Transposon Mediated Integração de DNA plasmídeo na zona subventricular de Neonatal Ratos para gerar modelos novela de Glioblastoma

Resumo

Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.

Resumo

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.

Introdução

O glioblastoma multiforme (GBM) é o (60%) de tumor cerebral primário mais comum em adultos, com uma sobrevivência média de 15-21 meses, quando tratados com cirurgia, radioterapia, quimioterapia e ^1. Os novos tratamentos para GBM são imperativos. Terapias experimentais requerem testes em modelos animais que se reproduzem de forma adequada as principais características da doença humana. Estratégias para induzir GBM em roedores incluem mutagênese química com agentes alquilantes, germline ou alterações genéticas somáticas, ou transplante utilizando linhas celulares de glioma ^2. Os modelos mais correntemente utilizados empregam a implantação de linhas de células de glioma, ou ortotopicamente, para dentro do cérebro ou por via subcutânea, utilizando células singeneicas em animais com genótipo idêntico; ou xenogénicas, linhas mais comumente humanos de células de GBM, implantados em camundongos ³ imunológico comprometido. Os xenoenxertos oferecem muitas vantagens para o estudo de tumores intracranianos: conveniência de reprodutibilidade, Standataxas de crescimento rdized, hora da morte e localização do tumor. No entanto, estes modelos têm limitações devido à abordagem cirúrgica artificial, invasivo utilizado para implantes e limitada capacidade de reproduzir com precisão histológico apresenta característica de GBM humano (OMS grau IV): necrose pseudo-pallisading, atipias nucleares, invasão difusa, a proliferação de micro-vascular e a formação de anormalidades vasculares glomerulóides ^4-7. Indução de GBM por alterar o genoma de células somáticas com ADN oncogénico, ou com vectores virais ^8-12, ou com integração mediada por transposão ^13, reproduz mais de perto a etiologia da doença humana e recapitula características histopatológicas de GBM humano.

Historicamente, os tumores do SNC foram classificados com base na célula percebida de origem, o que foi observado, seria um fator preditivo de sobrevivência ^14. GBMs são classificadas em primárias e secundárias. Emergentes evidência today aponta para a natureza altamente heterogêneo de glioblastoma ¹⁵ primário. GBM secundário (15%), o resultado da transformação maligna de astrocitoma de baixo grau (OMS grau I) e astrocytomas anaplasic (OMS grau II), estão associados com início mais precoce da doença, melhor prognóstico e um padrão de "proneural" da expressão gênica , enquanto que GBM primário (85%) mostram um início tardio, o prognóstico pobre e glial (clássica), neural ou padrões de expressão mesenquimais. Se estes padrões de expressão de genes correlacionam-se com a célula de origem real do tumor é ainda a ser activamente investigados. A acumulação de dados mostra que a combinação de mutações genéticas associadas com GBMs são preditivos para a sobrevivência. Por exemplo, a perda de heterozigose (LOH) de cromossomos 1p / 19q, mutações IDH1, PDGFRα ampliações, estão associados com GBMs secundárias, padrão de expressão proneural e melhor prognóstico, enquanto que a superexpressão de EGFR, Notch e Sonic hedgehog ativação da via, Nf1 e PTEN perda e mutações do p53 estão correlacionados com neural, clássica, ou GBM primário mesenquimais e pior prognóstico ^16,17. O advento dos projetos de seqüenciamento em larga escala e da acumulação de numerosos espécimes de pacientes disponíveis para teste traz uma riqueza de novas informações no que diz respeito a mutações genéticas e os caminhos envolvidos na GBM patogênese e progressão ea possibilidade de medicina individualizada, onde terapias pode ser adaptado especificamente para as anormalidades genéticas do paciente. Em última análise, para avaliar o valor preditivo destas mutações e caminhos de uma forma sistemática, e para testar possíveis tratamentos para cada caso, requer modelos animais de GBM com alterações genéticas pré-determinados. Transposon integração mediada de DNA genômico oferece uma abordagem viável.

O sistema transposon Bela Adormecida, membro da classe / mariner Tc1 de transposons, foi "acordado" (construído) em um proce multi-passoss de mutagênese sítio específico de um gene transposase salmonóide, que se tornou mais dormente de 10 milhões de anos atrás ^18,19. Em essência, os transposons de ADN flanqueadas por sequências específicas (repetições invertidas / repetições directas: IR / DR) podem ser integrados no genoma de uma maneira "corta e cola" por meio da actividade da transposase sono de beleza. A transposase reconhece os extremos dos sites de RI, extirpa o transposão e integra aleatoriamente em um outro local de ADN entre as bases de T e A, bases que são duplicados em cada uma das extremidades do transposão durante transposição (Figura 1a). O sono transposase beleza é composta por três domínios, um domínio de ligação de transposões, uma sequência de localização nuclear e um domínio catalítico. Quatro moléculas de transposase são necessárias para aproximar as duas extremidades do transposão em conjunto e permitir a transposição, no entanto, se demasiadas moléculas de transposase estiver presente, pode dimerizar e tetramerize para inibira reacção de transposição ^20. Uma reação transposição eficiente requer uma ótima relação de transposase de transposons. O ADN que codifica para a transposase pode ser entregue no mesmo plasmídeo com o transposão (em cis) ou num plasmídeo diferente (em trans). Para assegurar a relação óptima entre a transposase e os transposões, um promotor com actividade adequada pode ser escolhido para a expressão da transposase (para o modelo de "cis") ou a relação de plasmídeos na solução injectável podem ser optimizados (para o modelo de "trans"). O sistema transposon Bela Adormecida pode ser utilizado com sucesso para a genómica funcional, mutagênese insercional, transgenia e terapia genética somática ^21. Sendo uma construção sintética re-projetado para uma molécula funcional a partir de uma variante salmonóide dormente, Sleeping Beauty transposase não se liga a outros transposons em seres humanos ou outros mamíferos ^20. Desde a sua descoberta, a engenharia molecular tem enhanced transposição a eficácia do sistema de transposão SB através da modificação das sequências IR e adição de dinucleótidos TATA flanqueando o transposão, resultando nos transposões PT2. Estes transposons tem otimizado ligação do SB ao site IR e aumento da eficácia da excisão. A transposase SB também passou por melhorias significativas; transposase utilizado em experiências aqui apresentadas é o SB100X, uma transposase hiperactivo gerado por uma estratégia de arranjo combinatório de ADN seguido por um rastreio genético em larga escala em células de mamífero ^22.

Neste relatório apresentamos um método rápido, versátil e reprodutível para induzir intrínseca GBM em camundongos com, integração mediada por transposon não-viral de DNA plasmídeo em células da zona sub-ventricular de ratos neonatal ^23. Nós apresentamos uma maneira simples de criar transposons com novos genes passíveis de integração genômica usando o sono transposase Beleza e demonstrar como monitorar a captação plasmídeo eprogressão da doença usando a bioluminescência. Nós também caracterizar as características histológicas e imuno-histoquímica do GBM reproduzido com este modelo. Além disso, apresentamos um método rápido para gerar linhas de células de GBM primárias destes tumores. O modelo de beleza do sono, em que os tumores são induzidos a partir de células originais ao animal, permite a avaliação funcional do papel dos genes candidatos GBM na indução e a progressão de tumores. Este sistema também é bem adequado para o teste de tratamentos novos GBM, incluindo terapias imunológicas em ratos imuno-competentes, sem a necessidade de procedimentos cirúrgicos invasivos inflamatórias, que podem alterar o microambiente local.

Protocolo

NOTA: Todos os protocolos de animais foram aprovados pela Universidade de Michigan Comitê para o Uso e tratamento dos animais (UCUCA).

1. Clonagem da sequência de interesse em novos dormir Transposons Beleza

Observação: para inserir genes ou elementos inibidores (como shRNA), utilizando o sistema de transposase Bela Adormecida, clonar a sequência de interesse para a espinha dorsal de uma pKT ou pT2 plasmídeo. Dirigir a clonagem de tal modo que os elementos reguladores, o gene de interesse e marcadores permanecem flanqueado pelas repetições invertidas (IR / DR). Um exemplo de clonagem PDGFβ em uma espinha dorsal pKT é detalhado abaixo (ver também a Figura 1b).

1. Digest 5 ug do plasmídeo vector pKT-IRES-Katushka durante 4 horas a 37 ° C, com 5-10 unidades de enzimas de restrição Xbal / Xhol em 50 uL de volume de reacção.
2. Digerir o mPDGFβ ADNc de 5 ug do plasmídeo pGEM-T-mPDGFβ durante 4 horas a 37 ° C, com 5-10 unidadess de enzimas de restrição NcoI / SacI.
3. Precipitar o DNA total por adição de 2,5 volumes de etanol a 100%, e 1/10 de volume de 3 M acetato de Na, pH 5,8 e incuba-se durante a noite a -20 ° C.
4. Centrifuga-se as amostras a 13.800 xg durante 15 min.
5. Lava-se a pelete de ADN com 500 ul de etanol a 70%, centrifugar a 13.800 xg durante 1 min, repetir uma vez e re-suspender em 19 ul de água estéril livre de DNase.
6. Siga as instruções do fabricante na rápida embotamento Kit para diminuir as extremidades de ambos vetor (pKT-IRES-Katushka) e insira (mPDGFβ).
7. Coloque o vector embotado e inserir em um 1,2% brometo de etídio gel de agarose corado e executado em 80 V para 40 min. Visualizar as bandas, extirpar-los com uma lâmina de barbear e gel limpa purificar o ADN utilizando um kit de purificação em gel de acordo com o protocolo do fabricante.
8. Ligadura da inserção e vector DNA purificado no passo 1.7, adicionando-os em um tubo em uma proporção de 4: 1 molar (insert: vector). Dentro deste tubo, pipette 1 ml de T4 ligase e 2 mL de tampão de ligase T4 (contendo ATP), e ajustar o volume para 20 l com água estéril. A reacção de ligação incubar durante 18 horas a 16 ° C.
9. Transformar células bacterianas DH5ct quimicamente competentes os produtos ligados.
   1. Descongele as células competentes no gelo.
   2. Adicionar o volume total de reacção de ligação a 50 ul de células competentes, agitar suavemente o tubo e incubar a mistura em gelo durante 30 min. De choque de calor as bactérias para 45 segundos a 42 ° C e retornar imediatamente para gelo; incubar em gelo durante mais 2 min.
   3. Adicionar 950 mL de caldo de Luria para a cultura e incuba-se com agitação a 37 ° C durante 1 h. Bactérias centrifugar a 2400 xg por 3 min e re-suspender o sedimento em 200 mL de LB.
   4. Espalhe as bactérias transformadas em placas de Petri revestidas com LB-agarose e o antibiótico correspondente. Incubar a placa durante a noite a 37 ° C.
   5. Finalmente, coletar 5-10 bactericidarial colónias e cultura durante a noite a 37 ° C em 5 ml de meio LB com antibióticos.
   6. Purifica-se o ADN de plasmídeo utilizando um mini-kit de plasmídeo de ADN de acordo com as instruções do fabricante. Realizar uma restrição de diagnóstico digerir para verificar a incorporação correcta da inserção no vector e submeter os clones positivos por sequenciação de ADN para assegurar a orientação correcta da inserção.
10. Selecione as colônias corretos e ampliar a produção de ADN usando uma alta qualidade, livre de endotoxina kit preparação plasmídeo.
11. Elui-se o ADN em água estéril ou 1 mM Tris-HCl. DNA Armazenar a -20 ° C até estar pronto para injetar em recém-nascidos.

2. intra-ventriculares Neonatais As injecções

1. Três a quatro semanas antes de experimentar, criar um mouse de reprodução gaiola com um macho e uma fêmea de ratinho, e um iglu de plástico colorido. Isso proporciona um ambiente enriquecido e auxilia o processo de acasalamento.
2. Quando a gravidez é confirmada, remover o male para uma nova gaiola. Dezoito dias depois do acasalamento, monitorar gaiola diariamente para a entrega. Realizar injecções intraventriculares no dia pós-natal 1 (P1).
3. Preparação da solução injectável
   NOTA: A solução para injecção é preparada por mistura de ADN de plasmídeo com o reagente de transfecção para criar as partículas para a transfecção. Abaixo está um exemplo sobre a preparação de uma solução de injeção utilizando um plasmídeo que codifica a transposase Bela Adormecida e luciferase: pT2 / SB100x-Luc e dois plasmídeos transposon: PT / CAGGS-NRASV12 e pT / CMV-SV40-LGT, em uma proporção de 1: 2: 2. Todos os plasmídeos têm uma concentração de 2 ug / uL. Detalhes importantes sobre a preparação da solução injectável são apresentados na discussão.
   1. Preparar a solução de DNA pela adição: 4 mg (2 ul) de pT2 / SB100x-Luc, 8 mg (4 ul) da PT / CAGGS-NRASV12 e 8 mg (4 ul) de pT / CMV-SV40-LGT e 10 ul de glucose a 10% para um volume final de 20 uL a uma concentração de 1 ug / mlADN e 5% de glucose.
   2. Preparar a solução de PEI por adição de 2,8 ul de jacto in vivo PEI, 7,2 ul de água estéril, e 10 ml de glicose a 10% para uma concentração final de 5% de glucose.
   3. Adicionar a solução de PEI para a solução de ADN, misturar e agitar com vortex e deixar repousar à temperatura ambiente (TA) durante 20 min. A solução já está pronto para a injecção. Após uma hora à temperatura ambiente, manter a solução em gelo.
   4. Coloque um 10 jul seringa limpa equipada com uma agulha hipodérmica de calibre 30 com 12,5 ° bisel na micropump (Figura 2 # 1).
4. Para verificar o bom funcionamento do sistema de injecção, utilizar o injector automático (Figura 2 # 1) para retirar 10 mL de água para dentro da seringa e, em seguida, esvaziar a seringa totalmente
5. Arrefece-se a fase neonatal estereotáxico (Figura 2 # 3) com uma suspensão de gelo seco e álcool a uma temperatura de 2-8 ° C.
6. Induzir a anestesia, colocando os filhotes no gelo molhadodurante 2 min. Anestesia continuará na armação estereotáxica arrefecida para o resto do procedimento. Mantendo a temperatura do quadro acima de zero, entre 2-8 ° C irá impedir queimaduras térmicas. Como filhotes de precaução especial pode ser envolto em gaze, antes de colocar no gelo molhado.
7. Encher a seringa com a solução de ADN / PEI.
8. Imobilizar o cachorro no quadro estereotáxico, colocando sua cabeça entre os cobertos com gaze barras de ouvido (Figura 2B). Assegurar que o lado dorsal do crânio é horizontal, paralelo à superfície da armação e que as suturas cranianas são claramente visíveis. Limpe a cabeça com etanol 70%.
9. Abaixe a agulha da seringa e ajustar coordenadas estereotáxica usando mostradores do quadro estereotáxico até que a agulha toca o lambda (a intersecção da linha média do parietal e occipital ossos) (Figura 2b).
10. Levante a agulha e ajustar coordenadas estereotáxica para 0,8 mm lateral e 1,5 mm rostral para o lambda (Figura 2b).
11. Abaixe a agulha até que ela toque e um pouco ondulações na pele. Medir as coordenadas. Abaixe a agulha mais 1,5 mm. A agulha vai perfurar a pele e crânio, e passar através do córtex para entrar no ventrículo lateral (Figura 2c).
12. Usando o injector automático, 0,75 ul de injectar a solução de ADN / PEI a uma taxa de 0,5 mL / min
13. Manter o cachorro na armação por mais um minuto para permitir a solução para dispersar para os ventrículos. Nesse meio tempo, anestesiar outro cachorro, em gelo durante 2 min, em preparação para a próxima injeção.
14. Devagar e com cuidado levante a agulha, e coloque o filhote sob uma lâmpada de aquecimento. Controlar a respiração e atividade. Se necessário, fornecer estimulação suave das pernas até a primeira respiração segue.
15. Retorne o cachorro para sua mãe depois de ter aquecido, atingiu uma cor rosada, está respirando regularmente e está ativo, normalmente 5-7 min. Se more de um cachorro é injectada a um tempo, manter todas as crias em conjunto até que todas as injecções são feitas. Se demorar mais injecções de 30 min, regresso metade dos bebés após os primeiros 30 min e o resto no final do procedimento.
16. Monitorar que a barragem é sensível e carinho para seus filhotes. Se necessário, adicione uma mãe de aluguel para a jaula.
17. Certifique-se de que o intervalo entre a colocação do filhote em gelo e colocando-o sob a lâmpada de aquecimento é inferior a 10 min. Quanto mais rápido o processo, melhor a sobrevivência. Geralmente, o tempo que leva para anestesiar e injectar um cachorro é 4 min.

3. Bioluminescência Monitoramento de formação de tumores e Progressão

3.1) Monitoramento plasmídeo Captação após a injeção

1. 24-72 horas após a injeção, remova todos os filhotes de gaiola da mãe e coloque em um 6 bem limpo prato de cultura de tecidos, um filhote de cachorro por poço.
2. Prepara-se uma solução / ml 30 mg de luciferina dissolvido em solução salina normal ou phosphate tampão. Prepara-se esta solução com antecedência e manter em pequenas alíquotas a -20 ° C.
3. Usando uma seringa de 1 ml equipado com uma agulha hipodérmica de calibre 30 injetar 30 ul de luciferina via subcutânea entre as omoplatas do filhote. Certifique-se de que a agulha não perfurar quaisquer órgãos, por beliscar a pele e levantando-a ligeiramente antes de inserir a agulha.
4. Imagem de imediato, usando um sistema in vivo de imagem de bioluminescência. Para o IVIS Spectrum, use as seguintes configurações para aquisições: Exposição automática, grande binning, ea abertura de f = 1.

3.2) Formação Monitoramento e progressão tumoral

NOTA: Os animais irão começar a formar tumores macroscópicos detectáveis ​​por bioluminescência e histologia dentro 2½-6 semanas, dependendo dos plasmídeos injectados oncogénicos.

1. Usando uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de calibre 26, injectar 100 ul de uma solução / luciferina ml 30 mg intra-peritonealmente.
2. Colocar o animal na câmara de anestesia. Injectar até cinco animais ao mesmo tempo.
3. Espere 5 min, em seguida, iniciar o fluxo de oxigênio / isoflurano (1,5-2,5% de isoflurano) para anestesiar os animais. Depois de 3-4 minutos, remover os animais a partir da câmara de anestesia, iniciar o fluxo de oxigénio / isoflurano na câmara de bioluminescência. Colocar os animais nas respectivas ranhuras equipadas com cones de nariz de vidro para permitir a passagem desobstruída de anestesia e da luz.
4. Tipicamente, adquirir uma série de seis imagens, a intervalos de 2 min com um tempo de exposição automática, bins mediana e uma abertura aberta da f = 1.
5. Defina a região de interesse para todos os animais fotografados, tipicamente um oval sobre a região da cabeça, e medir a intensidade da luminescência utilizando as unidades fótons calibrados / s / cm ² / sr.
6. A partir do valor máximo para cada animal. Subsequentemente, as gravações podem ser comparados durante a progressão do tumor para cada animal e / ou entre os animais, por exemplo when diferentes tratamentos são empregados.

4. histológica e imunohistoquímica Analysis of New GBMs

NOTA: Quando os tumores atingiram o momento experimental desejada, os animais podem ser sacrificados, os cérebros perfundidos, fixas e analisados. Para a sobrevivência analisa o estágio moribundo representa o ponto final do experimento, quando os animais são sacrificados humanamente aos primeiros sinais de carga tumoral, como definido pelo estágio clínico quando o animal se torna mostrando sintomático mobilidade prejudicada, postura arqueada e pele desalinhado. Uma breve descrição dos métodos histológicos e imuno-histoquímica padrão utilizados é apresentada abaixo.

4.1) Perfusão e Fixação

1. Anestesiar o rato com uma injecção intra-peritoneal de 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina.
2. Confira o reflexo pedal apertando o pé do mouse. Quando esse reflexo é abolido, anestesia profunda indicando, IMMOBilize o mouse em uma placa de dissecção com pinos, abrir a cavidade abdominal, dissecar o diafragma e abrir a cavidade torácica para visualizar o coração.
3. Inserir uma cânula romba de calibre 20 para o ventrículo esquerdo do coração. Ligar-se a cânula com um tubo de plástico que passa através de uma bomba peristáltica para um recipiente com solução de Tyrode oxigenada e heparinizado (NaCl a 0,8%, 0,0264%, CaCl ₂ 2H ₂ O, 0,005% de NaH ₂ PO _4, 0,1% de glucose, 0,1% de _NaHCO3, 0,02 % de KCl). Iniciar o fluxo de solução de Tyrode, ajustando a velocidade da bomba peristáltica para proporcionar um fluxo lento e constante, aproximadamente, uma gota por segundo ou menos, se os animais são menores.
4. Fazer uma pequena incisão na aurícula direita do coração para permitir a drenagem de sangue e de Tyrode.
5. Monitorar a eficiência de perfusão observando branqueamento de órgãos internos (mais óbvias no fígado e rim), como eles ficaram sem sangue.
6. Quando osolução de drenagem a partir do coração é clara (3-5 min), alternar as soluções de Tyrode do que 4% de paraformaldeído durante a fixação (4% PFA, pH 7,34 em tampão fosfato salino).
7. Monitorar boa fixação dos tecidos pelo aumento da rigidez do pescoço e a cauda.
8. Decapitar o mouse e cuidadosamente dissecar o cérebro do crânio.
   1. Puxe a pele que cobre o crânio rostralmente, em direção ao nariz, e agarrá-lo firmemente para estabilizar a cabeça, dorsal para cima.
   2. Usando um bisturi afiado, cortar para baixo ao longo da borda da órbita, para transecção os músculos orbitais e os arcos zigomática subjacentes.
   3. Vire a cabeça ventral lateral-se e remover os músculos do pescoço anexados usando um rongeur. Esmagar a primeira vértebra e removê-lo do tronco cerebral.
   4. Visualize a cóclea, pegue o osso temporal de sobreposição com o rongeur e criar uma abertura entre o osso temporal e occipital. Descascar o osso occipital da superfície do cerebelo.
   5. Esmagamento do osso que recobre o nariz com a rongeur. Cuidadosamente remover a restante frontal e parietal ossos a partir da superfície do cérebro sendo o cuidado de não danificar a superfície do cérebro. Preste atenção especial na área orbital.
   6. Gire a cabeça ventral lateral-se. O cérebro vai deslizar para baixo a partir do restante do crânio, agora conectado unicamente através dos nervos cranianos. Com uma tesoura pequena cortar o olfativo, ótico e nervos trigêmeos. Isso vai liberar o cérebro.
9. Coloque cérebro em PFA a 4% durante a noite a 4 ° C para pós-fixação.
10. Para a análise histológica e coloração hematoxilina-eosina, transferir os cérebros para tampão fosfato durante 24 horas e, em seguida, proceder à inclusão em parafina.
11. Para a análise imuno-histológica, transferir cérebro em solução de sacarose a 30% em solução salina tamponada com fosfato, durante 24-48 h (até os cérebros afundar para o fundo do tubo)
12. Cérebros seção na metade através do meio da região do tumor, coloque o cortelado para baixo dentro de um molde congelamento, embutir em media-incorporação crio (OCT composto) e flash-freeze em uma pasta de etanol de gelo seco, isopentano de gelo seco ou em nitrogênio líquido. Manter blocos congelados a -80 ° C, até o seccionamento e coloração.

4.2) Hematoxilina-eosina de Parafina Brains para Histo-patológico Análise de Intrínseca GBMs Incorporado

1. Seção parafina cérebros incorporado a 4 mm de espessura, cair em um banho de água a 42 ° C e montagem em lâminas de vidro.
2. Lâminas de-paraffinize, colocando-os durante 10 minutos em um forno a 60 ° C e, em seguida, transferi-los em intervalos de 5 min através de uma série de três recipientes cheios de deslizamento com xileno.
3. Hidratar as lâminas por meio de uma série de banhos de etanol: etanol a 100% durante 2 minutos, repetir uma vez, etanol a 95% durante 2 minutos, repetir uma vez, etanol a 70% durante 2 min e, em seguida, transferir lâminas de água.
4. Coloração das lâminas mergulhando-as em um recipiente de slides preenchido com hematoxilina de Harris por 2 min.
5. Enxágüe em água corrente até que a água é clara.
6. Dip desliza duas vezes em solução azulados (0,1% Bicarbonato de Sódio).
7. Vamos lâminas ficar na água da torneira por 2 min, em seguida, transferir para o etanol de 80% para 2 min.
8. Coloração das lâminas mergulhando-as em um recipiente cheio de Eosina para 5 min.
9. Desidratar diapositivos numa série de banhos de etanol (80% etanol, 95 mergulhos 3-4% de etanol 2 min, repetir uma vez, com 100% de etanol 2 min, repetir uma vez).
10. Limpar com 3 banhos consecutivos de xileno, 3 min cada.
11. Lamela com um meio de montagem à base de xileno e deixar secar sobre uma superfície plana, à temperatura ambiente até estar pronta para a imagiologia. Guarde-o em temperatura ambiente.

4.3) Imuno-histoquímica de Brains incorporados Cryo-preservados para Molecular and Cellular Caracterização de De Novo Induced GBMs

1. Recuperar blocos congelados a partir do armazenamento a -80 ° C, colocar em criostato e permitir que as temperaturas para equilibrar durante 30 min.
2. Seção 12-14 Mm de espessura e montar 2-3 seções em lâminas de vidro com carga positiva. Os cortes em série, através da recolha de seções adjacentes em diferentes slides. Isto permite que a coloração com anticorpos diferentes em secções de tecido adjacentes dentro do tumor.
3. Lâminas secas num exsicador durante pelo menos 1 hora após o corte para permitir uma boa aderência do tecido.
4. Criar uma barreira hidrofóbica (com um marcador hidrófobo) em cada extremidade da lâmina para permitir o líquido para cobrir as secções e para permanecer na corrediça durante as lavagens. Cobrir as secções com uma solução de salino tamponado com fosfato com 0,1% de Triton-X (PBS 0,1% Tx) e agitar suavemente durante 5 minutos num agitador horizontal para permeabilizar o tecido. Repita duas vezes.
5. Bloquear a ligação não específica com uma solução de 10% de soro normal de cabra (ou soro de animal em que o anticorpo secundário foi elevada) durante 30 min com agitação suave
6. Preparar a solução de anticorpo primário em 2% de soro normal de cabra em PBS 0,1%Tx e pipeta a solução sobre as seções. Colocar as lâminas em câmara úmida coberta no escuro e manter a temperatura ambiente durante a noite.
7. No dia seguinte, lavam secções três vezes durante 5 min com PBS 0,1% Tx e incuba-se o anticorpo secundário fluorescente diluído em 2% de soro de cabra normal a 0,1% Tx PBS durante uma hora.
8. Lave os cortes três vezes durante 5 min com PBS 0,1% Tx, contracoloração com um corante nuclear (por exemplo, DAPI) durante 2 min, lavar uma vez mais, em água e clara lamela com um meio de montagem à base de água que irá preservar a fluorescência. Colocar as lâminas em uma superfície plana e deixá-los curar durante pelo menos 24 horas, no escuro, até estar pronto para a imagiologia. Mantenha a 4 ° C em seguida.

5. Geração de tumor primário linhas celulares com Genéticos alterações específicas.

1. Para gerar linhas de células de A Bela Adormecida camundongos portadores de tumor selecionar um mouse com tumor grande confirmou (bioluminescência 10 ^{7 8} -10 fótons / s / cm2 / jc).
2. Eutanásia o mouse com uma overdose de anestésico isoflurano, decapitar o animal e cuidadosamente dissecar o cérebro do crânio (conforme descrito no capítulo 4). Coloque o cérebro em um prato limpo Petri.
3. Usando uma lâmina de barbear, fazer cortes coronais anterior e posterior ao tumor. A localização do tumor é geralmente reconhecido devido à transparência do cérebro.
4. Dissecar o tumor, geralmente 5-7 mm de diâmetro, com pinça fina e coloque em um tubo de 1,5 ml cheio com 300 ul Neural Stem Cell Mídia (NSC Mídia: DMEM / F12 com B-27 suplemento, suplemento N2, e Normocin, suplementado com EGF e bFGF recombinante humano numa concentração de 20 ng / ml cada).
5. Suavemente homogeneizar tumor com um pilão de plástico, que se encaixa nas paredes do tubo.
6. Adicionar 1 ml de solução de dissociação de tecido-enzima livre e incubar a 37 ° C durante 5 min.
7. Passe suspensão de células através de um coador de células de 70 mm, lavar o filtro com 10 ml deMedia NSC, centrifugar a 300 xg por 4 min, o sobrenadante decantar e re-suspender pellet em 7 ml de mídia NSC.
8. Placa para um balão de cultura T25 e a cultura a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos e com atmosfera de 95% de ar e 5% de CO _2. Após 3 dias, algumas células morreram, alguns aderiram ao fundo da placa de cultura, e alguns são neuroesferas formando, flutuando livremente nos meios de comunicação.
9. Remover essas células em suspensão e re-placa em um frasco de cultura de tecidos T75.
10. Depois de mais de três dias de cultura, coletar neurospheres, dissociar como descrito no passo 5.6, a tensão através de filtro de células e contagem de células. Congelar aliquotas de células em soro fetal de bovino 10% de DMSO e células de passagem, a uma densidade de um milhão de células em 14 ml de NSC suplementado com EGF e FGF para um frasco T75. A taxa de crescimento dependerá dos oncogenes utilizados para gerar tumores. Adaptar as condições de cultura de células para prevenir o crescimento excessivo de células e manter a densidade relativamente elevada.

Resultados

Para caracterizar as alterações histopatológicas de glioblastomas induzidas-SB, ratinhos neonatais C57 / BL6 foram injectados em P1 com um plasmídeo que codifica a luciferase (pT2 / SB100x-Luc), em combinação com plasmídeos codificando os transposons com ADN oncogénico, ou seja, NRAS (pT / CAGGS -NRASV12) e SV40 LGT (pT / CMVSV40-LGT) (Figura 3c) ou um plasmídeo que codifica uma p53 curto hairpin PDGFβ e com um repórter GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) em combinação com NRAS

Discussão

Neste artigo, que detalhe um método versátil e reprodutível para a geração de novos modelos de GBM utilizando integração mediada SB transposase- de ADN plasmídeo oncogénica em células vizinhas da zona subventricular dos ratinhos neonatais. Nós apresentamos um protocolo para gerar plasmídeos transposon com novos genes de interesse, ilustrar como monitorar a progressão dos tumores em animais vivos, e como caracterizar características histopatológicas e imuno-histoquímica destes tumores.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors	Stoelting	51670	Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Injections can be made without it, ,but    the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience
10 μL 700 series hand fitted MICROLITER syringe	Hamilton	Model 701	This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used
30 gauge gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel)	Hamilton	S/O# 197462	This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced.
in vivo-jetPEI	Polyplus Transfection	201-10G	Aliquot in small volumes and keep at -20oC
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio.com	LuckK-1g	Other sources of firefly lucifierase are just as adequate
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich	HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Electron Microscopy Sciences	62550-01	for embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry
Advanced DMEM/F-12, no glutamine	Life Technologies	12634-010	for the culture of neurospheres
B-27¨ Supplement (50X), serum free	Life Technologies	17504-044	serum free supplement for the culture of neurospheres
N2 Supplement (100x)	Life Technologies	17502-048	serum free supplement for the culture of neurospheres
Normocyn	InvivoGen	ant-nr-1	anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres
Recombinant Human EGF	PEPROTECH	AF-100-15	growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Recombinant Human FGF-basic	PEPROTECH	100-18B	growth factor supplement for the culture of  neurospheres
HyClone HyQTase  Cell Detachment Reagent	Thermo Scientific	SV3003001	for the dissociation of neurospheres
Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749510-0590	for the dissociation of freshly dissected tumors
Falcon Cell Strainers mesh size 70um	Fisher Scientific	08-771-2	for generating single cell suspensions of dissociated neurospheres
Xylenes Histological grade	Fisher Scientific	C8H10
Protocol Harris Hematoxylin Mercury free ( acidified)	Fisher Scientific	245-678
Protocol Eosyn Y Solution ( intensified)	Fisher Scientific	314-631