العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

Summary

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Abstract

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

Introduction

فقدان الخلايا العصبية الدوبامين من المادة السوداء بارس المكتنزة يؤدي إلى أعراض الكاردينال السيارات من مرض باركنسون (PD)، والثاني اضطراب الاعصاب الأكثر انتشارا. السبب الكامن وراء زوال هذه الفئة من السكان الخلايا العصبية الدماغي المتوسط ​​غير معروف. لدراسة المسارات البيوكيميائية المسؤولة عن تطوير وتحوير الخصائص الفسيولوجية العصبية وبقاء الخلايا العصبية mesDA، عدة زراعة الخلايا والنظم نموذج حيواني استخدمت. خطوط الخلايا خلده، بما في ذلك الدوبامين الفئران خط الخلية 1RB ₃ AN ₂₇ (N27)، والدوبامين البشري خط الخلية العصبية SH-SY5Y، الماوس الدوبامين خط الخلية المختلطة MN9D والدماغ المتوسط ​​البشري LUHMES خلايا استخدمت لدراسات الآلية البيوكيميائية ومحدودة ^{1 -5.} لدراسة فقدان محددة من الخلايا العصبية mesDA، والعديد عصبي القائم وتم تطوير نماذج وراثية ^6-8. ثقافات الدماغ المتوسط ​​البطنية الأولية، وتوفير أداة لا غنى عنها لدراسة خصائص الخلايا العصبية ومتشابك من الخلايا العصبية الدوبامين ومسارات المتورطين في التسبب في هذا الاضطراب شائع.

هنا نقدم بروتوكول مفصلة لعزل الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط، والذي يحتوي على تعديلات مما أدى إلى ارتفاع البقاء على قيد الحياة وزيادة العائد من coverslips في الجنين. استخدام ما قبل ناضجة الدماغ المتوسط ​​E12.5 الماوس (E14.5 في الفئران) يعزز البقاء على قيد الحياة. والخلايا العصبية في هذه السن لم تتطور محاور عصبية بعد، الأمر الذي يترك خلايا سليمة أثناء تشريح ويقلل من الإجهاد وبالتالي زيادة كبيرة في قدرتها على البقاء. وبالإضافة إلى ذلك، تشريح دقيق من المخ الأوسط بطني، كما هو موضح في المادة 2 من هذا البروتوكول، وكذلك تعزز البقاء على قيد الحياة. لزيادة أعداد coverslips في الجنين، ويقدم طريقة الطلاء بديل في المادة 4 من هذا البروتوكول. وهذا يؤدي إلى إنتاجية تصل إلى 10 coverslips في الجنين بالمقارنة مع 4 coverslips تحتوبالتالي الظروف الطلاء القياسية تقليل كمية من الحيوانات في التجربة.

الخلايا العصبية في الثقافة المعرض ثمرة من المحاور وdentrites، تشكيل اتصالات متشابك وتكشف عن وجود علامات العصبية ومتشابك مما يجعل هذه الثقافات مناسبة لتصوير الخلايا الحية، immunocytochemical والدراسات الكهربية. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الثقافات العصبية يسهل التلاعب الجيني والصيدلانية. ثمرة neurites التي من يوم 2 في المختبر تتيح للدراسات التنموية. وعلاوة على ذلك، والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل الثقافات (تصل إلى ستة أسابيع) يجعلها مناسبة لدراسة بطيئة، وانحطاط التدريجي لهذه الخلايا العصبية.

Protocol

ملاحظة: تم الحفاظ على الحيوانات والتعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية وجميع الإجراءات الحيوانية وافق عليها رعاية الحيوان في جامعة Imperial College والجسم المراجعة الأخلاقية (AWERB) وزارة الداخلية وجامعة هارفارد المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC)، في الامتثال للوائح الفيدرالية وحكومات الولايات.

1. الكاشف وإعداد المعدات

1. ذوبان الجليد، قسامة وتخزين 1 ملغ / مل Laminin الحل في -80 درجة مئوية. حل 2 ميكرولتر في 1 مل DMEM / F12، مما أدى إلى تركيز طلاء من 1-2 ميكروغرام / سم ^2.
   ملاحظة: ذوبان الجليد Laminin ببطء على الجليد وتذوب في البارد DMEM / F12 وعلى الفور إضافة إلى لوحات / coverslips.
2. تمييع 75 مل من 0.01٪ بولي-L-الأورنيثين في 425 مل PBS وتخزينها في 4 درجة مئوية.
   ملاحظة: العمر الافتراضي للحل العاملة تصل إلى شهر واحد.
3. حل 25٪ (وزن / المجلد) BSA في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4، وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل الى أنتمع.
4. تجهيز 50٪ FBS (في HBSS) وسائل الاعلام التعطيل.
5. إعداد المتوسطة كاملة من خلال إضافة 50 U / البنسلين مل والستربتومايسين، 1X N2 ملحق، 5٪ (المجلد / المجلد) FBS، 0.36٪ D - (+) - الجلوكوز (وزن / المجلد)، 0.25٪ BSA (وزن / المجلد) ل DMEM / F12 وتخزينها في 4 درجة مئوية.
   ملاحظة: العمر الافتراضي هو ما يصل الى 10 يوما.
6. مكان coverslips في 70٪ (المجلد / المجلد) الايثانول المغلي لمدة 30 دقيقة على الأقل لإزالة أي آثار للالشحوم والأوتوكلاف.
7. مكان coverslips في 24 لوحات جيدا وإضافة 500 ميكرولتر حل بولي-L-الأورنيثين إلى كل بئر. احتضان 1 ساعة تحت غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة في RT ومن ثم، وغسل 3 مرات مع 500 ميكرولتر المياه. إضافة 500 ميكرولتر حل laminin إلى كل لوحة واحتضان O / N في ترطيب حاضنة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: في حين لا يغسل ضرورية بعد العلاج laminin، وغسل بولي-L-الأورنيثين أقل من ثلاث مرات النتائج في موت الخلايا بعد 24 ساعة زراعة.
8. تلميع نصائح من الماصات الزجاجية على الغاز الطبيعي أو الشعلة وعرجاء.
   ملاحظة: بعد هذه الخطوة القطر من طرف يجب أن يكون حوالي نصف حجمه الطبيعي.
9. قطع قبعات من 1.5 مل أنابيب microcentrifuge، وذلك باستخدام مقص تعقيمها وتعقيم.

2. تشريح المخ الأوسط بطني الجنينية

1. خدر توقيت الحوامل (E12.5) السدود التي كتبها CO ₂ الاستنشاق ومن ثم الموت ببطء خلع عنق الرحم.
2. رش البطن مع الايثانول 70٪ وإجراء شق في البطن حتى تتعرض الحويصلات الرحم جميع. باستخدام ملقط قطع المرفق المهبل وإزالة الرحم. وضع الرحم في الجليد الباردة HBSS، في 100 مم طبق بتري.
3. إزالة الأجنة من الرحم والكيس الذي يحيط بالجنين، وذلك باستخدام ملقط (الشكل 1C). مكان الأجنة في HBSS الجليد الباردة العذبة.
   ملاحظة: المستطيل في الشكل 1D يشير موقع المخ الأوسط بطني الجنينية.
4. وضع الأجنة تحت المجهر تشريح (التكبير 10x) وتشريح الدماغ المتوسطالقوس عن طريق قطع الدماغ في البرزخ والمنطقة الحدودية الدماغ المتوسط-دماغية بينية، وذلك باستخدام bioscissor وملقط (الشكل 1E، يرجى الرجوع إلى الشكل 1A لخطوط شق).
5. بعد اخراج المخ الأوسط بأكمله، اجراء خفض في المخ الأوسط ظهراني ناصفي (الشكل 1F).
6. إزالة السحايا، وذلك باستخدام اثنين من ملقط (الشكل 1H).
   ملاحظة: خطوة حاسمة: هذه الخطوة ضرورية لالعائد الخلايا العصبية الأمثل والبقاء على قيد الحياة. منذ الشروط ثقافة هي الأمثل لخلايا الدماغ، فإن معظم الخلايا من الأنسجة المحيطة يموت بعد الطلاء وإشارة أفكارك من هذا النسيج قد يضر سلامة الثقافات.
7. لشد الأنسجة المخ الأوسط على طبق بيتري لمراقبة شكل فراشة وقطع ما يقرب من نصف كل جناح، وذلك باستخدام شفرة الحلاقة المعقمة (الشكل 1H، I).
   ملاحظة: الشكل 1J يصور المخ الأوسط بطني معزولة.
8. نقلقطعة من المخ الأوسط بطني في الجليد الباردة HBSS في أنبوب مخروطي 15 مل والمضي قدما في الجنين القادم.
   ملاحظة: خطوات 2،1-2،8 يجب أن لا يستغرق أكثر من 1 ساعة. حفظ الأجنة خارج هذا الإطار الزمني على الجليد يقلل بقاء الخلية بشكل كبير.

3. التفكك لخلايا المخ الأوسط بطني

1. نقل قطع من المخ الأوسط بطني تحت غطاء تدفق الصفحي. إزالة HBSS وإضافة 1 مل قبل حرارة (37 درجة مئوية) 0.05٪ التربسين EDTA-في أنبوب مخروطي (كميات كافية لمدة تصل إلى 12 قطعة من المخ الأوسط بطني). احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة.
2. إزالة التربسين-EDTA تحت غطاء محرك السيارة وإضافة 1 مل المتوسطة دي تفعيل (لن المصل إلغاء تنشيط التربسين) إلى الأنسجة.
3. إزالة المتوسطة التعطيل وغسل الأنسجة في 1 مل المتوسطة كاملة مرتين.
   ملاحظة: تجنب إزالة جميع متوسطة من الأنبوب وpipetting لالأنسجة، لمنع التخلص من خلايا فصلها.
4. إضافة المتوسطة كاملة 1ML ويسحقراتي الأنسجة مع كوب ماصة مصقول النار. تجنب تشكيل فقاعات ومواصلة الطحن حتى يتحقق تعليق خلية واحدة.
   ملاحظة: عادة، 8-10 يمر عبر طرف مقيدة مطلوبة لتفارق كاملة.
5. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT وإزالة المتوسطة.
6. اعادة تعليق بيليه في 1 مل المتوسطة كاملة من قبل pipetting ببطء صعودا وهبوطا لمدة تصل إلى أربع مرات.

4. خلايا المخ الأوسط بطني تصفيح

1. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 90 ميكرولتر التريبان حل الأزرق وحساب عدد الخلايا مع عدادة الكريات.
   ملاحظة: يمكن أيضا فحص قابلية الخلايا في هذه المرحلة.
2. وضع تعقيمها ميكروسنتريفوج قبعات أنبوب في 100 ملم أطباق بتري ونقل بولي-L-الأورنيثين / coverslips Laminin المغلفة، وذلك باستخدام ملقط، في وقت واحد على رأس مباراة دولية.
   ملاحظة: لا يغسل لل coverslips وتجنب تجفيف laminin، لأن هذا قد يسبب uneveن الثقافات وانخفاض في البقاء على قيد الحياة من الخلايا.
3. ضبط مستوى الصوت إلى 1،500 خلية لكل ميكرولتر 1 بإضافة المتوسطة كاملة وإضافة 100 ميكرولتر (ما مجموعه 150،000 خلايا) من تعليق خلية على رأس كل ساترة (وحدة التخزين الأمثل لتغطية سطح ساترة دون انسكاب). إغلاق أطباق بتري واحتضان لهم لمدة 1 ساعة في ترطيب حاضنة زراعة الأنسجة (37 ° C، 5٪ CO _2).
   ملاحظة: خطوة حاسمة: مطلوب هذه الخطوة لتعزيز المرفق وقابلية الخلايا وزيادة عدد coverslips في الجنين. بدلا من ذلك، فإن الخلايا يمكن نقلها مباشرة إلى آبار (coverslips تحتوي على) ولكن ينبغي زيادة عدد الخلايا إلى 350،000 لكل بئر (بدلا من 150،000). وبعبارة أخرى، باستخدام هذه الطريقة، 8-10 coverslips يمكن الحصول عليها، في حين نقل مباشر ينتج حوالي 3-4 coverslips بسبب الخلايا، والتي نعلق على لوحات (بجانب أو تحت لل coverslips). متوسط ​​viabiliكان تاي من الثقافات، وذلك باستخدام هذه الطريقة حوالي 90٪.

5. النمو والصيانة الثقافة

1. بعد 1 ساعة من الحضانة، ونقل بعناية لل coverslips بما في المتوسط ​​إلى 24 لوحات جيدا، والتي تحتوي على 400 ميكرولتر قبل تحسنت (إلى 37 درجة مئوية) المتوسطة كاملة (إجمالي حجم: 500 ميكرولتر). احتضان الخلايا O / N في 37 درجة مئوية.
2. في غضون 24 ساعة بعد الحضانة من الآبار، إضافة بلطف 500 ميكرولتر المتوسطة الكامل في كل بئر.
   ملاحظة: الساعات القليلة الأولى هي المرحلة الأكثر أهمية لبقاء الخلايا العصبية الدوبامين وعدد من الخلايا على قيد الحياة لا يغير بشكل كبير بعد هذه النقطة.
3. لا تقم بإضافة وسائل الإعلام إضافي للثقافات لأول أسبوعين أو حتى المتوسطة يصبح أصفر. إذا زرع لأكثر من أسبوعين أو يتغير لونها إلى اللون الأصفر المتوسطة، وتبادل نصف وسائل الإعلام (500 ميكرولتر) مع وسائل الاعلام قبل تحسنت كاملة جديدة (عادة كل أسبوعين).
   ملاحظة: الخلايا العصبية الدوبامين داخلأن الثقافات البقاء على قيد الحياة لأكثر من 6 أسابيع في ظل هذه الظروف.

النتائج

المناعية ضد التيروسين هيدروكسيلاز (ث) تبين أن بين 0.5-1٪ من الخلايا في الثقافة هي الدوبامين. ويبدو أن التوقعات العصبية في غضون 2 ساعة بعد الطلاء وقبل اليوم الأول، ومحاور عصبية والتشعبات هي تمييزها (الشكل 2)، وذلك باستخدام هيدروكسيلاز التيروزين (TH) والبروتين (2 MAP2...

Discussion

الخلايا العصبية الدوبامين في المخ الأوسط هي المصدر الرئيسي الدوبامين في الجهاز العصبي المركزي. وهي تنقسم إلى ثلاث مجموعات، بارس المادة السوداء المكتنزة (SNpc)، المنطقة البطنية السقيفية (VTA) والميدان retrorubral (قوة الرد السريع) ^{10، 11.} الخلايا العصبية في SNpc وVTA تؤدي إلى ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12	Invitrogen	11330
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid	Invitrogen	24020-117
Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS)	Invitrogen	16140
N2 Supplement (100X), liquid	Invitrogen	17502-048
D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water	Sigma	G8769
Bovine serum albumin BSA	Sigma	A9430
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Sigma	L2020
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15070
Trypsin (0.05% (wt/vol)	Invitrogen	25300
Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested	Sigma	A9418
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P3813
Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody	Pel-Freez Biologicals	P60101-0
Poly-L-ornithine, 0.01% solution	Sigma	P4957
Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody	Millipore	MAB3418
Anti-Synapsin-1 antibody	Millipore	AB1543P
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG   antibody	Molecular Probes	A-21206
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG   antibody	Molecular Probes	A-21207
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG   antibody	Molecular Probes	A-11015
Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG   antibody	Molecular Probes	A-11016
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG   antibody	Molecular Probes	A-21203
Trypan blue solution (0.4% (wt/vol))	Biowhittaker	17-942E
Stereo Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
Inverted phase contrast microscope	Carl Zeiss	Axiovert 40 C
Dumont Forceps	Fine Scientific Tools	May-45
Cover Slip Forceps – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11251-33
Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11245-30
Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm	Fine Scientific Tools	10052-11
Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm	Fine Scientific Tools	91460-11
Fiber optic halogen illuminator	Nikon	MKII
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes	Fisherbrand	13-678-20C
Hemocytometer	Proscitech	SVZ2NIOU
0.2 µm sterile filter units	Nalgene	NL-CE-156-4020
100x20 mm Petri dishes	BD Biosciences	351005
Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm	Bellco Glass	1943-10012