Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

Résumé

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Résumé

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

Introduction

La perte de neurones dopaminergiques de la substantia nigra pars compacta conduit à des symptômes moteurs cardinal de la maladie de Parkinson (MP), le deuxième trouble neurodégénératif le plus répandu. La cause sous-jacente de la disparition de cette population neuronale mésencéphalique ne est pas connu. Pour étudier les voies biochimiques responsables du développement et de moduler les propriétés neurophysiologiques et la survie des neurones MESDA, plusieurs culture cellulaire et des systèmes de modèles animaux ont été utilisés. Les lignées cellulaires immortalisées, y compris la dopaminergique chez le rat lignée cellulaire 1RB ₃ AN ₂₇ (N27), le dopaminergique humain lignée cellulaire de neuroblastome SH-SY5Y, la lignée cellulaire hybride dopaminergique de la souris MN9D et mésencéphalique humaine LUHMES cellules ont été utilisées pour des études mécanistiques biochimiques et limitées ^{1 -5.} Pour l'étude de la perte spécifique de neurones MESDA, plusieurs neurotoxine-fondées et les modèles génétiques ont été développés ^6-8. Cultures mésencéphale ventrales primaires, Fournir un outil indispensable pour étudier les propriétés neuronales et synaptiques des neurones dopaminergiques et les voies impliquées dans la pathogenèse de cette maladie fréquente.

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l'isolement des neurones dopaminergiques mésencéphaliques, qui contient des modifications résultant en la capacité de survie plus élevé et un rendement accru de lamelles par embryon. L'utilisation de la souris E12.5 mésencéphale pré-mature (E14.5 chez le rat) améliore la survie. À cet âge neurones ne ont pas encore développé axones, ce qui laisse des cellules intactes lors de la dissection et minimise la contrainte augmentant ainsi considérablement la viabilité. En outre, dissection minutieuse du mésencéphale ventral, tel que décrit dans l'article 2 de ce protocole, améliore encore la capacité de survie. Pour augmenter le nombre de lamelles par embryon, une méthode de placage de remplacement est présenté dans la section 4 de ce protocole. Cela conduit à un rendement allant jusqu'à 10 lamelles par embryon par rapport aux lamelles de moins de 4conditions de placage classiques réduisant ainsi la quantité d'animaux par expérience.

Neurones en culture exposition excroissance des axones et des dendrites, forment des connexions synaptiques et révèlent la présence de marqueurs neuronaux et synaptiques faisant ces cultures appropriée pour l'imagerie de cellules vivantes, immunocytochimique et des études électrophysiologiques. En outre, l'utilisation de cultures de neurones facilite la manipulation génétique et pharmacologique. Excroissance de neurites de deux jours in vitro permet d'études sur le développement. En outre, la survie à long terme des cultures (jusqu'à six semaines) les rend appropriés pour l'étude de la lente, de la dégénérescence progressive de ces neurones.

Protocole

REMARQUE: Les animaux ont été maintenus et manipulés en conformité avec les directives institutionnelles et toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par la protection des animaux de l'Imperial College et le Home Office et de l'Université Harvard institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC) examen éthique du corps (de AWERB) et, en conformité avec les règlements fédéraux et étatiques.

1. réactif et le matériel Setup

1. Thaw, aliquote et stocker 1 mg / ml solution à -80 ºC laminine. Dissoudre 2 pi dans 1 ml de DMEM / F12, résultant en une concentration de revêtement de 1-2 mg / cm ^2.
   REMARQUE: Thaw laminine lentement sur la glace et se dissoudre dans le froid DMEM / F12 et immédiatement ajouter aux plaques / lamelles.
2. Diluer 75 ml de 0,01% Poly-L-ornithine dans 425 ml de PBS et conserver à 4 ºC.
   REMARQUE: La durée de conservation de la solution de travail est à un mois.
3. Dissoudre 25% (poids / volume) de BSA dans du PBS, pH 7,4, et conserver à 4 ° C jusqu'à un year.
4. Préparer 50% de FBS (dans HBSS) Moyens de désactivation.
5. Préparer un milieu complet par addition de 50 U / ml de pénicilline et de la streptomycine, 1x supplément N2, 5% (vol / vol) de FBS, 0,36% de D - (+) - glucose (poids / volume), 0,25% de SAB (poids / volume) de DMEM / F12 et conserver à 4 ºC.
   REMARQUE: La durée de conservation est de 10 jours.
6. La place des lamelles à 70% (vol / vol) d'éthanol bouillant pendant au moins 30 minutes pour éliminer toute trace de graisse et autoclave.
7. La place des lamelles dans des plaques à 24 puits et ajouter 500 ul de solution de poly-L-ornithine à chaque puits. Incuber 1 h sous le capot de culture de tissus à la température ambiante puis, laver 3 fois avec 500 pi d'eau. Ajouter la solution de laminine 500 ul à chaque plaque et incuber O / N dans le humidifié incubateur de culture tissulaire à 37 ° C.
   REMARQUE: si aucune lavages sont nécessaires après le traitement de la laminine, en lavant les poly-L-ornithine moins de trois fois entraîne la mort des cellules 24 h après la mise en culture.
8. Essuyez les conseils de pipettes en verre plus de gaz naturel ou torche fboiteux.
   NOTE: Après cette étape, le diamètre de la pointe devrait être d'environ la moitié de sa taille normale.
9. Couper les bouchons de 1,5 ml microtubes, en utilisant un autoclave ciseaux et autoclave.

2. Dissection du mésencéphale embryonnaire ventral

1. Narcotiser chronométré enceintes (E12.5) barrages par inhalation de CO ₂ puis euthanasier par dislocation cervicale.
2. Pulvériser l'abdomen avec 70% d'éthanol et de faire une incision abdominale jusqu'à ce que les sacs de l'utérus sont tous exposés. Aide d'une pince coupe l'attachement vaginale et supprimer utérus. Placez l'utérus glacée HBSS, dans une boîte de Pétri de 100 mm.
3. Retirer embryons de l'utérus et le sac amniotique, en utilisant une pince (figure 1C). La place embryons dans HBSS glacée fraîche.
   NOTE: Le rectangle dans la figure 1D indique l'emplacement du mésencéphale ventral embryonnaire.
4. Placez les embryons sous un microscope de dissection (10x de grossissement) et disséquer le mésencéphalearc en coupant le cerveau à l'isthme et la région frontière mésencéphalique-diencéphalique, en utilisant la bioscissor et pince (figure 1E, se il vous plaît se référer à la figure 1A pour les lignes de l'incision).
5. Après avoir sorti l'ensemble du mésencéphale, faire une coupe dans le mésencéphale médiodorsal (figure 1F).
6. Retirer méninges, en utilisant deux pinces (figure 1H).
   REMARQUE: ÉTAPE CRITIQUE: Cette étape est essentielle pour un rendement optimal et la survie neuronale. Étant donné que les conditions de culture sont optimales pour les cellules du cerveau, la plupart des cellules du tissu environnant meurent après l'étalement et le signal apoptotique à partir de ce tissu peut endommager l'intégrité des cultures.
7. Aplatir le tissu mésencéphale sur la boîte de Pétri pour observer la forme de papillon et couper environ la moitié de chaque aile, à l'aide d'une lame de rasoir stérilisé (Figure 1 H, I).
   REMARQUE: la figure 1J représente le mésencéphale ventral isolé.
8. Transférer lemorceau de mésencéphale ventral dans glacée HBSS dans un tube conique de 15 ml et procéder à la prochaine embryon.
   REMARQUE: les étapes 2.1 à 2.8 ne devrait pas prendre plus d'une heure. Garder les embryons au-delà de ce laps de temps sur la glace diminue de manière significative la viabilité des cellules.

3. La dissociation des cellules ventrale Mésencéphale

1. Transférer les morceaux de mésencéphale ventral sous une hotte à flux laminaire. Retirez le HBSS et ajouter 1 ml préchauffé (37 ºC) 0,05% de trypsine-EDTA dans le tube conique (volumes assez pour jusqu'à 12 morceaux de mésencéphale ventral). Incuber le tissu à 37 ° C pendant 5 à 10 min.
2. Retirer la trypsine-EDTA sous le capot et ajouter du milieu de désactivation de 1 ml (le sérum désactivera la trypsine) pour le tissu.
3. Éliminer le milieu de désactivation et laver le tissu dans 1 ml de milieu complet deux fois.
   REMARQUE: Evitez de retirer tout le milieu du tube et pipetage le tissu, pour éviter de jeter les cellules dissociées.
4. Ajouter 1 ml de milieu complet et triturate le tissu avec une pipette en verre poli-le-feu. Eviter la formation de bulles et de continuer jusqu'à ce trituration suspension cellulaire unique est atteint.
   Note: Habituellement, 8-10 traverse la pointe restreint sont obligatoires pour la dissociation complète.
5. Centrifuger les cellules à 400 g pendant 5 min à température ambiante et retirez le support.
6. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu complet en pipettant doucement de haut en bas jusqu'à quatre fois.

4. Les cellules Placage ventrale Mésencéphale

1. Mélanger 10 ul de la suspension cellulaire avec une solution de bleu Trypan 90 pi et de compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre.
   NOTE: La viabilité des cellules peut également être vérifiée à ce stade.
2. Placez stérilisés bouchon d'un tube à centrifuger de 100 mm boîtes de Pétri et de transférer les poly-L-ornithine / laminine lamelles, en utilisant une pince, un à la fois au-dessus des bouchons.
   REMARQUE: Ne pas laver les lamelles et éviter le séchage de la laminine, car cela pourrait provoquer uneven cultures et diminution de la capacité de survie des cellules.
3. Ajuster le volume à 1 500 cellules par ul de 1 par addition de milieu complet et ajouter 100 ul (total de 150 000 cellules) de la suspension de cellules au-dessus de chaque lamelle (le volume est optimale pour couvrir la surface de la lamelle couvre-objet sans déversement). Fermez les boîtes de Pétri et incuber pendant 1 h dans un incubateur de culture de tissu humidifié (37 ° C, 5% de CO _2).
   REMARQUE: étape critique: Cette étape est nécessaire pour améliorer la fixation et la viabilité des cellules et pour augmenter le nombre de lamelles par embryon. Alternativement, les cellules peuvent être transférés directement dans les puits (contenant lamelles couvre), mais le nombre de cellules devrait être porté à 350 000 par puits (au lieu de 150 000). En d'autres termes, en utilisant cette méthode, 8-10 lamelles peuvent être acquis, tandis que le transfert direct donne environ 3-4 lamelles en raison des cellules, qui se fixent sur les plaques (à côté ou au-dessous des lamelles). La moyenne viabilité des cultures, en utilisant cette méthode était d'environ 90%.

5. Culture croissance et l'entretien

1. Après 1 h d'incubation, transférer soigneusement les lamelles y compris le milieu dans des plaques à 24 puits contenant 400 ul préchauffé (à 37 ° C) du milieu complet (volume total: 500 ul). Incuber les cellules O / N à 37 ºC.
2. De 24 h après l'incubation des puits, ajouter doucement 500 pi de milieu complet dans chaque puits.
   REMARQUE: Les premières heures est l'étape la plus critique pour la survie des neurones dopaminergiques et le nombre de cellules survivantes ne change pas de façon significative au-delà de ce point.
3. Ne ajoutez pas supplémentaire pour les cultures pour les deux premières semaines ou jusqu'à ce que le milieu devient jaune. Si la culture depuis plus de deux semaines ou des changements de couleur moyennes au jaune, l'échange de la moitié des médias (500 pi) avec frais milieux complets préchauffées (généralement toutes les deux semaines).
   NOTE: les neurones dopaminergiques au sein de lacultures seraient survivre pendant plus de six semaines dans ces conditions.

Résultats

Immunohistochimie contre la tyrosine hydroxylase (Th) montre que, entre 0,5 à 1% des cellules en culture sont dopaminergique. Projections neuronales apparaissent dans deux heures après placage et par le premier jour, les axones et les dendrites se distinguent (Figure 2), en utilisant la tyrosine hydroxylase (TH) et la protéine 2 (carte2) anticorps associée aux microtubules (Figure 3). Les neurones de survivre pendant plus de six semaines, et montrent une vaste excroissance. Le ratio...

Discussion

Les neurones dopaminergiques dans le mésencéphale sont la principale source de la dopamine dans le système nerveux central. Ils sont divisés en trois groupes, substantia nigra pars compacta (SNPC), Surface tegmentale ventrale (VTA) et sur ​​le terrain retrorubral (RRF) ^{10, 11.} Les neurones dans SNPC et VTA donnent lieu à des grandes voies dopaminergiques, mésocorticales, mésolimbiques et nigro-striée, impliquées dans les fonctions telles que le contrôle de l'émotion, la motivation et le com...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12	Invitrogen	11330
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid	Invitrogen	24020-117
Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS)	Invitrogen	16140
N2 Supplement (100X), liquid	Invitrogen	17502-048
D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water	Sigma	G8769
Bovine serum albumin BSA	Sigma	A9430
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Sigma	L2020
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15070
Trypsin (0.05% (wt/vol)	Invitrogen	25300
Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested	Sigma	A9418
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P3813
Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody	Pel-Freez Biologicals	P60101-0
Poly-L-ornithine, 0.01% solution	Sigma	P4957
Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody	Millipore	MAB3418
Anti-Synapsin-1 antibody	Millipore	AB1543P
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG   antibody	Molecular Probes	A-21206
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG   antibody	Molecular Probes	A-21207
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG   antibody	Molecular Probes	A-11015
Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG   antibody	Molecular Probes	A-11016
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG   antibody	Molecular Probes	A-21203
Trypan blue solution (0.4% (wt/vol))	Biowhittaker	17-942E
Stereo Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
Inverted phase contrast microscope	Carl Zeiss	Axiovert 40 C
Dumont Forceps	Fine Scientific Tools	May-45
Cover Slip Forceps – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11251-33
Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11245-30
Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm	Fine Scientific Tools	10052-11
Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm	Fine Scientific Tools	91460-11
Fiber optic halogen illuminator	Nikon	MKII
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes	Fisherbrand	13-678-20C
Hemocytometer	Proscitech	SVZ2NIOU
0.2 µm sterile filter units	Nalgene	NL-CE-156-4020
100x20 mm Petri dishes	BD Biosciences	351005
Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm	Bellco Glass	1943-10012