Transposon Mediated Integrazione di DNA plasmide nella zona subventricolare di topi neonati a generare modelli Novel di Glioblastoma

Riepilogo

Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.

Abstract

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.

Introduzione

Glioblastoma multiforme (GBM) è il (60%) tumore cerebrale primario più comune negli adulti, con una sopravvivenza mediana di 15-21 mesi, quando trattati con la chirurgia, la radioterapia e la chemioterapia ^1. Nuove terapie per GBM sono indispensabili. Terapie sperimentali richiedono test su modelli animali che riproducono in maniera adeguata le caratteristiche salienti della malattia umana. Strategie per indurre GBM nei roditori sono mutagenesi chimica con agenti alchilanti, linea germinale o alterazioni genetiche somatiche, o il trapianto utilizzando linee cellulari di glioma ^2. I modelli più utilizzati impiegano l'impianto di linee cellulari di glioma, sia ortotopicamente, nel cervello o sottocutanea utilizzando cellule singeniche negli animali con genotipo identico; o xenogeniche, linee più comunemente umani cellule GBM, impiantati in topi immunocompromessi ^3. Xenotrapianti offrono molti vantaggi per lo studio dei tumori intracranici: comodità di riproducibilità, standatassi di crescita rdized, tempo di morte e di tumore localizzazione. Tuttavia, questi modelli hanno dei limiti a causa l'approccio chirurgico artificiale, invasivo utilizzato per implantologia e limitata capacità di riprodurre accuratamente istologica tratti caratteristici di GBM umano (grado IV): pseudo-pallisading necrosi, atipie nucleari, invasione diffusa, la proliferazione di micro-vascolare e la formazione di anomalie vascolari glomeruloid ^4-7. Induzione di GBM alterando il genoma delle cellule somatiche con il DNA oncogeno, sia con vettori virali ^8-12, o con transposon mediata integrazione ^13, riproduce più da vicino l'eziologia delle malattie umane e ricapitola le caratteristiche isto-patologici di GBM umana.

Storicamente, i tumori del SNC sono stati classificati in base alla cella percepita di origine, che è stato osservato, sarebbe un fattore predittivo per la sopravvivenza ^14. GBM sono classificati in primaria e secondaria. Emergenti prove today punti per la natura altamente eterogenea di glioblastoma primario ^15. GBM secondaria (15%), il risultato della trasformazione maligna di astrocitoma di grado basso (grado I) e astrocitoma anaplasic (grado II), sono associati con insorgenza più precoce della malattia, una migliore prognosi e un modello "proneurale" di espressione genica , considerando primaria GBM (85%) mostrano un esordio tardivo, cattiva prognosi e gliali (classica), neurale o pattern di espressione mesenchimali. Se questi pattern di espressione genica in correlazione con la cella effettiva di origine del tumore è ancora indagato attivamente. Accumulare dati mostrano che la combinazione di mutazioni genetiche associate con GBM è predittivo per la sopravvivenza. Ad esempio, la perdita di eterozigoticità (LOH) di cromosomi 1p / 19q, mutazioni IDH1, PDGFRα amplificazioni, sono associati con GBM secondarie, proneurale modello di espressione e una migliore prognosi, mentre EGFR sovraespressione, Notch e Sonic hedgehog attivazione via, Nf1 e PTEN perdita e le mutazioni di p53 sono correlati con neurale, classica, o mesenchimali GBM primario e prognosi peggiore ^16,17. L'avvento di progetti di sequenziamento su larga scala e l'accumulo di numerosi campioni dei pazienti disponibili per il test porta una ricchezza di nuove informazioni per quanto riguarda le mutazioni genetiche e percorsi implicati in GBM patogenesi e nella progressione e la possibilità della medicina individualizzata, dove le terapie possono essere specificamente adattati alle le anomalie genetiche del paziente. In ultima analisi, per valutare il valore predittivo di tali mutazioni e percorsi in modo sistematico, e per testare possibili trattamenti in ogni caso, richiede modelli animali di GBM con alterazioni genetiche pre-determinati. Transposon mediata integrazione di DNA genomico offre un approccio praticabile.

The Sleeping Beauty sistema trasposoni, membro del / classe di mariner Tc1 di trasposoni, è stato "svegliato" (costruzione) in un proce multi-stepss di mutagenesi sito specifica di un gene trasposasi salmonidi, che divenne in sospeso più di 10 milioni di anni fa ^18,19. In sostanza, i trasposoni DNA fiancheggiate da sequenze specifiche (ripetizioni invertite / ripetizioni diretti: IR / DR) possono essere integrate nel genoma in maniera "taglia e incolla", mediante l'attività della Bella Addormentata trasposasi. Il trasposasi riconosce le estremità dei siti IR, accise il trasposone e integra in modo casuale in un altro sito DNA tra le basi T e A, basi che vengono duplicati ad ogni estremità del trasposone durante trasposizione (Figura 1a). La Bella Addormentata trasposasi è composto da tre domini, un dominio di legame trasposone, una sequenza di localizzazione nucleare e un dominio catalitico. Quattro molecole trasposasi sono tenuti a portare le due estremità del trasposone insieme e consentire trasposizione, tuttavia, se sono presenti troppe molecole di trasposasi, possono dimerize e tetramerize di inibirela reazione di recepimento ^20. Una reazione trasposizione efficiente richiede un rapporto ottimale di trasposasi di trasposoni. Il DNA codificante la trasposasi può essere spedito sullo stesso plasmide con il trasposone (in cis) o su un plasmide diverso (in trans). Per assicurare il rapporto ottimale tra la trasposasi e trasposoni, un promotore di attività adeguata può essere scelta per l'espressione della trasposasi (per il modello "cis") o il rapporto dei plasmidi nella soluzione iniettabile possono essere ottimizzati (per la modello di "trans"). The Sleeping Beauty transposon sistema può essere utilizzato con successo per la genomica funzionale, mutagenesi inserzionale, transgenesi e la terapia genica somatica ^21. Essendo un costrutto sintetico riprogettato per una molecola funzionale da una variante salmonide dormiente, la Bella Addormentata trasposasi non si lega ad altri trasposoni in esseri umani o di altri mammiferi ^20. Fin dalla sua scoperta, l'ingegneria molecolare ha Enhanced l'efficacia trasposizione del sistema di trasposoni SB attraverso variazioni nelle sequenze IR e l'aggiunta di dinucleotidi TATA fiancheggia la trasposone, causando i trasposoni pT2. Questi trasposoni hanno ottimizzato vincolante della SB al sito IR e una maggiore efficacia di escissione. Il trasposasi SB anche subito un significativo miglioramento; la trasposasi utilizzato negli esperimenti qui presentati è la SB100X, una trasposasi iperattivo generato da una strategia di rimescolamento DNA seguito da uno screening genetico su larga scala in cellule di mammifero ^22.

In questo rapporto presentiamo un metodo rapido, versatile e riproducibile per indurre intrinseca GBM in topi con non-virale, l'integrazione transposon mediata di plasmide DNA nelle cellule della zona sub-ventricolare di topi neonati ^23. Vi presentiamo un modo semplice per creare trasposoni con nuovi geni suscettibili di integrazione genomica utilizzando la Bella Addormentata trasposasi e dimostrare come monitorare plasmide assorbimento eprogressione della malattia con bioluminescenza. Si caratterizzano anche caratteristiche istologiche e immunoistochimiche del GBM riprodotto con questo modello. Inoltre, vi presentiamo un metodo rapido per generare linee di cellule GBM primari di questi tumori. Il Modello di bellezza di sonno, in cui i tumori sono indotti da cellule originali dell'animale, permette la valutazione funzionale del ruolo dei geni candidati GBM nell'induzione e progressione dei tumori. Questo sistema è anche adatto per la sperimentazione di trattamenti GBM nuove, tra cui terapie immunitarie in topi immuno-competente, senza la necessità di interventi chirurgici infiammatorie invasive, che possono alterare il microambiente locale.

Protocollo

NOTA: Tutti i protocolli su animali sono stati approvati dalla University of Michigan Comitato per l'uso e la cura degli animali (UCUCA).

1. Clonazione della Sequenza di interesse in New Sleeping Beauty trasposoni

NOTA: Per inserire i geni o elementi inibitori (come shRNA) che utilizzano il sistema di Sleeping Beauty trasposasi, clonare la sequenza di interesse nella spina dorsale di un pKT o pT2 plasmide. Dirigere la clonazione tale che gli elementi regolatori, geni di interesse e marcatori rimangono affiancano le ripetizioni invertite (IR / DR). Un esempio di clonazione PDGFβ in un backbone pKT risulta il seguente (vedi anche figura 1b).

1. Digest 5 mg di plasmide vettore pKT-IRES-Katushka per 4 ore a 37 ° C con 5-10 unità di XbaI / XhoI enzimi di restrizione in 50 ml di volume di reazione.
2. Digerire il mPDGFβ cDNA di 5 ug del plasmide pGEM-T mPDGFβ per 4 ore a 37 ° C con 5-10 unitàs di NcoI / SACI enzimi di restrizione.
3. Precipitare il DNA totale aggiungendo 2,5 volumi di etanolo al 100%, e 1/10 volume di 3 M Na acetato, pH 5.8 e incubare una notte a -20 ° C.
4. Centrifugare i campioni a 13.800 xg per 15 min.
5. Lavare il pellet di DNA con 500 ml di etanolo al 70%, centrifugare a 13,800 xg per 1 minuto, ripetere una volta e risospendere in 19 ml di acqua priva di DNasi sterile.
6. Seguire le istruzioni del produttore in rapida ottundimento Kit per smussare le estremità di entrambi vettore (pKT-IRES-Katushka) e inserire (mPDGFβ).
7. Caricare il vettore smussato e inserire su un bromuro di etidio gel colorato 1,2% e correre a 80 V per 40 min. Visualizzare le bande, le imposte indirette con un rasoio a lama pulita e gel purificare il DNA utilizzando un kit di gel purificante secondo il protocollo del produttore.
8. Legare l'inserto e il vettore DNA purificato in fase 1.7, aggiungendoli in un tubo in un rapporto di 4: 1 molare (inserto: vettore). In questo tubo, pipette 1 ml di T4 ligasi e 2 ml di tampone ligasi T4 (contenente ATP), e regolare il volume a 20 ml con acqua sterile. Incubare la reazione legatura per 18 ore a 16 ° C.
9. Trasformare cellule batteriche DH5α chimicamente competenti con i prodotti legatura.
   1. Scongelare le cellule competenti sul ghiaccio.
   2. Aggiungere l'intero volume della reazione legatura a 50 microlitri di cellule competenti, agitare delicatamente il tubo e incubare la miscela in ghiaccio per 30 min. Heat-shock i batteri per 45 sec a 42 ° C e tornare immediatamente in ghiaccio; incubare su ghiaccio per altri 2 minuti.
   3. Aggiungere 950 ml di Luria Broth alla cultura e incubare con agitazione a 37 ° C per 1 ora. Batteri centrifugare a 2.400 xg per 3 min e risospendere il pellet in 200 ml di LB.
   4. Distribuire i batteri trasformati su un piatto Petri rivestito con LB-agarosio e la corrispondente antibiotico. Incubare la piastra per una notte a 37 ° C.
   5. Infine, raccogliere 5-10 bactecolonie Rial e cultura durante la notte a 37 ° C in 5 ml di LB supporti con antibiotico.
   6. Purificare DNA plasmide utilizzando un mini kit di plasmide DNA secondo le istruzioni del produttore. Eseguire una restrizione diagnostico digerire per verificare il corretto inserimento dell'inserto nel vettore e presentare cloni positivi per il sequenziamento del DNA al fine di garantire il giusto orientamento dell'inserto.
10. Selezionare le colonie corretti e scalare fino alla produzione di DNA con una elevata qualità, endotossine kit di preparazione plasmide gratuito.
11. Eluire il DNA in acqua sterile o 1 mM Tris-HCl. Conservare il DNA a -20 ° C fino al momento di iniettare in neonati.

2. Intra-ventricolari neonatali Iniezioni

1. Da tre a quattro settimane prima di sperimentare, istituire un allevamento gabbia mouse con un maschio e una femmina di topo, e un igloo di plastica colorata. Ciò fornisce un ambiente arricchito e aiuta il processo di accoppiamento.
2. Quando la gravidanza è confermata, rimuovere il male a una nuova gabbia. Diciotto giorni dopo l'accoppiamento, controllare gabbia ogni giorno per la consegna. Eseguire iniezioni intraventricolare giorno postnatale 1 (P1).
3. Preparazione della soluzione per l'iniezione
   NOTA: La soluzione iniettabile si ottiene mescolando il DNA plasmide con il reagente di trasfezione per creare le particelle di trasfezione. Di seguito è riportato un esempio per la preparazione di una soluzione per l'iniezione con un plasmide codificante la Bella Addormentata trasposasi e luciferasi: pT2 / SB100x-Luc e due plasmidi trasposoni: pt / CAGGS-NRASV12 e PT / CMV-SV40-LGT, con un rapporto di 1: 2: 2. Tutti i plasmidi hanno una concentrazione di 2 mg / mL. Dettagli importanti sulla preparazione della soluzione iniettabile sono presentati nella discussione.
   1. Preparare la soluzione di DNA aggiungendo: 4 mg (2 ml) di pT2 / SB100x-Luc, 8 mg (4 ml) di PT / CAGGS-NRASV12 e 8 mg (4 ml) di pT / CMV-SV40-LGT e 10 ml del 10% di glucosio ad un volume finale di 20 microlitri ad una concentrazione di 1 mg / mlDNA e 5% di glucosio.
   2. Preparare la soluzione PEI aggiungendo 2,8 ml di PEI in vivo jet, 7,2 ml di acqua sterile, e 10 ml di 10% di glucosio ad una concentrazione finale di 5% di glucosio.
   3. Aggiungere la soluzione PEI per la soluzione di DNA, mescolare e vortex e lasciate riposare a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti. La soluzione è ora pronta per l'iniezione. Dopo un'ora a temperatura ambiente, mantenere la soluzione in ghiaccio.
   4. Montare un 10 microlitri siringa pulita dotata di un ago ipodermico 30 gauge con 12,5 ° smusso nel micropompa (Figura 2 # 1).
4. Per verificare il corretto funzionamento del sistema di iniezione, utilizzare l'iniettore automatico (Figura 2 # 1) ritirare 10 ml di acqua nella siringa e quindi svuotare completamente la siringa
5. Raffreddare la fase stereotassico neonatale (Figura 2 # 3) con un impasto di ghiaccio secco e alcool ad una temperatura di 2-8 ° C.
6. Indurre l'anestesia mettendo i cuccioli sul ghiaccio bagnatoper 2 min. Anestesia continuerà sul telaio stereotassico refrigerata per il resto della procedura. Mantenendo la temperatura del telaio sopra lo zero, tra 2-8 ° C eviterà ustioni termiche. Come cuccioli precauzione speciale possono essere avvolti in una garza, prima dell'immissione sul ghiaccio bagnato.
7. Riempire la siringa con la soluzione di DNA / PEI.
8. Immobilizzare il cucciolo nel telaio stereotassico mettendo la testa tra le sbarre orecchio garza coperto (Figura 2b). Assicurarsi che il lato dorsale del cranio è orizzontale, parallelo alla superficie del telaio e che le suture craniche sono chiaramente visibili. Pulire la testa con il 70% di etanolo.
9. Abbassare l'ago della siringa e regolare coordinate stereotassica utilizzando quadranti del telaio stereotassico finché l'ago tocca il lambda (l'intersezione della linea mediana parietale e occipitale) (Figura 2b).
10. Sollevare l'ago e regolare le coordinate stereotassica a 0,8 mm lateralmente e 1,5 mm rostrale al lambda (Figura 2b).
11. Abbassare l'ago finché non tocca e fossette leggermente la pelle. Misurare le coordinate. Abbassare l'ago altri 1,5 mm. L'ago perforare la pelle e il cranio, e passa attraverso la corteccia di entrare nel ventricolo laterale (figura 2c).
12. Utilizzando l'iniettore automatico, iniettare 0,75 ml di soluzione di DNA / PEI ad una velocità di 0,5 ml / min
13. Mantenere il cucciolo sul telaio per un altro minuto per consentire la soluzione per disperdere nei ventricoli. Nel frattempo, anestetizzare un'altra cucciolo, su ghiaccio per 2 min in preparazione per l'iniezione successiva.
14. Delicatamente e lentamente sollevare l'ago, e posizionare il cucciolo sotto una lampada riscaldante. Monitorare la respirazione e l'attività. Se necessario, fornire delicata stimolazione delle arti fino alla prima respirazione deriva.
15. Ritorna il cucciolo alla madre dopo che si è riscaldato, ha raggiunto un colore rosato, è la respirazione regolare e che è attiva, normalmente 5-7 min. Se more di un cucciolo viene iniettato alla volta, tenere i cuccioli insieme fino sono fatte tutte le iniezioni. Se iniezioni richiede più di 30 minuti, restituire la metà dei cuccioli dopo il primo 30 min e il resto al termine della procedura.
16. Monitor che la diga è reattivo e nutrimento ai suoi cuccioli. Se necessario, aggiungere una mamma surrogata alla gabbia.
17. Assicurarsi che l'intervallo tra ponendo il cucciolo su ghiaccio e ponendolo sotto la lampada di riscaldamento è inferiore a 10 min. Il più veloce la procedura migliore è la sopravvivenza. Solitamente, il tempo necessario per anestetizzare e iniettare un cucciolo è 4 min.

3. bioluminescenza monitoraggio del tumore formazione e progressione

3.1) Monitoraggio plasmidi assorbimento dopo l'iniezione

1. 24-72 ore dopo l'iniezione, rimuovere tutti i cuccioli da gabbia e il posto della madre in un 6 ben pulito piatto di coltura di tessuti, un cucciolo per pozzetto.
2. Preparare una soluzione di 30 mg / ml di luciferina disciolto in soluzione fisiologica o phosphate buffer. Preparare questa soluzione in anticipo e tenere in piccole aliquote a -20 ° C.
3. Usando una siringa da 1 ml con ago ipodermico 30 gauge iniettare 30 ml di luciferina sottocutanea tra le scapole del cucciolo. Assicurarsi che l'ago non perforare tutti gli organi, pizzicando la pelle e sollevandolo leggermente prima di inserire l'ago.
4. Immagine immediatamente, utilizzando un sistema di imaging bioluminescenza vivo in. Per la IVIS spettro, utilizzare le seguenti impostazioni per acquisizioni: esposizione automatica, grande categorizzazione, e l'apertura f = 1.

3.2) formazione del tumore di monitoraggio e Progression

NOTA: Gli animali inizieranno la formazione di tumori macroscopiche rilevabili da bioluminescenza e istologia entro 2½-sei settimane, a seconda dei plasmidi oncogenici iniettati.

1. Usando una siringa da 1 ml con ago calibro 26 iniettare 100 pl di una / soluzione di luciferina ml 30 mg intra-peritoneally.
2. Posto l'animale nella camera di anestesia. Iniettare fino a cinque animali allo stesso tempo.
3. Attendere 5 min quindi avviare il flusso di ossigeno / isoflurano (1,5-2,5% isoflurano) per anestetizzare gli animali. Dopo 3-4 minuti, rimuovere gli animali dalla camera anestesia, avviare il flusso di ossigeno / isoflurano nella camera di bioluminescenza. Posizionare gli animali nelle rispettive asole dotati coni naso di vetro per consentire il passaggio senza ostacoli anestesia e di luce.
4. Tipicamente, acquisire una serie di immagini 6, ad intervalli di 2 min con un tempo di esposizione automatica, binning mediana ed un'apertura aperta di f = 1.
5. Impostare la regione di interesse per tutti gli animali impressi, tipicamente un ovale sopra la regione della testa, e misurare l'intensità di luminescenza utilizzando le unità fotoni calibrati / s / cm ² / sr.
6. Registrare il valore massimo per ogni animale. Successivamente, le registrazioni possono essere confrontati durante la progressione del tumore per ciascun animale e / o tra animali, per esempio when diversi trattamenti sono impiegati.

4. istologica e immunoistochimica Analisi di New GBM

NOTA: Quando i tumori hanno raggiunto sperimentale time-punto desiderato, gli animali possono essere sacrificati, i cervelli perfusi, fissi e analizzati. Per la sopravvivenza analizza la fase moribondo rappresenta il punto finale dell'esperimento, quando gli animali vengono sacrificati umanamente ai primi segni di carico tumorale, così come definito dallo stadio clinico quando l'animale diventa rappresentazione sintomatica ridotta mobilità, la postura ingobbita e pelliccia trasandato. Una breve descrizione dei metodi istologici e immunoistochimiche standard utilizzate è presentato di seguito.

4.1) Perfusione e Fixation

1. Anestetizzare il mouse con una iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg di xilazina.
2. Controllare il riflesso pedale pizzicando piedi del mouse. Quando questo riflesso è abolita, indicando anestesia profonda, immobilize il mouse su una scheda dissezione con spilli, aprire la cavità addominale, sezionare il diaframma e aprire la cavità toracica di visualizzare il cuore.
3. Inserire un ottuso 20 gauge cannula nel ventricolo sinistro del cuore. Collegare la cannula con tubazione di plastica che passa attraverso una pompa peristaltica ad un contenitore con la soluzione di Tyrode ossigenata e eparinizzato (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl ₂ 2H ₂ O, 0,005% NaH ₂ PO _4, 0,1% di glucosio, 0,1% NaHCO _3, 0.02 % KCl). Avviare il flusso della soluzione di Tyrode regolando la velocità della pompa peristaltica per garantire un flusso lento e costante, circa una goccia al secondo o meno se gli animali sono più piccoli.
4. Fai una piccola incisione nell'atrio destro del cuore per permettere lo scarico di sangue e di Tyrode.
5. Monitorare l'efficienza perfusione osservando sbiancamento degli organi interni (più evidenti nel fegato e rene) come diventano privi di sangue.
6. Quando lasoluzione drenante dal cuore è chiaro (3-5 minuti), cambiare le soluzioni da Tyrode di al 4% paraformaldeide per il fissaggio (4% PFA, pH 7,34 in tampone fosfato salino).
7. Monitorare buon fissaggio dei tessuti dalla maggiore rigidità del collo e della coda.
8. Decapitare il mouse e sezionare con cura il cervello dal cranio.
   1. Estrarre la pelliccia che ricopre il cranio rostralmente, verso il naso, e afferrare saldamente per stabilizzare la testa, dorsale verso l'alto.
   2. Usando un bisturi affilato, tagliate verso il basso lungo il bordo dell'orbita, a transezione muscoli orbitali e le zigomatica sottostanti.
   3. Girare la testa ventrale lato e rimuovere muscoli del collo attaccati con un rongeur. Schiacciare la prima vertebra e rimuoverlo dal tronco encefalico.
   4. Visualizza la coclea, afferrare l'osso temporale sovrastante con la rongeur e creare un'apertura tra l'osso temporale e occipitale. Rimuovere la occipitale dalla superficie del cervelletto.
   5. Schiacciare l'osso sovrastante il naso con il rongeur. Rimuovere con attenzione il frontale e parietale restanti ossa dalla superficie del cervello essendo consapevole di non danneggiare la superficie del cervello. Prestare particolare attenzione nella zona orbitale.
   6. Girare la testa ventrale verso l'alto. Il cervello scivolare giù dal resto del cranio, collegata ora esclusivamente attraverso i nervi cranici. Utilizzando piccole forbici tagliano la olfattiva, ottica e nervi trigemino. Questo rilascerà il cervello.
9. Mettere cervello in 4% PFA notte a 4 ° C per la post-fissazione.
10. Per l'analisi istologica ed ematossilina-eosina, trasferire i cervelli di tampone fosfato per 24 ore e poi procedere in paraffina.
11. Per l'analisi immuno-istologica, trasferire cervelli in una soluzione di saccarosio al 30% in tampone fosfato salino per 24-48 h (fino cervello si depositano sul fondo della provetta)
12. Cervelli Sezione in mezza attraverso il centro della regione tumorale, posizionare il tagliolato negativo in uno stampo di congelamento, incorporare in media-crio embedding (OCT compound), e il flash-gelo in una poltiglia di etanolo ghiaccio secco, isopentano ghiaccio secco o in azoto liquido. Mantenere blocchi congelati a -80 ° C fino sezionamento e colorazione.

4.2) Brains for Analysis Histo-patologica di Intrinsic GBM ematossilina-eosina di paraffina

1. Sezione di paraffina cervelli integrato a 4 micron di spessore, cadere in un bagno di 42 ° C dell'acqua e montare su vetrini.
2. Vetrini Sparaffinare mettendoli per 10 minuti in un forno a 60 ° C e poi trasferirli ad intervalli di 5 min attraverso una serie di tre contenitori scorrevoli riempiti con xilene.
3. Idratare la diapositive attraverso una serie di bagni etanolo: 100% etanolo per 2 min, ripetere una volta, etanolo al 95% per 2 min, ripetere una volta, etanolo al 70% per 2 minuti e poi trasferire i vetrini all'acqua.
4. Colorare i vetrini immergendoli in un contenitore di diapositive riempito di Harris ematossilina per 2 minuti.
5. Risciacquare con acqua corrente fino a quando l'acqua è chiara.
6. Dip scivola due volte in soluzione brunitura (0,1% di sodio bicarbonato).
7. Let vetrini stare in acqua di rubinetto per 2 minuti, quindi trasferire al 80% di etanolo per 2 min.
8. Colorare i vetrini immergendoli in un contenitore riempito con Eosina per 5 min.
9. Disidratare i vetrini in una serie di bagni di etanolo (80% etanolo 3-4 tuffi, etanolo al 95% 2 min, ripetere una volta, 100% etanolo 2 min, ripetere una volta).
10. Chiaro con 3 bagni consecutivi di xilene, 3 minuti ciascuno.
11. Coverslip con un mezzo di montaggio a base di xilene e lasciare asciugare su una superficie piana a temperatura ambiente fino al momento per l'imaging. Conservare a temperatura ambiente.

4.3) Immuno-istochimica di Brains embedded Cryo-conservati per Cellulare e Molecolare caratterizzazione di De Novo Induced GBM

1. Recupera blocchi congelati dallo stoccaggio -80 ° C, mettere in criostato e consentono temperature equilibrare per 30 minuti.
2. Sezione 12-14 Micron sezioni spesse e montaggio 2-3 sezioni su vetrini caricati positivamente. Tagliare sezioni in serie, attraverso la raccolta di sezioni adiacenti su diverse diapositive. Questo permette la colorazione con anticorpi differenti su sezioni di tessuto adiacenti all'interno del tumore.
3. Diapositive secchi in un essiccatore per almeno 1 ora dopo sezionamento per consentire una buona aderenza del tessuto.
4. Creare una barriera idrofoba (con un marcatore idrofobico) a ciascuna estremità della slitta per consentire liquide per coprire le sezioni e di rimanere sulla slitta durante i lavaggi. Coprire le sezioni con una soluzione di tampone fosfato isotonico con 0,1% Triton-X (PBS 0,1% Tx) e agitare delicatamente per 5 minuti su un agitatore orizzontale permeabilize tessuto. Ripetere due volte.
5. Bloccare legame non specifico con una soluzione di siero normale di capra 10% (o siero dall'animale in cui l'anticorpo secondario è stata sollevata) per 30 minuti agitando delicatamente
6. Preparare la soluzione anticorpo primario nel siero di capra normale 2% in PBS 0,1%Tx e pipetta la soluzione sopra le sezioni. Mettere i vetrini in una camera umida coperta al buio e mantenere a temperatura ambiente per una notte.
7. Il giorno dopo, lavare sezioni tre volte per 5 minuti con PBS 0,1% Tx e incubare in fluorescenti anticorpo secondario diluito in siero normale di capra 2% PBS 0,1% Tx per un'ora.
8. Lavare sezioni tre volte per 5 minuti con PBS 0,1% Tx, colorazione di contrasto con una macchia nucleare (ad esempio, DAPI) per 2 minuti, lavare ancora una volta, chiaro in acqua e coprioggetto con acqua mezzo di montaggio che preserverà la fluorescenza based. Inserire scorre su una superficie piana e lasciarli cura per almeno 24 ore, al buio, fino al momento per l'imaging. Conservare a 4 ° C in seguito.

5. Generazione del tumore primario linee cellulari con alterazioni genetiche specifiche.

1. Per generare linee di cellule da Sleeping Beauty topi tumore selezionare un mouse con grande tumore confermato (bioluminescenza 10 ⁷ -10 ⁸ fotoni / s / cm2 / sr).
2. Euthanize il mouse con una dose eccessiva di anestetico isoflurano, decapitare il animali e con attenzione sezionare il cervello dal cranio (come descritto nella sezione 4). Mettere il cervello in un piatto pulito Petri.
3. Utilizzando una lama di rasoio, tagli coronali anteriore e posteriore al tumore. La posizione del tumore è di solito riconoscibile dalla trasparenza del cervello.
4. Sezionare il tumore, di solito 5-7 mm di diametro con pinza sottile e posto in una provetta da 1,5 ml riempito con 300 ml di media Neural Stem Cell (NSC media: DMEM / F12 con B-27 supplemento, N2, e Normocin, integrato con EGF ricombinante umana e bFGF ad una concentrazione di 20 ng / ml).
5. Omogeneizzare delicatamente tumore con un pestello in plastica, che si adatta alle pareti del tubo.
6. Aggiungere 1 ml di soluzione di dissociazione tissutale priva di enzimi e incubare a 37 ° C per 5 min.
7. Passare sospensione cellulare attraverso un colino cella di 70 micron, lavare il filtro con 10 ml diSupporto NSC, centrifugare a 300 xg per 4 minuti, il surnatante decantare e risospendere pellet in 7 ml di mezzi NSC.
8. Piatto su un pallone di coltura T25 e coltura a 37 ° C in un incubatore di coltura tissutale con e l'atmosfera di 95% aria e 5% di CO _2. Dopo 3 giorni, alcune cellule sono morti, alcuni aderito al fondo del piatto di coltura, e alcuni sono neurosfere formatura, liberamente fluttuante nel supporto.
9. Rimuovere queste cellule in sospensione e re-piastra su un pallone di coltura tissutale T75.
10. Dopo altri tre giorni di cultura, raccoglie neurosfere, dissociarsi come descritto al punto 5.6, filtrare con filtro cella e contare le cellule. Fermo aliquote di cellule in siero fetale bovino 10% DMSO e cellule passaggio ad una densità di un milione di cellule in 14 ml di NSC integrato con EGF e FGF per un pallone T75. Il tasso di crescita dipenderà dagli oncogeni utilizzati per generare tumori. Adattare le condizioni di coltura cellulare per prevenire la crescita eccessiva e mantenere le cellule relativamente alta densità.

Risultati

Per caratterizzare caratteristiche isto-patologici di glioblastomi SB-indotte, C57 / BL6 topi neonati sono stati iniettati in P1 con luciferasi plasmide codificante (pT2 / SB100x-Luc) in combinazione con plasmidi codifica trasposoni con DNA oncogeno, cioè, NRAS (Pt / CAGGS -NRASV12) e SV40 LGT (PT / CMVSV40-LGT) (Figura 3c) o un plasmide codificante una breve p53 tornante con PDGFβ e un reporter GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) in combinazione con NRAS (Figura 3d). Gli animali...

Discussione

In questo articolo, abbiamo dettaglio un metodo versatile e riproducibile per la generazione di nuovi modelli di GBM utilizzando integrazione SB transposase- mediata oncogeno DNA plasmide nelle cellule che circondano la zona subventricolare di topi neonati. Vi presentiamo un protocollo per generare plasmidi trasposoni nuovi geni di interesse, illustreremo come monitorare la progressione dei tumori negli animali vivi, e come caratterizzare caratteristiche isto-patologico e immunoistochimiche di questi tumori.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors	Stoelting	51670	Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Injections can be made without it, ,but    the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience
10 μL 700 series hand fitted MICROLITER syringe	Hamilton	Model 701	This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used
30 gauge gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel)	Hamilton	S/O# 197462	This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced.
in vivo-jetPEI	Polyplus Transfection	201-10G	Aliquot in small volumes and keep at -20oC
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio.com	LuckK-1g	Other sources of firefly lucifierase are just as adequate
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich	HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Electron Microscopy Sciences	62550-01	for embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry
Advanced DMEM/F-12, no glutamine	Life Technologies	12634-010	for the culture of neurospheres
B-27¨ Supplement (50X), serum free	Life Technologies	17504-044	serum free supplement for the culture of neurospheres
N2 Supplement (100x)	Life Technologies	17502-048	serum free supplement for the culture of neurospheres
Normocyn	InvivoGen	ant-nr-1	anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres
Recombinant Human EGF	PEPROTECH	AF-100-15	growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Recombinant Human FGF-basic	PEPROTECH	100-18B	growth factor supplement for the culture of  neurospheres
HyClone HyQTase  Cell Detachment Reagent	Thermo Scientific	SV3003001	for the dissociation of neurospheres
Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749510-0590	for the dissociation of freshly dissected tumors
Falcon Cell Strainers mesh size 70um	Fisher Scientific	08-771-2	for generating single cell suspensions of dissociated neurospheres
Xylenes Histological grade	Fisher Scientific	C8H10
Protocol Harris Hematoxylin Mercury free ( acidified)	Fisher Scientific	245-678
Protocol Eosyn Y Solution ( intensified)	Fisher Scientific	314-631