Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

Resumen

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Resumen

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

Introducción

La pérdida de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta conduce a los síntomas motores cardinal de la enfermedad de Parkinson (PD), el segundo trastorno neurodegenerativo más frecuente. La causa subyacente de la desaparición de esta población neuronal mesencephalic no se conoce. Para el estudio de las vías bioquímicas responsables del desarrollo y la modulación de las propiedades neurofisiológicas y la supervivencia de las neuronas Mesda, varios de cultivo de células y sistemas de modelos animales se han utilizado. Las líneas celulares inmortalizadas, incluyendo la línea celular de rata dopaminérgica 1RB ₃ AN ₂₇ (N27), el dopaminérgica línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, la línea celular híbrida de ratón dopaminérgica MN9D y mesencefálico humana LUHMES células se han utilizado para estudios mecanísticos bioquímicos y limitadas ^{1 -5.} Para el estudio de la pérdida específica de neuronas Mesda, varios neurotoxina y basados ​​en modelos genéticos se han desarrollado ^6-8. Culturas mesencéfalo ventral primaria, Proporcionar una herramienta indispensable para el estudio de las propiedades neuronales y sinápticas de las neuronas dopaminérgicas y las vías implicadas en la patogénesis de esta enfermedad común.

Aquí presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas, que contiene modificaciones resultantes en una mayor capacidad de supervivencia y el aumento de rendimiento de cubreobjetos por embrión. El uso del mesencéfalo E12.5 ratón prematuro (E14.5 en rata) mejora la supervivencia. A esta edad las neuronas no se han desarrollado todavía los axones, lo que deja las células intactas durante la disección y minimiza el estrés aumentando así significativamente la viabilidad. Además, la disección cuidadosa del mesencéfalo ventral, como se describe en la sección 2 de este protocolo, mejora aún más la capacidad de supervivencia. Para aumentar el número de cubreobjetos por embrión, una técnica de siembra alternativa se presenta en la sección 4 de este protocolo. Esto conduce a un rendimiento de hasta 10 cubreobjetos por embrión en comparación con 4 cubreobjetos bajocondiciones de chapado estándar reduciendo así la cantidad de animales por experimento.

Las neuronas en la cultura de exposiciones consecuencia de los axones y dendritas, forman conexiones sinápticas y revelan la presencia de marcadores neuronales y sinápticas que hacen estas culturas adecuado para imágenes de células vivas, inmunocitoquímica y estudios electrofisiológicos. Además, el uso de cultivos neuronales facilita la manipulación genética y farmacológica. Excrecencia de neuritas a partir del día 2 in vitro permite estudios de desarrollo. Por otra parte, la supervivencia a largo plazo de las culturas (hasta seis semanas) hace que sean adecuadas para el estudio de la degeneración progresiva y lenta de estas neuronas.

Protocolo

NOTA: Los animales fueron mantenidos y manejados de acuerdo con las directrices institucionales y de todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Bienestar Animal del Colegio Imperial y Órgano de Examen de Ética (AWERB) y el Ministerio del Interior y la Universidad de Harvard Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC), de conformidad con los reglamentos federales y estatales.

1. Reactivo y Configuración del equipo

1. Thaw, alícuota y almacenar 1 mg / ml solución laminina a -80 ºC. Disolver 2 l en 1 ml de DMEM / F12, resultando en una concentración de recubrimiento de 1-2 g / cm ^2.
   NOTA: Descongelar Laminin lentamente en hielo y se disuelve en frío DMEM / F12 y de inmediato añadir a los platos / cubreobjetos.
2. Diluir 75 ml de 0,01% de poli-L-ornitina en 425 ml de PBS y se almacena a 4 ºC.
   NOTA: La vida útil de la solución de trabajo es de hasta un mes.
3. Disolver 25% (p / v) de BSA en PBS, pH 7,4, y se almacena a 4 ° C durante un máximo de un year.
4. Preparar 50% de FBS (en HBSS) medios de desactivación.
5. Preparar medio completo mediante la adición de 50 U / ml de penicilina y estreptomicina, 1x suplemento N2, 5% (vol / vol) de FBS, 0,36% D - (+) - glucosa (peso / vol), 0,25% de BSA (peso / vol) a DMEM / F12 y almacenar a 4 ºC.
   NOTA: La vida útil es de hasta 10 días.
6. Coloque los cubreobjetos en ebullición 70% (vol / vol) de etanol durante al menos 30 min para eliminar los restos de grasa y autoclave.
7. Coloque los cubreobjetos en placas de 24 pocillos y añadir 500 l solución de poli-L-ornitina a cada pocillo. Incubar 1 hr bajo la campana de cultivo de tejido a TA y después, lavar 3 veces con 500 l de agua. Añadir solución de laminina 500 l a cada placa y se incuba O / N en la incubadora de cultivo de tejidos humidificado a 37 ºC.
   NOTA: Si bien no hay lavados son necesarias después del tratamiento laminina, lavar los poli-L-ornitina menos de tres veces resulta en la muerte de las células 24 h después del cultivo.
8. Pulir las puntas de pipetas de vidrio más de gas natural o antorcha fcojo.
   NOTA: Después de este paso, el diámetro de la punta debe ser aproximadamente la mitad de su tamaño normal.
9. Cortar las tapas de 1,5 ml tubos de microcentrífuga, utilizando una tijera autoclave y autoclave.

2. Disección de Embryonic ventral mesencéfalo

1. Narcotizar oportuna embarazadas (E12.5) presas por inhalación de _CO2 y luego practicar la eutanasia por dislocación cervical.
2. Pulverizar el abdomen con etanol al 70% y hacer una incisión abdominal hasta los sacos uterinos están expuestos. Utilizando unas pinzas cortan la fijación vaginal y eliminar útero. Coloque el útero en HBSS enfriado en hielo, en un 100 mm placa de Petri.
3. Retire embriones del útero y el saco amniótico, utilizando pinzas (Figura 1C). Coloque los embriones en fresco HBSS helada.
   NOTA: El rectángulo en la Figura 1D indica la ubicación del mesencéfalo ventral embrionario.
4. Coloca los embriones bajo un microscopio de disección (10 aumentos) y diseccionar el mesencéfaloarco cortando el cerebro en el istmo y la región frontera mesencefálico-diencefálica, utilizando el bioscissor y pinzas (Figura 1E, por favor refiérase a la Figura 1A para las líneas de incisión).
5. Después de sacar todo el cerebro medio, hacer un corte en el mesencéfalo mediodorsal (Figura 1F).
6. Eliminar meninges, utilizando dos pinzas (Figura 1H).
   NOTA: PASO CRÍTICO: Este paso es esencial para el rendimiento óptimo neuronal y la supervivencia. Dado que las condiciones de cultivo son óptimos para las células del cerebro, la mayoría de las células del tejido circundante mueren después de la siembra y la señal apoptótica partir de este tejido puede dañar la integridad de las culturas.
7. Acoplar el tejido del cerebro medio en la placa de Petri para observar la forma de mariposa y corte aproximadamente la mitad de cada ala, utilizando una cuchilla de afeitar esterilizada (Figura 1 H, I).
   NOTA: Figura 1J representa el mesencéfalo ventral aislado.
8. Transferir elpieza de mesencéfalo ventral en HBSS enfriado con hielo en un tubo cónico de 15 ml y proceder con el siguiente embrión.
   NOTA: Los pasos 2.1 a 2.8 no deben tomar más de 1 hora. Mantener los embriones más allá de este marco de tiempo en hielo disminuye significativamente la viabilidad celular.

3. La disociación de las células ventral mesencéfalo

1. La transferencia de los trozos de cerebro medio ventral bajo una campana de flujo laminar. Retire la HBSS y añadir 1 ml precalentado (37 ºC) 0,05% de tripsina-EDTA en el tubo cónico (volúmenes suficientes para un máximo de 12 piezas de mesencéfalo ventral). Incubar el tejido a 37 ºC durante 5-10 minutos.
2. Eliminar tripsina-EDTA bajo el capó y se añade medio de la activación de-1 ml (el suero se desactivará tripsina) para el tejido.
3. Retire el medio de desactivación y lavar el tejido en 1 ml de medio completo dos veces.
   NOTA: evitar la eliminación de todo el medio del tubo y pipetear el tejido, para evitar desechar las células disociadas.
4. Añadir 1 ml de medio completo y triturato el tejido con una pipeta de vidrio pulida al fuego. Evitar la formación de burbujas y seguir triturando hasta que se logre la suspensión de células individuales.
   NOTA: Por lo general, 8-10 pasa por la punta restringido son necesarios para la disociación completa.
5. Centrifugar las células a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el medio.
6. Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de medio completo por lentamente la pipeta hacia arriba y hacia abajo para un máximo de cuatro veces.

4. Las células Chapado ventral mesencéfalo

1. Mezclar 10 l de la suspensión celular con 90 l solución de azul de tripano y contar el número de células con un hemocitómetro.
   NOTA: La viabilidad de las células también se puede comprobar en esta etapa.
2. Coloque tapas de los tubos de microcentrífuga esterilizado en 100 mm placas de Petri y transferir los / laminina cubreobjetos recubiertos de poli-L-ornitina, utilizando fórceps, uno a la vez en la parte superior de las tapas.
   NOTA: No lave los cubreobjetos y evitar el secado de la laminina, ya que esto puede causar UNEVEculturas n y disminución de la supervivencia de las células.
3. Ajustar el volumen a 1500 células por 1 l mediante la adición de medio completo y añadir 100 l (un total de 150.000 células) de la suspensión celular en la parte superior de cada cubreobjetos (el volumen es óptimo para cubrir la superficie del cubreobjetos sin derrames). Cierre las placas de Petri y se incuba durante 1 hr ellos en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado (37 ° C, 5% de CO _2).
   NOTA: PASO CRITICAL: Este paso es necesario para mejorar la unión y viabilidad de las células y para aumentar el número de cubreobjetos por embrión. Alternativamente, las células se pueden transferir directamente a los pozos (que contienen cubreobjetos), pero el número de células se debe aumentar a 350 mil por pozo (en lugar de 150.000). En otras palabras, utilizando este método, 8-10 cubreobjetos se pueden adquirir, mientras que la transferencia directa produce unos 3-4 cubreobjetos a causa de las células, que se unen a las placas (al lado o debajo de los cubreobjetos). El viabili promedioTy de los cultivos, utilizando este método fue de alrededor de 90%.

5. Crecimiento y Mantenimiento Cultura

1. Después de 1 hora de incubación, transferir cuidadosamente el cubreobjetos incluyendo el medio en placas de 24 pocillos, que contiene 400 l de medio completo precalentado (a 37 ºC) (volumen total: 500 l). Se incuban las células O / N a 37 ºC.
2. Dentro de 24 horas después de la incubación de los pocillos, añadir suavemente medio completo 500 l en cada pocillo.
   NOTA: Las primeras horas es la etapa más crítica para la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas y el número de células supervivientes no cambia significativamente más allá de este punto.
3. No agregue soportes adicionales a las culturas de las dos primeras semanas o hasta que el medio se convierte en amarilla. Si el cultivo durante más de dos semanas o cambios de color medio a amarillo, cambio de la mitad de los medios de comunicación (500 l) con frescos completas medios pre-calentado (normalmente cada dos semanas).
   NOTA: Las neuronas dopaminérgicas dentro de laculturas sobrevivirían durante más de 6 semanas bajo estas condiciones.

Resultados

La inmunohistoquímica contra la tirosina hidroxilasa (TH) muestra que entre 0,5-1% de las células en cultivo son dopaminérgica. Proyecciones neuronales aparecen dentro de 2 horas después de la siembra y antes del primer día, los axones y dendritas son distinguibles (Figura 2), utilizando proteína 2 (Map2) anticuerpos asociada a los microtúbulos (Figura 3) tirosina hidroxilasa (TH) y. Las neuronas a sobrevivir durante más de seis semanas y muestran una amplia extensión. La relac...

Discusión

Las neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo son la principal fuente de dopamina en el sistema nervioso central. Se dividen en tres grupos, sustancia negra pars compacta (SNpc), el área ventral tegmental (VTA) y el campo retrorubral (FRR) ^{10, 11.} Las neuronas SNpc VTA y dan lugar a importantes vías dopaminérgicas, mesocorticales, mesolímbico y nigro-estriado, que participan en funciones como el control de las emociones, la motivación y el comportamiento motor. Desaparición de las neuronas en SNpc y a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12	Invitrogen	11330
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid	Invitrogen	24020-117
Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS)	Invitrogen	16140
N2 Supplement (100X), liquid	Invitrogen	17502-048
D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water	Sigma	G8769
Bovine serum albumin BSA	Sigma	A9430
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Sigma	L2020
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15070
Trypsin (0.05% (wt/vol)	Invitrogen	25300
Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested	Sigma	A9418
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P3813
Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody	Pel-Freez Biologicals	P60101-0
Poly-L-ornithine, 0.01% solution	Sigma	P4957
Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody	Millipore	MAB3418
Anti-Synapsin-1 antibody	Millipore	AB1543P
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG   antibody	Molecular Probes	A-21206
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG   antibody	Molecular Probes	A-21207
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG   antibody	Molecular Probes	A-11015
Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG   antibody	Molecular Probes	A-11016
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG   antibody	Molecular Probes	A-21203
Trypan blue solution (0.4% (wt/vol))	Biowhittaker	17-942E
Stereo Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
Inverted phase contrast microscope	Carl Zeiss	Axiovert 40 C
Dumont Forceps	Fine Scientific Tools	May-45
Cover Slip Forceps – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11251-33
Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11245-30
Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm	Fine Scientific Tools	10052-11
Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm	Fine Scientific Tools	91460-11
Fiber optic halogen illuminator	Nikon	MKII
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes	Fisherbrand	13-678-20C
Hemocytometer	Proscitech	SVZ2NIOU
0.2 µm sterile filter units	Nalgene	NL-CE-156-4020
100x20 mm Petri dishes	BD Biosciences	351005
Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm	Bellco Glass	1943-10012