Transposon מתווך האינטגרציה של פלסמיד דנ"א לתוך אזור Subventricular של עכברים בילוד ליצירת מודלים חדשניים של גליובלסטומה

Summary

Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.

Abstract

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.

Introduction

multiforme גליובלסטומה (GBM) הוא (60%) הגידול הנפוץ ביותר העיקרי המוח במבוגרים, עם חציון הישרדות של 15-21 חודשים, כאשר טופל בניתוח, הקרנות, וכימותרפיה ^1. טיפולים חדשניים לGBM הם הכרחיים. טיפולים ניסיוניים דורשים בדיקה במודלים של בעלי חיים שכראוי לשחזר את המאפיינים הבולטים של המחלה האנושית. אסטרטגיות כדי לגרום GBM במכרסמים כוללים mutagenesis הכימי עם סוכני אלקילציה, בתאי מין או שינויים גנטיים סומטיים, או השתלה באמצעות תא גליומה קווים ^2. הנפוץ ביותר המודלים להעסיק את ההשתלה של שורות תאי גליומה, או orthotopically, למוח או תת עורי באמצעות תאי syngeneic בבעלי חיים עם גנוטיפ הזהה; או תאי xenogeneic, קווים הנפוצים ביותר אדם GBM תא, שהושתלו בעכברים חיסוניים חלש ^3. Xenografts מציע יתרונות רבים למחקר של גידולים תוך-גולגולתי: נוחות של שחזור, standaשיעורי rdized צמיחה, זמן של לוקליזציה מוות וגידול. עם זאת, יש לי מודלים אלה מגבלות בשל הגישה המלאכותית, פולשני כירורגי המשמשת להשתלות ויכולת מוגבלת לשחזר במדויק היסטולוגית כולל מאפיין של GBM האנושי (IV הכיתה WHO): נמק פסאודו-pallisading, atypias הגרעיני, פלישה מפוזרת, ריבוי מיקרו-וסקולרית והיווצרות של כלי דם glomeruloid חריגות ^4-7. אינדוקציה של GBM על ידי שינוי הגנום של תאים סומטיים עם DNA שעור, או עם וקטורים ויראליים ^8-12, או עם שילוב בתיווך transposon ^13, מתרבה באופן הדוק יותר אטיולוגיה של מחלות בבני אדם ומשחזרת תכונות histo-פתולוגי של GBM האנושי.

מבחינה הסטורית, גידולים של מערכת העצבים המרכזית שמאורגנים על בסיס התא הנתפס של מקור, שבו נצפה, יהיה גורם מנבא להישרדות ^14. GBMs מסווג ליסודי ותיכוני. טוד ראיות המתעורריםאיי מצביע על אופי הטרוגני מאוד של גליובלסטומה העיקרית ^15. GBM המשני (15%), כתוצאה משינוי הממאיר של astrocytomas הנמוך כיתה (WHO אני כיתה) וastrocytomas anaplasic (WHO כיתה II), המשויכים תחילת מוקדמת של המחלה, הפרוגנוזה טובה יותר ודפוס "proneural" של ביטוי גנים , ואילו GBM הראשוני (85%) מראה תחילת סוף, הפרוגנוזה וגליה (קלסית) עלובות, עצבית או דפוסי ביטוי mesenchymal. אם דפוסי ביטוי גנים אלה לתאם עם התא בפועל המוצא של הגידול הוא עדיין נחקר באופן פעיל. צבירת נתונים מראה כי השילוב של מוטציות גנטיות הקשורות לGBMs מנבא להישרדות. לדוגמא, אובדן heterozygocity (LOH) של כרומוזומים 1p / 19q, מוטציות IDH1, amplifications PDGFRα, המשויכים GBMs המשני, דפוס ביטוי proneural ופרוגנוזה טובה יותר, ואילו EGFR ביטוי היתר, Notch והפעלת מסלול קיפוד סוניק, NFאובדן ומוטציות של p53 1 וPTEN מתואמים עם עצבי, קלאסי, או GBM הראשוני mesenchymal ופרוגנוזה גרועה ^16,17. כניסתו של פרויקטים לקביעת רצף בקנה מידה גדולים וההצטברות של דגימות מטופל רבות זמינות לבדיקה מביאה שפע של מידע החדש ביחס למוטציות גנטיות ומסלולים מעורבים בפתוגנזה GBM והתקדמות והאפשרות של רפואה מותאמת אישית, שבו טיפולים יכולים להיות מותאמים באופן ספציפי ל מומים הגנטיים של המטופל. סופו של דבר, כדי להעריך את הערך המנבא של מוטציות אלה ומסלולים באופן שיטתי, ולבחון טיפולים אפשריים בכל מקרה ומקרה, דורש מודלים של בעלי חיים של GBM עם שינויים גנטיים שנקבע מראש. אינטגרציה בתיווך transposon של הדנ"א הגנומי מציעה גישה אפשרית.

המערכת היפיפייה הנרדמת transposon, חבר Tc1 ספן הכיתה / של transposons, הייתה "מתעורר" (נבנה) בproce רב שלביםss של mutagenesis הספציפי אתר מגן transposase salmonoid, שהפך לפני רדום יותר מ -10 מ'שנים ^18,19. בעיקרו של דבר, transposons DNA מוקף רצפים ספציפיים (חוזר הפוך / חזרות ישירות: IR / DR) ניתן לשלב לתוך הגנום באופן "גזור והדבק" באמצעות הפעילות של transposase היפיפה הנרדם. Transposase מכיר את הקצוות של אתרי IR, בולה transposon ומשלב אותו באופן אקראי לאתר DNA אחר בין הבסיסים T ו, בסיסים שישוכפלו בכל קצה של transposon בשכול (איור 1 א). Transposase היפיפה הנרדם מורכב משלושה תחומים, תחום transposon מחייב, רצף לוקליזציה גרעיני ותחום קטליטי. ארבע מולקולות transposase נדרשות להביא את שני קצוות של transposon יחד ולאפשר לשכול, לעומת זאת, אם מולקולות רבות מדי של transposase נמצאות, הם יכולים dimerize וtetramerize לעכבתגובת טרנספוזיציה ^20. תגובת טרנספוזיציה יעילה דורשת יחס אופטימלי של transposase לtransposons. DNA קידוד transposase יכול להיות מועבר באותו פלסמיד עם transposon (בcis) או על פלסמיד שונה (בטראנס). כדי להבטיח את היחס האופטימלי בין transposase וtransposons, ניתן לבחור אמרגן עם פעילות מתאימה לביטוי של transposase (למודל "ציס") או היחס של פלסמידים בפתרון ההזרקה יכולה להיות מותאם (ל מודל "טראנס"). מערכת transposon היפיפייה הנרדמת יכולה לשמש בהצלחה לגנומיקה הפונקציונלית, mutagenesis insertional, transgenesis וריפוי גנטי סומטיים ^21. להיות מבנה סינטטי מחדש הנדסת מולקולה פונקציונלית מגרסת salmonoid רדומה, transposase היפיפה הנרדם לא להיקשר transposons האחר בבני אדם או יונקים אחרים ^20. מאז גילויו, יש הנדסה מולקולרית העשרתed את היעילות של מערכת transposon SB טרנספוזיציה דרך שינויים ברצפי IR ותוספת של dinucleotides TATA איגוף transposon, וכתוצאה מכך transposons pt2. transposons אלה מותאמים מחייב של SB לאתר IR והגדיל את היעילות של כריתה. Transposase SB גם עבר שיפור משמעותי; transposase המשמש בניסויים שהוצגו במסמך זה SB100X, transposase היפראקטיבי שנוצר על ידי אסטרטגית דשדוש DNA ואחריו מסך גנטי בקנה מידה גדולה בתאי יונקים ^22.

בדוח זה אנו מציגים שיטה מהירה, תכליתית ושחזור כדי לגרום GBM המהותי בעכברים עם שילוב הלא-נגיפי, בתיווך transposon של פלסמיד דנ"א לתוך תאים של האזור תת-חדרית של עכברי יילודים ^23. אנו מציגים דרך פשוטה ליצור transposons עם גני רומן נוח לשילוב הגנומי באמצעות transposase היפיפה הנרדם ומדגים כיצד לפקח על ספיגת פלסמיד והתקדמות מחלה באמצעות פליטת אור. אנחנו גם לאפיין תכונות היסטולוגית והחיסונית histochemical של GBM לשכפל עם המודל הזה. בנוסף, אנו מציגים שיטה מהירה ליצירת שורות תאים ראשוניות GBM מגידולים אלה. המודל היפיפה הנרדם, שבו גידולים הנגרמים מהתאים מקוריים לבעלי החיים, מאפשר הערכה התפקודית של התפקיד של גני GBM מועמד באינדוקציה וההתפתחות של גידולים. מערכת זו גם מתאימה גם לבדיקות של טיפולי GBM רומן, כוללים טיפולים חיסוניים בעכברים חיסוניים מוסמכת, ללא הצורך בניתוחים פולשניים דלקתיים, אשר עשוי לשנות את המיקרו-הסביבה המקומית.

Protocol

הערה: כל הפרוטוקולים של בעלי החיים שאושרו על ידי אוניברסיטת מישיגן הוועדה לשימוש וטיפול של בעלי חיים (UCUCA).

1. שיבוט של הרצף של הריבית לtransposons היפיפה הנרדם החדש

הערה: כדי להכניס גנים או אלמנטים מעכבים (כshRNA) באמצעות מערכת transposase היפיפייה הנרדמת, לשכפל את הרצף של עניין לעמוד השדרה של PKT או פלסמיד pt2. כוון את השיבוט כזה שאלמנטי הרגולציה, גן של עניין וסמנים יישארו מוקף חוזר ההפוך (IR / DR). דוגמא לשיבוט PDGFβ לשדרת PKT המפורטת להלן (ראה גם איור 1).

1. לעכל 5 מיקרוגרם של וקטור פלסמיד PKT-IRES-Katushka במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם 5-10 יחידות של אנזימי הגבלת XbaI / XhoI ב -50 μl של נפח תגובה.
2. לעכל את cDNA mPDGFβ של 5 מיקרוגרם של פלסמיד pGEM-T-mPDGFβ במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם 5-10 יחידהים של אנזימי הגבלת NcoI / SACI.
3. להאיץ את ה- DNA הכולל ידי הוספת 2.5 כרכים של 100% אתנול, ו1/10 נפח של 3 M Na Acetate, pH 5.8 ודגירת הלילה ב -20 ° C.
4. צנטריפוגה דגימות ב13800 XG במשך 15 דקות.
5. שטוף את כדור DNA עם 500 μl של 70% אתנול, צנטריפוגות ב 13800 XG דקות 1, חזור פעם אחת מחדש להשעות ב -19 μl של מים חופשיים DNase סטרילי.
6. בצע את הוראות היצרן במהיר ההקהיה Kit כדי להקהות את הקצוות של שני הווקטורים (PKT-IRES-Katushka) ולהוסיף (mPDGFβ).
7. טען את הווקטור הקהה והכנס על 1.2% agarose ג'ל מוכתם ברומיד ethidium ולהפעיל ב 80 V 40 דקות. דמיינו את הלהקות, הבלו עם סכיני גילוח וג'ל נקיים לטהר את ה- DNA באמצעות ערכת טיהור ג'ל על פי הפרוטוקול של היצרן.
8. ולקשור DNA להוסיף ווקטור מטוהר בשלב 1.7 על ידי הוספה אותם בצינור ב-4: 1 טוחנת (להוסיף: וקטור). לתוך הצינור, p זהipette 1 μl של האנזים T4 ו- 2 μl של חיץ האנזים T4 (המכיל ATP), ולהתאים את עוצמת הקול עד 20 μl עם מים סטריליים. דגירה תגובת קשירה במשך 18 שעות על 16 מעלות צלזיוס.
9. להפוך תאי חיידקי DH5α כימיים מוסמכים עם מוצרי ligated.
   1. להפשיר את התאים המוסמכים על קרח.
   2. הוסף את כל הנפח של תגובת קשירת 50 μl של תאים מוסמכים, נער בעדינות את השפופרת והדגירה לערבב על קרח למשך 30 דקות. חום-לזעזע את החיידקים במשך 45 שניות על 42 מעלות צלזיוס ולחזור מייד לקרח; לדגור על קרח לעוד 2 דקות.
   3. להוסיף 950 μl של וריא מרק לתרבות ולדגירה עם הרועד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. חיידקי צנטריפוגות ב 2400 XG במשך 3 דקות ומחדש להשעות את גלולה ב200 μl של קילו
   4. מורחים את החיידקים הופכים על צלחת פטרי המצופה בLB-agarose והאנטיביוטיקה המתאימה. דגירה את צלחת הלילה בשעה 37 ° C.
   5. לבסוף, לאסוף 5-10 bacteמושבות ריאל ותרבות הלילה בשעה 37 ° C ב 5 מיליליטר של תקשורת LB עם אנטיביוטיקה.
   6. לטהר DNA פלסמיד באמצעות ערכת מיני פלסמיד דנ"א לפי הוראות יצרן. לבצע הגבלת אבחון לעכל כדי לאמת את ההתאגדות הנכונה של להכניס לתוך הווקטור ולהגיש שיבוטים חיוביים לרצפי DNA על מנת להבטיח את הכיוון הנכון של הכנס.
10. בחר המושבות הנכונות ולהרחיב את ייצור ה- DNA באמצעות איכות גבוהה, רעלן פנימי ערכת הכנת פלסמיד חופשית.
11. Elute DNA במים סטריליים או 1 מ"מ טריס-HCl. DNA החנות ב -20 ° C עד מוכן להזרים לילודים.

2. Intra-חדרית זריקות ילודים

1. שלושה עד ארבעה שבועות לפני הניסוי, להגדיר את כלוב רבייה עכבר עם זכר אחד ונקבה אחת עכבר, ואיגלו פלסטיק צבעוני. זה מספק סביבה מועשרת ומסייע בתהליך ההזדווגות.
2. כאשר הריון הוא אישר, להסיר את מ 'אייל לכלוב חדש. שמונה עשרה ימים לאחר ההזדווגות, לפקח כלוב יומי למסירה. לבצע זריקות תוך חדרים ביום הלידה 1 (P1).
3. הכנת התמיסה להזרקה
   הערה: פתרון ההזרקה נעשה על ידי ערבוב פלסמיד דנ"א עם מגיב transfection ליצור החלקיקים לtransfection. להלן דוגמא על הכנת פתרון הזרקה באמצעות פלסמיד קידוד transposase היפיפה הנרדמת ולוציפראז: pt2 / SB100x-לוק ושני פלסמידים transposon: PT / CAGGS-NRASV12 וPT / CMV-SV40-LGT, ביחס של 1: 2: 2. כל פלסמידים ריכוז של 2 מיקרוגרם / μl. פרטים חשובים על הכנת פתרון ההזרקה מוצגים בדיון.
   1. הכן את פתרון ה- DNA על ידי הוספה: 4 מיקרוגרם (2 μl) של pt2 / SB100x-לוק, 8 מיקרוגרם (4 μl) של PT / CAGGS-NRASV12 ו -8 (μl 4) מיקרוגרם של PT / CMV-SV40-LGT ו -10 μl 10% גלוקוז לנפח סופי של 20 μl בריכוז של 1 מיקרוגרם / מיליליטרDNA וגלוקוז 5%.
   2. הכן את פתרון PEI על ידי הוספת 2.8 μl של in vivo סילון PEI, 7.2 μl של מים סטריליים, ו -10 μl של גלוקוז 10% לריכוז סופי של גלוקוז 5%.
   3. מוסיף את פתרון PEI לפתרון ה- DNA, לערבב ומערבולת ולתת לשבת בטמפרטורת חדר (RT) במשך 20 דקות. הפתרון הוא מוכן להזרקה עכשיו. לאחר שעה אחת בRT, לשמור על הפתרון על קרח.
   4. להתאים מזרק נקי 10 μl מצויד במחט מזרק 30 מד עם 12.5 מעלות פוע לmicropump (איור 2 # 1).
4. כדי לוודא תפקוד תקין של מערכת ההזרקה, להשתמש במזרק האוטומטי (איור 2 # 1) למשוך 10 μl מים לתוך המזרק ולאחר מכן רוקן את המזרק לחלוטין
5. לקרר את שלב stereotaxic הילוד (איור 2 # 3) עם תערובת נוזלית של קרח יבש ואלכוהול לטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
6. לגרום להרדמה על ידי הצבת את הגורים על קרח רטוב2 דקות. ההרדמה תמשיך במסגרת stereotaxic המקורר למשך השארית של ההליך. שמירה על הטמפרטורה של המסגרת מעל לאפס, בין 2-8 מעלות צלזיוס תמנע פציעות לשרוף תרמית. כפי שניתן עטופים בגזת גורי אמצעי זהירות מיוחדת לפני הצבת על קרח רטוב.
7. מלא את המזרק עם פתרון ה- DNA / PEI.
8. לשתק את הגור במסגרת stereotaxic ידי הצבת ראשו בין סורגי הגזה מכוסות אוזן (איור 2b). ודא שהצד הגבי של הגולגולת הוא אופקי, במקביל למשטח של המסגרת ושתפרי הגולגולת נראה בבירור. נגב את הראש עם 70% אתנול.
9. מנמיכים את המחט של המזרק ולהתאים קואורדינטות stereotaxic באמצעות חיוג של מסגרת stereotaxic עד המחט נוגעת למבדה (צומת קו האמצע של הקודקודית ועצמות עורפיות) (איור 2b).
10. הרם את המחט ולהתאים את קואורדינטות stereotaxic 0.8 מ"מ לרוחב 1.5 מ 'ומקורי מ 'למבדה (איור 2b).
11. מנמיכים את המחט עד שהוא נוגע ומעט גומות בעור. מדוד את הקואורדינטות. מנמיכים את המחט עוד 1.5 מ"מ. המחט לחדור את העור והגולגולת, ועוברת דרך הקליפה להיכנס לחדר לרוחב (איור 2 ג).
12. שימוש במזרק האוטומטי, להזריק 0.75 μl של פתרון ה- DNA / PEI בשיעור של 0.5 μl / min
13. שמור את הגור במסגרת עוד דקה כדי לאפשר הפתרון לפיזור לתוך החדרים. בינתיים, להרדים גור אחר, על קרח למשך 2 דקות בהכנה להזרקה הבאה.
14. בעדינות ולאט לאט להרים את המחט, והנח את הגור תחת מנורת חימום. לפקח נשימה ופעילות. במידת צורך, לספק גירוי עדין של הגפיים עד הנשימה הראשונה מתפתחת.
15. להחזיר את הגור לאמו לאחר שהתחמם, הגיע צבע ורוד, הוא נושם באופן קבוע ופעיל, בדרך כלל 5-7 דקות. אם מומחדש מגור אחד מוזרק בכל פעם, לשמור את כל הגורים ביחד עד שכל הזריקות נעשות. אם זריקות להימשך זמן רב יותר מ -30 דקות, לחזור מחצית מהגורים לאחר 30 דקות הראשונות והשאר בסוף ההליך.
16. לפקח כי הסכר הוא מגיב וטיפוח לגוריה. במידת צורך, להוסיף את אמא פונדקאית לכלוב.
17. ודא שהמרווח בין הצבת הגור על קרח ומניח אותה מתחת לפנס ההתחממות הוא פחות מ -10 דקות. ההליך מהיר יותר ההישרדות. בדרך כלל, הזמן שנדרש כדי להרדים ולהזריק גור הוא 4 דקות.

3. ניטור פליטת אור של היווצרות גידול והתקדמות

3.1) ניטור פלסמיד ספיג לאחר הזרקה

1. 24-72 שעות לאחר הזרקה, להסיר את כל הגורים מהכלוב של האמא והמקום בצלחת 6 תרבית רקמה גם נקייה, גור אחד בכל טוב.
2. הכן פתרון 30 מ"ג / מיליליטר של luciferin המומס בתמיסת מלח או phosphat רגיליםמאגר דואר. הכן את הפתרון הזה מראש ולשמור בaliquots הקטן ב -20 ° C.
3. באמצעות מזרק 1 מיליליטר מצויד במחט מזרק 30 מד להזריק 30 μl של תת-עורית luciferin בין השכמות של הגור. ודא שהמחט לא לנקב כל איברים, על ידי צובט את העור והרמתו מעט לפני החדרת המחט.
4. תמונה באופן מיידי, באמצעות vivo מערכת הדמיה פליטת אור ב. לספקטרום IVIS, השתמש בהגדרות הבאות לרכישות: החשיפה אוטומטית, binning הגדולה, וצמצם f = 1.

3.2) היווצרות גידול ניטור והתקדמות

הערה: בעלי חיים יתחילו להרכיב גידולים מקרוסקופית לזיהוי על ידי פליטת אור והיסטולוגיה בתוך ½ 2-6 שבועות, בהתאם לפלסמידים שהעור המוזרקים.

1. באמצעות מזרק 1 מיליליטר מצויד במחט 26 מד להזריק של פתרון luciferin 30 מ"ג / מיליליטר 100 μl התוך peritoneally.
2. מניחים את החיה בתא ההרדמה. להזריק עד חמישה בעלי חיים באותו הזמן.
3. חכה 5 דקות ואז להתחיל את זרימת החמצן / isoflurane (1.5-2.5% isoflurane) כדי להרדים את בעלי החיים. לאחר 3-4 דקות, להסיר את בעלי החיים מחדר ההרדמה, להתחיל את זרימת החמצן / isoflurane בתא פליטת אור. מניחים את החיות במשבצות המתאימות מצוידים בקונוסים האף זכוכית כדי לאפשר להרדמה והמעבר בלא הפרעה של אור.
4. בדרך כלל, לרכוש סדרה של 6 תמונות, ב -2 דקות במרווחים עם זמן אוטומטי חשיפה, binning החציון וצמצם פתוח של f = 1.
5. הגדר את האזור של עניין לכל החיות הדמיה, בדרך כלל סגלגל על אזור הראש, ולמדוד את עוצמת הארה באמצעות הפוטונים יחידות מכוילים / sr / סנטימטר / s ^2.
6. רשום את הערך המקסימאלי עבור כל חיה. בהמשך לכך, ניתן להשוות הקלטות במהלך ההתקדמות של הגידול עבור כל חיה ו / או בין בעלי החיים, למשל when טיפולים שונים מועסקים.

4. ניתוח היסטולוגית ואימונוהיסטוכימיים של ניו GBMs

הערה: כאשר הגידולים הגיעו לנקודת זמן הניסוי הרצויה, אפשר להקריב בעלי חיים, מוח perfused, קבוע ונותח. להישרדות מנתח את השלב הגוסס מייצג את נקודת הסיום של הניסוי, כאשר בעלי חיים מוקרבים באנושיות בסימנים הראשונים של נטל גידול, כפי שהוגדרו על ידי השלב הקליני כאשר החיה הופכת את הניידות מראה סימפטומטי לקוי, יציבה כפופה ופרווה מוזנחת. תיאור קצר של השיטות היסטולוגית וחיסוניות histochemical הסטנדרטי המשמשות מוצג להלן.

4.1) זלוף וקיבוע

1. להרדים את העכבר עם זריקה תוך הצפק של 100 מ"ג / קילוגרם של קטמין ו -10 מ"ג / קילוגרם של xylazine.
2. בדוק את רפלקס הדוושה ידי צובט את הרגל של העכבר. כאשר הרפלקס הזה בוטל, הרדמה עמוקה מצביעה, immobilize את העכבר על קרש חיתוך עם סיכות, לפתוח את חלל הבטן, לנתח את הסרעפת ולפתוח את חלל בית החזה כדי להמחיש את הלב.
3. הכנס צינורית 20 מד בוטה לתוך החדר השמאלי של הלב. חבר את הצינורית עם צינורות פלסטיק עוברים דרך משאבת peristaltic למכל עם הפתרון של Tyrode מחומצן וheparinized (0.8% NaCl, .0264% CaCl ₂ 2H ₂ O, 0.005% לאא ₂ PO _4, גלוקוז 0.1%, 0.1% ₃ NaHCO, 0.02 % KCl). התחל את הזרימה של הפתרון של Tyrode על ידי התאמת המהירות של משאבת peristaltic כדי להבטיח זרימה איטית וקבועה, כ טיפה אחת לשנייה או פחות, אם בעלי החיים הם קטנים יותר.
4. לעשות חתך קטן לעלייה הימנית של הלב, כדי לאפשר הניקוז של דם וTyrode של.
5. צג יעילות זלוף על ידי התבוננות לבנה לאיברים פנימיים (ברורים ביותר בכבד ובכליות) כאשר הם הופכים נטולי דם.
6. כשפתרון ניקוז מהלב הוא ברור (3-5 דקות), לעבור את הפתרונות מTyrode של לparaformaldehyde 4% לקיבוע (4% PFA, pH 7.34 בנאגרו מלוח פוספט).
7. צג קיבעון טוב של הרקמות על ידי הקשיחות המוגברת של הצוואר והזנב.
8. לערוף את העכבר ולנתח בזהירות את המוח מהגולגולת.
   1. משוך את הפרווה שמכסה את הגולגולת rostrally, לכיוון האף, ולתפוס אותו בחוזקה כדי לייצב את הראש, צד עד גב.
   2. באמצעות אזמל חד, לחתוך כלפי מטה לאורך קצה המסלול, ותחצה את השרירים מסלולית והקשתות הזיגומטית הבסיסיות.
   3. לסובב את הראש כלפי מעלה הגחון ולהסיר את שרירי צוואר מצורפים באמצעות rongeur. לרסק את החוליה הראשונה ולהסיר אותו מגזע המוח.
   4. דמיין את השבלול, לתפוס את העצם הטמפורלית שמעליה עם rongeur וליצור פתיחה בין העצם הטמפורלית ועורפי. לקלף את העצם העורף מפני שטח של המוח הקטן.
   5. למחוץ את העצם שמעל האף עם rongeur. מוציא בזהירות את חזיתי שנותר והקודקודית עצמות מפני שטח של להיות מודע שלא לפגוע בשטח של מוח המוח. שים לב במיוחד באזור המסלול.
   6. הפעל צד הגחוני למעלה הראש. המוח יהיה להחליק למטה משאר הגולגולת, מחובר כעת אך ורק דרך עצבי גולגולת. מספריים קטנים באמצעות לחתוך את חוש הריח, ראייה ועצבי trigeminal. זה ישחרר את המוח.
9. מניחים מוח PFA 4% בין לילה ב 4 מעלות צלזיוס במשך פוסט-קיבעון.
10. לניתוח היסטולוגית וצביעת hematoxylin-eosin, להעביר את המוח לחיץ פוספט למשך 24 שעות ולאחר מכן להמשיך לפרפין הטבעה.
11. לניתוח חיסוני היסטולוגית, להעביר את מוח לפתרון סוכרוז 30% בנאגרו מלוח פוספט במשך 24-48 שעות (עד המוח לשקוע לתחתית של התחתית)
12. המוח של סעיף במחצית במרכזו של אזור הגידול, למקם את החתךצד למטה לתוך תבנית הקפאה, להטביע לתקשורת הטבעה-cryo (מתחם אוקטובר), ובזק-הקפאה בתרחיף של אתנול קרח יבש, איזופנטאן קרח יבש או בחנקן נוזלי. שמור קפואים בלוקים ב -80 ° C עד חתך וצביעה.

4.2) Hematoxylin-Eosin הכתמה של פרפין Embedded מוח לניתוח HISTO-פתולוגי של הפנימי GBMs

1. פרפין סעיף מוטבע מוח בעובי 4 מיקרומטר, לרדת באמבט מים 42 מעלות צלזיוס והר על גבי שקופיות זכוכית.
2. שקופיות De-paraffinize ידי הצבת אותם במשך 10 דקות בתנור שC ° 60 ולאחר מכן העביר אותם בשעה 5 דקות במרווחים באמצעות סדרה של שלוש מכולות שקופית מלאות בקסילן.
3. מימה השקופיות באמצעות סדרה של אמבטיות אתנול: 100% אתנול למשך 2 דקות, חזור פעם אחת, 95% אתנול למשך 2 דקות, חזור פעם אחת, 70% אתנול למשך 2 דקות ולאחר מכן להעביר שקופיות למים.
4. להכתים את השקופיות על ידי טבילתם במכל מלא בשקופיות האריס Hematoxylin עבור 2 דקות.
5. יש לשטוף במים ברז עד המים הוא ברורים.
6. טובלים מחליק פעמיים לתוך הפתרון מכחיל (0.1% סודיום ביקרבונט).
7. בואו שקופיות לעמוד במים ברז למשך 2 דקות, ולאחר מכן להעביר עד 80% אתנול למשך 2 דקות.
8. להכתים את השקופיות על ידי טבילתם במכל מלא בEosin במשך 5 דקות.
9. מייבשי שקופיות בסדרה של אמבטיות אתנול (מטבלים 3-4 אתנול 80%, 95% אתנול דקות 2, חוזרים פעם אחת, 100% אתנול דקות 2, חוזרים פעם אחת).
10. בהיר עם 3 אמבטיות רצופות של קסילן, 3 דקות כל אחד.
11. Coverslip עם הרכבה בינונית מבוסס קסילן ולתת להתייבש על משטח שטוח בטמפרטורת חדר עד מוכן להדמיה. אחסן בטמפרטורת חדר.

4.3) חיסונית-היסטוכימיה של השתמר Cryo מוח המשובץ למולקולרי והתאי של אפיון De Novo המושרה GBMs

1. אחזר קפואים בלוקים מאחסון -80 מעלות צלזיוס, המקום לתוך cryostat ולאפשר טמפרטורות לאזן למשך 30 דקות.
2. סעיף 12-14 סעיפים ועבים מיקרומטר הר 2-3 חלקים על גבי שקופיות זכוכית טעונות חיובי. לחתוך קטעי סדרתי, על ידי איסוף חלקים סמוכים בשקופיות שונות. זה מאפשר צביעה עם נוגדנים שונים בסעיפי רקמות סמוכים בתוך הגידול.
3. מגלשות יבשים בתא ייבוש במשך שעה לפחות 1 לאחר חתך כדי לאפשר לדבקות טובה של הרקמה.
4. צור מחסום הידרופובי (עם סמן הידרופובי) בכל קצה של השקופית כדי לאפשר לנוזלים כדי לכסות את החלקים ולהישאר על השקופיות במהלך שוטף. מכסה את החלקים עם פתרון של בופר פוספט עם 0.1% Triton-X (PBS 0.1% Tx) ובעדינות לנער במשך 5 דקות על שייקר אופקי לpermeabilize הרקמה. חזור פעמיים.
5. לחסום ספציפי מחייב עם פתרון של 10% בסרום נורמלי עז (או סרום מהחיה שבו הנוגדנים משני הועלו) למשך 30 דקות עם רעד עדין
6. הכן פתרון נוגדן ראשוני ב 2% עזים בסרום נורמלי בPBS 0.1%Tx ופיפטה הפתרון על הסעיפים. הנח שקופיות בתא לח מכוסה בחושך ולשמור בטמפרטורת חדר למשך לילה.
7. למחרת, לשטוף חלקים שלוש פעמים ל5 דקות עם PBS 0.1% Tx דגירה בנוגדנים משני פלורסנט המדולל ב -2% עזים בסרום נורמלי PBS 0.1% Tx לשעה אחת.
8. לשטוף חלקים שלוש פעמים ל5 דקות עם PBS 0.1% Tx, counterstain עם כתם גרעיני (למשל, DAPI) למשך 2 דקות, לשטוף פעם נוספת, ברור במים וcoverslip עם מים הרכבה בינונית שישמרו על הקרינה מבוססת. הנח שקופיות על משטח שטוח ולתת להם לרפא לפחות 24 שעות, בחושך, עד מוכן להדמיה. שמור על 4 מעלות צלזיוס לאחר מכן.

5. דור של שורות תאי גידול ראשוני עם שינויים גנטיים ספציפיים.

1. כדי ליצור שורות תאים משנת עכברי נושאי גידול יופי לבחור עכבר עם גידול גדול אישר (פליטת אור 10 ⁷ -10 ⁸ פוטונים / s / סנטימטר2 / sr).
2. להרדים את העכבר עם מנת יתר של חומר ההרדמה isoflurane, לערוף את החיה ובזהירות לנתח את המוח מהגולגולת (כמפורט בסעיף 4). מניחים את המוח בצלחת פטרי נקייה.
3. באמצעות סכין גילוח, להפוך קדמי קיצוצי העטרה ואחורית לגידול. המיקום של הגידול הוא בדרך כלל לזיהוי בשל השקיפות של המוח.
4. לנתח את הגידול, בדרך כלל 5-7 מ"מ קוטר עם מלקחיים עדינים ומקום לתוך צינור 1.5 מיליליטר מלא Media תאי גזע עצבי 300 μl (NSC מדיה: DMEM / F12 עם B-27 תוסף, תוסף N2, וNormocin, בתוספת EGF האנושי רקומביננטי וbFGF בריכוז של 20 ng / ml כל אחד).
5. בעדינות homogenize גידול עם העלי פלסטיק, אשר מתאים לקירות של הצינור.
6. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת דיסוציאציה רקמות ללא אנזים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
7. עובר השעיה תא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר, לשטוף את המסננת עם 10 מיליליטר שלתקשורת NSC, צנטריפוגות ב 300 XG למשך 4 דקות, supernatant למזוג מחדש להשעות גלולה ל7 מיליליטר של תקשורת NSC.
8. צלחת על בקבוק תרבות T25 ותרבות על 37 מעלות צלזיוס בחממה רקמת תרבות עם ואווירה של 95% אוויר, 5% CO _2. אחרי 3 ימים, כמה תאים שמתו, כמה דבקו בתחתית צלחת התרבות, וחלקם neurospheres יוצרים, צף בחופשיות בתקשורת.
9. הסרת תאים אלה מושעים ומחדש צלחת על בקבוק תרבות רקמת T75.
10. אחרי עוד שלושה ימים של תרבות, לאסוף neurospheres, לנתק כמתואר בשלב 5.6, מתח דרך מסננת תא ולספור תאים. להקפיא aliquots של תאים בעובר בסרום שור 10% DMSO ותאי מעבר בצפיפות של מיליון תאים ב 14 מיליליטר של המועצה לביטחון לאומי בתוספת EGF וFGF לבקבוק T75. שיעור הצמיחה יהיה תלוי באונקוגנים המשמשים ליצירת גידולים. להתאים תנאי תרבית תאים, כדי למנוע צמיחת יתר ולשמור על תאים בצפיפות גבוהה יחסית.

תוצאות

לאפיין תכונות histo-פתולוגי של glioblastomas המושרה SB, עכברים בילוד C57 / BL6 הוזרקו בP1 עם לוציפראז קידוד פלסמיד (pt2 / SB100x-לוק) בשילוב עם פלסמידים קידוד transposons עם DNA שעור, כלומר, NRAS (PT / CAGGS -NRASV12) וSV40 LGT (PT / CMVSV40-LGT) (איור 3c) או קידוד פלסמיד p53 קצר סיכת ראש עם PDGFβ וכתב ה- GFP (pT2shp53 /...

Discussion

במאמר זה, אנו פירוט שיטה תכליתית ושחזור ליצירת מודלים חדשים של GBM באמצעות שילוב transposase- SB בתיווך של פלסמיד דנ"א שעור לתאים המקיפים את אזור subventricular של עכברים בילוד. אנו מציגים פרוטוקול להפקת פלסמידים transposon עם גנים חדשים של עניין, להמחיש כיצד לפקח על ההתקדמות של הגידו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors	Stoelting	51670	Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Injections can be made without it, ,but    the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience
10 μL 700 series hand fitted MICROLITER syringe	Hamilton	Model 701	This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used
30 gauge gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel)	Hamilton	S/O# 197462	This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced.
in vivo-jetPEI	Polyplus Transfection	201-10G	Aliquot in small volumes and keep at -20oC
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio.com	LuckK-1g	Other sources of firefly lucifierase are just as adequate
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich	HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Electron Microscopy Sciences	62550-01	for embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry
Advanced DMEM/F-12, no glutamine	Life Technologies	12634-010	for the culture of neurospheres
B-27¨ Supplement (50X), serum free	Life Technologies	17504-044	serum free supplement for the culture of neurospheres
N2 Supplement (100x)	Life Technologies	17502-048	serum free supplement for the culture of neurospheres
Normocyn	InvivoGen	ant-nr-1	anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres
Recombinant Human EGF	PEPROTECH	AF-100-15	growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Recombinant Human FGF-basic	PEPROTECH	100-18B	growth factor supplement for the culture of  neurospheres
HyClone HyQTase  Cell Detachment Reagent	Thermo Scientific	SV3003001	for the dissociation of neurospheres
Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749510-0590	for the dissociation of freshly dissected tumors
Falcon Cell Strainers mesh size 70um	Fisher Scientific	08-771-2	for generating single cell suspensions of dissociated neurospheres
Xylenes Histological grade	Fisher Scientific	C8H10
Protocol Harris Hematoxylin Mercury free ( acidified)	Fisher Scientific	245-678
Protocol Eosyn Y Solution ( intensified)	Fisher Scientific	314-631