء الكتل المجمدة في -80 درجة مئوية حتى باجتزاء وتلطيخ.

4.2) الهيماتوكسيلين-يوزين تلطيخ من البارافين جزءا لا يتجزأ من العقل لتحليل-HISTO المرضية للجوهري GBMS

  1. قسم البارافين جزءا لا يتجزأ العقول في 4 ميكرون سمك، وانخفاض في 42 ° C حمام الماء وجبل على الشرائح الزجاجية.
  2. الشرائح دي paraffinize عن طريق وضعها لمدة 10 دقيقة في فرن C 60 درجة ومن ثم نقلهم إلى 5 فترات دقيقة من خلال سلسلة من ثلاث حاويات الشريحة مليئة زيلين.
  3. هيدرات الشرائح من خلال سلسلة من الحمامات الايثانول: الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة، كرر مرة واحدة، و 95٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة، كرر مرة واحدة، و 70٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة ثم نقل الشرائح في الماء.
  4. وصمة عار على الشرائح عن طريق غمس لهم في وعاء الشريحة مليئة هاريس الهيماتوكسيلين لمدة 2 دقيقة.
  5. شطف في ماء الصنبور حتى الماء هو واضح.
  6. تراجع الشرائح مرتين إلى حل الصبغة الزرقاء (0.1٪ بيكربونات الصوديوم).
  7. السماح الشرائح تقف في ماء الصنبور لمدة 2 دقيقة، ثم نقل إلى 80٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة.
  8. وصمة عار على الشرائح عن طريق غمس لهم في حاوية مليئة يوزين لمدة 5 دقائق.
  9. يذوى الشرائح في سلسلة من الحمامات الايثانول (80٪ من الإيثانول 3-4 الانخفاضات، 95٪ من الإيثانول 2 دقيقة، كرر مرة واحدة، و 100٪ من الإيثانول 2 دقيقة، كرر مرة واحدة).
  10. واضح مع 3 حمامات متتالية من الزيلين، 3 دقائق لكل منهما.
  11. ساترة مع المتوسطة المتزايدة على أساس الزيلين واسمحوا الجافة على سطح مستو في درجة حرارة الغرفة حتى جاهزة للتصوير. يخزن في درجة حرارة الغرفة.

4.3) المناعي الكيمياء النسيجية من البرد حفظا المخ جزءا لا يتجزأ من لالجزيئية والخلوية توصيف دي نوفو المستحثة GBMS

  1. استرداد القطع المجمدة من التخزين C -80 درجة، ضع في ناظم البرد والسماح للتوازن درجات الحرارة لمدة 30 دقيقة.
  2. القسم 12-14 ميكرون أبواب سميكة وجبل 2-3 أقسام على الشرائح الزجاجية موجبة الشحنة. قطع أقسام متسلسل، من خلال جمع الأجزاء المجاورة على الشرائح المختلفة. وهذا يسمح للتلطيخ مع الأجسام المضادة مختلفة على أقسام الأنسجة المجاورة داخل الورم.
  3. الشرائح الجافة في مجفف لا يقل عن 1 ساعة بعد باجتزاء للسماح لالتزام جيد من الأنسجة.
  4. خلق حاجز مسعور (مع علامة مسعور) في نهاية كل من الشريحة للسماح للسائل لتغطية أقسام والبقاء على الشريحة خلال يغسل. تغطية أقسام بمحلول مكون من الفوسفات مخزنة المالحة مع 0.1٪ تريتون-X (PBS 0.1٪ تكساس) ويهز بلطف لمدة 5 دقائق على شاكر الأفقي لpermeabilize الأنسجة. كرر مرتين.
  5. منع ملزمة انوعي بمحلول مكون من 10٪ مصل الماعز العادي (أو مصل من الحيوانات التي تم رفع الأجسام المضادة الثانوية) لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز لطيف
  6. يعد حل الأجسام المضادة الأولية في 2٪ مصل الماعز العادي في برنامج تلفزيوني 0.1٪تكساس و ماصة الحل على أقسام. وضع الشرائح في غرفة رطبة مغطاة في الظلام وتبقى في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
  7. في اليوم التالي، وغسل أقسام ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 0.1٪ تكساس واحتضان في الضد الثانوية الفلورية المخفف في PBS 2٪ مصل الماعز العادي 0.1٪ تكساس لمدة ساعة واحدة.
  8. غسل أقسام ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 0.1٪ تكساس، مباين مع وصمة النووية (على سبيل المثال، دابي) لمدة 2 دقيقة، ويغسل مرة أخرى، واضحة في مجال المياه وساترة مع المياه المستندة إلى تصاعد المتوسطة التي من شأنها الحفاظ على مضان. وضع الشرائح على سطح مستو والسماح لهم علاج لمدة لا تقل عن 24 ساعة، في الظلام، حتى جاهزة للتصوير. تبقي على 4 درجات مئوية بعد ذلك.

5. جيل من خطوط الخلايا السرطانية الأولية مع التعديلات الوراثية المحددة.

  1. لتوليد خطوط الخلايا النائمة من الفئران الحاملة للورم تحديد ماوس مع وأكد ورم كبير (تلألؤ بيولوجي 10 -10 7 8 الفوتونات / ق / سم2 / ريال سعودي).
  2. الموت ببطء الفأر مع جرعة زائدة من مخدر الأيزوفلورين، قطع رأس الحيوان وبعناية تشريح الدماغ من الجمجمة (كما هو موضح في القسم 4). وضع الدماغ في طبق بيتري نظيفة.
  3. باستخدام شفرة حلاقة، وجعل التخفيضات الاكليلية الأمامي والخلفي للورم. موقع الورم عادة ما يكون التعرف عليها نظرا لشفافية الدماغ.
  4. تشريح الورم، عادة 5-7 ملم في القطر مع ملقط غرامة ووضعه في أنبوب 1.5 مل مليئة 300 ميكرولتر العصبية وسائل الإعلام الخلايا الجذعية (NSC وسائل الإعلام: DMEM / F12 مع B-27 ملحق، ملحق N2، وNormocin، على أن تستكمل مع EGF المؤتلف البشري وbFGF بتركيز 20 نانوغرام / مل لكل منهما).
  5. التجانس بلطف الورم مع مدقة البلاستيكية، التي تناسبها على الجدران من الأنبوب.
  6. إضافة 1 مل من محلول التفكك الأنسجة الخالية من الإنزيم واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر، وغسل مصفاة مع 10 مل منوسائل الإعلام NSC، الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 4 دقائق، طاف صب وإعادة تعليق بيليه إلى 7 مل من وسائل الاعلام NSC.
  8. لوحة على قارورة ثقافة T25 والثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الأنسجة مع والغلاف الجوي من 95٪ الجوية و 5٪ CO 2. بعد 3 أيام، وقتل بعض الخلايا، وبعض انضمت إلى قاع الطبق الثقافة، وبعضها neurospheres تشكيل، وتطفو بحرية في وسائل الإعلام.
  9. إزالة هذه الخلايا مع وقف التنفيذ وإعادة لوحة على ثقافة قارورة الأنسجة T75.
  10. بعد ثلاثة أيام أخرى للثقافة، وجمع neurospheres، فصل كما هو موضح في الخطوة 5.6، سلالة من خلال مصفاة الخلية وعدد الخلايا. تجميد aliquots من الخلايا في الجنين مصل بقري 10٪ DMSO والخلايا في مناطق ذات كثافة مرور واحد مليون خلية في 14 مل من NSC تستكمل مع EGF وجمعية جيل المستقبل لقارورة T75. سوف يعتمد معدل النمو على الجينات المسرطنة المستخدمة لتوليد أورام. التكيف مع الظروف ثقافة الخلية لمنع فرط والحفاظ على خلايا بكثافة عالية نسبيا.

النتائج

لتوصيف ميزات HISTO المرضية من glioblastomas SB التي يسببها، تم حقن C57 / BL6 الفئران حديثي الولادة في P1 مع luciferase المراسل ترميز البلازميد (PT2 / SB100x لوك) في تركيبة مع البلازميدات ترميز الترانسبوزونات مع DNA أنكجنيك، أي تلك السلطات، (PT / CAGGS -NRASV12) وSV40 LGT (PT / CMVSV40-LGT) (الشكل 3C) أو ...

Discussion

في هذه المقالة، نحن بالتفصيل طريقة تنوعا وقابلة للتكرار لتوليد نماذج جديدة من GBM باستخدام التكامل SB transposase- بوساطة من DNA البلازميد أنكجنيك في الخلايا المحيطة بمنطقة subventricular من الفئران حديثي الولادة. نقدم بروتوكول لتوليد البلازميدات ينقول مع جينات جديدة من الفائدة، و...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. John Ohlfest and Dr. Stacey Decker13 for the generous gift of plasmids and for the training provided to master this method. We thank Marta Dzaman for help with standardizing the Hematoxylin-Eosin staining procedure of paraffin-embedded sections. We also thank Molly Dahlgren for perusing this manuscript and providing helpful suggestions. This work is supported by NIH/NINDS grants to MGC and PRL, Leah’s Happy Hearts Foundation grant to MCG and PRL. Alex’s Lemonade Foundation young Investigator Award and the St. Baldrick’s Foundation Fellowship to CK.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Material/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse AdaptorsStoelting51670Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable 
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)Stoelting53311Injections can be made without it, ,but    the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience
10 μL 700 series hand fitted MICROLITER syringeHamiltonModel 701This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used
30 gauge gauge hypodermic needle
(1.25", 15o bevel) 		HamiltonS/O# 197462This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced.
in vivo-jetPEIPolyplus Transfection201-10GAliquot in small volumes and keep at -20oC 
D-Luciferin, Potassium SaltGoldbio.comLuckK-1gOther sources of firefly lucifierase are just as adequate
Hematoxylin Solution, Harris ModifiedSigma AldrichHHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. CompoundElectron Microscopy Sciences62550-01for embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry
Advanced DMEM/F-12, no glutamineLife Technologies12634-010for the culture of neurospheres
B-27¨ Supplement (50X), serum free Life Technologies17504-044serum free supplement for the culture of neurospheres
N2 Supplement (100x)Life Technologies17502-048serum free supplement for the culture of neurospheres
NormocynInvivoGenant-nr-1anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres
Recombinant Human EGFPEPROTECHAF-100-15growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Recombinant Human FGF-basicPEPROTECH100-18Bgrowth factor supplement for the culture of  neurospheres
HyClone HyQTase  Cell Detachment Reagent Thermo ScientificSV3003001for the dissociation of neurospheres
Kimble-Chase Kontes Pellet PestleFisher ScientificK749510-0590for the dissociation of freshly dissected tumors
Falcon Cell Strainers mesh size 70umFisher Scientific08-771-2for generating single cell suspensions of dissociated neurospheres
Xylenes Histological gradeFisher ScientificC8H10
Protocol Harris Hematoxylin Mercury free ( acidified)Fisher Scientific245-678
Protocol Eosyn Y Solution ( intensified)Fisher Scientific314-631

References

  1. Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet. Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).
  2. Dai, C., Holland, E. C. Glioma models. Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).
  3. Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Riblet, S. M., Slagel, D. E. Human brain tumor xenografts in nude mice as a chemotherapy model. Eur J Cancer Clin Oncol. 19 (6), 799-805 (1983).
  4. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
  5. Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. J Neurooncol. 85 (2), 133-148 (2007).
  6. Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
  7. Rojiani, A. M., Dorovini-Zis, K. Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study. J Neurosurg. 85 (6), 1078-1084 (1996).
  8. Hambardzumyan, D., Amankulor, N. M., Helmy, K. Y., Becher, O. J., Holland, E. C. Modeling Adult Gliomas Using RCAS/t-va Technology. Translational Oncology. 2 (2), 89-95 (2009).
  9. Friedmann-Morvinski, D., et al. Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice. Science. 338 (6110), 1080-1084 (2012).
  10. Lynes, J., et al. Lentiviral-Induced High-Grade Gliomas in Rats: The Effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutic. , (2014).
  11. Uhrbom, L., Hesselager, G., Nister, M., Westermark, B. Induction of brain tumors in mice using a recombinant platelet-derived growth factor B-chain retrovirus. Cancer Res. 58 (23), 5275-5279 (1998).
  12. Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15 (1), 110-116 (2009).
  13. Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69 (2), 431-439 (2009).
  14. Bailey, O. T. Genesis of the Percival Bailey-Cushing classification of gliomas. Pediatr Neurosci. 12 (4-5), 261-265 (1985).
  15. Patel, A. P., et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science. 344 (6190), 1396-1401 (2014).
  16. Agnihotri, S., et al. Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 61 (1), 25-41 (2013).
  17. . Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
  18. Ivics, Z., Izsvak, Z., Minter, A., Hackett, P. B. Identification of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (10), 5008-5013 (1996).
  19. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
  20. Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression. Adv Genet. 54, 189-232 (2005).
  21. Ammar, I., Izsvak, Z., Ivics, Z. The Sleeping Beauty transposon toolbox. Methods Mol Biol. 859, 229-240 (2012).
  22. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
  23. Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
  24. Fujita, M., et al. COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloid-derived suppressor cells. Cancer Research. 71 (7), 2664-2674 (2011).
  25. Geurts, A. M., et al. Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system. Molecular Therapy: The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 8 (1), 108-117 (2003).
  26. Dickins, R. A., et al. Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors. Nat Genet. 37 (11), 1289-1295 (2005).
  27. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146 (2), 209-221 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

96 subventricular GBM neurospheres GBM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved