Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Zusammenfassung

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Zusammenfassung

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

Einleitung

Verlust von dopaminergen Neuronen aus der Substantia nigra pars compacta führt zu den Kardinal motorischen Symptome der Parkinson-Krankheit (PD), die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung. Die zugrunde liegende Ursache für den Niedergang des Mittelhirn neuronalen Population ist nicht bekannt. Um die biochemischen Wege für die Entwicklung und Modulation neurophysiologischen Eigenschaften und das Überleben von Neuronen mesDA mehrere Zellkultur- und Tiermodellsystemen verantwortlich verwendet wurden studieren. Immortalisierte Zelllinien, einschließlich der Ratte dopaminergen Zelllinie 1RB ₃ AN ₂₇ (N27), der menschlichen dopaminergen Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y, der Maus dopaminergen Hybridzellinie MN9D und Menschen mesencephalen LUHMES Zellen für biochemische und begrenzte mechanistische Studien ¹ verwendet wurde ^-5. Für die Untersuchung des spezifischen Verlust mesDA Neuronen mehrere Neurobasis und genetische Modelle wurden entwickelt ^6-8. Primäre ventralen Mittelhirn KulturenStellen ein unverzichtbares Werkzeug für die Untersuchung der neuronalen und synaptischen Eigenschaften der dopaminergen Neuronen und die Wege in der Pathogenese dieser häufige Erkrankung beteiligt.

Hier präsentieren wir Ihnen ein ausführliches Protokoll für die Isolierung von Mittelhirn dopaminergen Neuronen, die Änderungen zu höheren Überlebensfähigkeit und erhöhte Ausbeute an Deckgläsern pro Embryo enthält. Die Nutzung vorzeitige E12.5 Maushirn (E14.5 in rat) erhöht die Überlebensfähigkeit. In diesem Alter Neuronen nicht Axone entwickelt noch, die Zellen intakt beim Präparieren verlässt und den Stress dadurch deutlich erhöht Überlebensfähigkeit minimiert. Darüber hinaus sorgfältige Präparation der ventralen Mittelhirn, wie in Abschnitt 2 dieses Protokoll beschrieben, weiter verbessert Überlebensfähigkeit. Um die Anzahl der Deckgläser pro Embryo zu erhöhen, wird eine alternative Beschichtungsverfahren in Abschnitt 4 dieses Protokolls vorgestellt. Dies führt zu einer Ausbeute von bis zu 10 Deck pro Embryo im Vergleich zu 4 Deckgläser unterStandard Plattierungsbedingungen wodurch die Menge der Tiere pro Versuch.

Neuronen in Kultur zeigen Auswuchs von Axonen und Dendriten bilden synaptische Verbindungen und zeigen das Vorhandensein von neuronalen und synaptischen Marker machen diese Kulturen für Live Cell Imaging, immunzytochemischen und elektrophysiologische Untersuchungen geeignet. Weiterhin ist die Verwendung von neuronalen Kulturen erleichtert und pharmakologische Manipulation. Auswuchs von Neuriten von Tag 2 in vitro ermöglicht die Entwicklungsstudien. Ferner ermöglicht die langfristige Überlebensrate von Kulturen (bis zu sechs Wochen) für ein Studium des langsame, progressive Degeneration dieser Neuronen geeignet.

Protokoll

HINWEIS: Die Tiere wurden durch die Imperial Colleges und Tierschutz beibehalten und in Übereinstimmung behandelt mit den institutionellen Richtlinien und alle Tier Verfahren genehmigt und ethische Überprüfung zuständige Gremium (AWERB) und das Innenministerium und der Harvard University Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) in Übereinstimmung mit Bundes- und Landesvorschriften.

1. Reagenzien und Geräte-Setup

1. Thaw, aliquoten und speichern 1 mg / ml Laminin-Lösung bei -80 ° C. Löse 2 ul in 1 ml DMEM / F12, was in einer Beschichtungskonzentration von 1-2 & mgr; g / cm ^2.
   HINWEIS: Thaw Laminin langsam auf Eis und lösen sich in kaltem DMEM / F12 und unmittelbar darauf an den Platten / Deck hinzuzufügen.
2. Verdünnen Sie 75 ml 0,01% Poly-L-Ornithin in 425 ml PBS und bei 4 ° C.
   HINWEIS: Die Haltbarkeit der Arbeitslösung bis zu einem Monat.
3. Lösen Sie 25% (w / v) BSA in PBS, pH 7,4, und bei 4 ° C für bis zu eine year.
4. Bereiten Sie 50% FBS (in HBSS) Deaktivierung Medien.
5. Bereiten Komplettmedium durch Zugabe von 50 U / ml Penicillin und Streptomycin, 1x N2 Ergänzung, 5% (Vol / Vol) FBS, 0,36% D - (+) - Glucose (w / v), 0,25% BSA (w / v), um DMEM / F12 und bei 4 ° C.
   HINWEIS: Die Haltbarkeitsdauer beträgt bis zu 10 Tage.
6. Ort Deck in kochendem 70% (vol / vol) Ethanol für mindestens 30 min, um jegliche Spuren von Fett und Autoklaven entfernen.
7. Ort Deck in Platten mit 24 Vertiefungen und fügen 500 ul Poly-L-Ornithin-Lösung in jede Kammer. Inkubieren Sie 1 Stunde unter der Gewebekultur Haube bei RT und dann waschen 3 Mal mit 500 ul Wasser. Gib 500 ul Laminin-Lösung zu jeder Platte und Inkubation O / N in der befeuchteten Gewebekulturinkubator bei 37 ºC.
   HINWEIS: Wenn keine Waschschritte nach Laminin Behandlung notwendig, Waschen der Poly-L-Ornithin weniger als dreimal führt zum Tod der Zellen nach 24 h Kultivierung.
8. Polieren Sie die Spitzen der Glaspipetten über Erdgas oder Taschenlampe flahm.
   HINWEIS: Nach diesem Schritt wird der Durchmesser der Spitze sollte etwa die Hälfte seiner normalen Größe sein.
9. Schneiden Sie die Kappen von 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, mit einem autoklavierten Scheren und Autoklaven.

2. Präparation der embryonalen ventralen Mittelhirn

1. Narkotisieren timed-schwangeren (E12.5) Dämme durch CO ₂ Inhalation und durch Genickbruch einschläfern.
2. Sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol und eine Bauchschnitt, bis die Gebärmutter Säcke alle ausgesetzt sind. Mit einer Pinzette schneiden die vaginale Befestigung und entfernen Gebärmutter. Legen Sie die Gebärmutter in eiskaltem HBSS, in einer 100 mm Petrischale.
3. Embryonen aus der Gebärmutter und Fruchtblase zu entfernen, mit einer Pinzette (Abbildung 1C). Platz Embryonen in frischem eiskaltem HBSS.
   HINWEIS: Das Rechteck in Figur 1D zeigt die Stelle von embryonalen ventralen Mittelhirn.
4. Legen Sie die Embryonen unter Dissektionsmikroskop (10-fache Vergrößerung) und sezieren die MittelhirnBogen, indem das Gehirn an der Landenge und Mittelhirn-Zwischenhirn Randbereich, mit dem bioscissor und Pinzette (1E, siehe 1A für Linien der Einschnitt Abbildung).
5. Nach dem Herausnehmen der gesamten Mittelhirn, einen Schnitt in der mediodorsal Mittelhirn (1F).
6. Hirnhaut entfernen, mit zwei Zangen (Abbildung 1H).
   HINWEIS: entscheidender Schritt: Dieser Schritt ist wichtig für eine optimale Ausbeute und neuronale Überleben. Da die Kulturbedingungen optimal für Gehirnzellen sind, die meisten der Zellen aus dem umgebenden Gewebe zu sterben nach der Plattierung und die apoptotische Signal dieses Gewebe kann die Integrität der Kulturen schädigen.
7. Glätten Sie das Mittelhirn Gewebe auf der Petrischale, die Schmetterlingsform beobachten und schneiden etwa die Hälfte eines jeden Flügels, mit einem sterilisierten Rasierklinge (Abbildung 1 H, I).
   HINWEIS: Figur 1J zeigt die isolierte ventralen Mittelhirn.
8. Übertragen Sie dieStück ventralen Mittelhirn in eiskaltes HBSS in einem 15 ml konischen Rohr und fahren Sie mit dem nächsten Embryo.
   Hinweis: Die Schritte 2,1-2,8 sollte nicht mehr als 1 Stunde. Halten Sie die Embryonen außerhalb dieses Zeitrahmens auf Eis sinkt die Lebensfähigkeit der Zellen deutlich.

3. Die Dissoziation von ventralen Mittelhirn-Zellen

1. Übertragen Sie die Stücke von ventralen Mittelhirn unter einer Sterilbank. Entfernen Sie die HBSS und 1 ml vorgewärmten (37 ° C) 0,05% Trypsin-EDTA in das konische Röhrchen (Menge reicht für bis zu 12 Stück der ventralen Mittelhirn). Inkubieren des Gewebes bei 37 ° C für 5-10 min.
2. Entfernen Trypsin-EDTA unter der Haube und 1 ml Deaktivierung Medium (das Serum wird Trypsin deaktivieren) auf das Gewebe.
3. Entfernen Sie die Deaktivierung Medium und waschen Sie das Gewebe in 1 ml vollständigem Medium zweimal.
   HINWEIS: Vermeiden Entfernen aller das Medium von der Röhre und Pipettieren der Gewebe, Verwerfen der dissoziierten Zellen zu verhindern.
4. In 1 ml Vollmedium und tritUrat das Gewebe mit einer feuerpolierten Glaspipette. Bildung von Blasen zu vermeiden, und weiterhin Verreiben bis einzelne Zellsuspension erreicht wird.
   Hinweis: geht normalerweise 8-10 durch den verengten Spitze für vollständige Dissoziation erforderlich.
5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie das Medium.
6. Re-suspendieren des Pellets in 1 ml Komplettmedium durch langsames Auf- und Abpipettieren mit bis zu viermal.

4. Überzug ventralen Mittelhirn-Zellen

1. Nimm 10 & mgr; l der Zellsuspension mit 90 ul Trypan-Blau-Lösung und die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
   HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der Zellen kann auf dieser Stufe auch überprüft werden.
2. Zeigen sterilisierten Mikrozentrifugenröhrchen Caps in 100 mm Petrischalen und übertragen Sie die Poly-L-Ornithin / Laminin beschichtete Deckgläser, mit einer Pinzette, einer nach dem anderen auf der Oberseite der Caps.
   HINWEIS: Waschen Sie die Deckgläser und vermeiden Trocknen des Laminin, da dies dazu führen uneven Kulturen und Abnahme der Überlebensfähigkeit der Zellen.
3. Die Lautstärke auf 1.500 Zellen pro 1 & mgr; l durch Zugabe von komplettem Medium und Zugabe von 100 & mgr; l (insgesamt 150.000 Zellen) der Zellsuspension auf jedes Deckglas (das Volumen ist optimal, um die Oberfläche des Deckglases ohne Verschütten zu bedecken). Schließen die Petrischalen und inkubieren für 1 h in einem befeuchteten Brutschrank (37 ° C, 5% CO _2).
   HINWEIS: kritischer Schritt: Dieser Schritt ist für die Verbesserung der Befestigung und die Lebensfähigkeit der Zellen und zur Erhöhung der Anzahl der Deckplättchen pro Embryo erforderlich. Alternativ können die Zellen direkt in die Vertiefungen (mit Deckgläschen), aber die Anzahl von Zellen sollten bis 350.000 pro Well (statt 150.000) erhöht werden übertragen. In anderen Worten, mit dieser Methode können 8-10 Deck erworben werden, während die Direktübertragung ergibt etwa 3-4 Deck weil der Zellen, die an den Platten anzubringen (neben oder unterhalb der Deck). Die durchschnittliche viability der Kulturen, unter Verwendung dieses Verfahrens betrug etwa 90%.

5. Kultur Wachstum und Wartung

1. Nach 1 Stunde Inkubation sorgfältig übertragen Sie die Deckgläser mit dem Medium in 24-Well-Platten, enthaltend 400 & mgr; l vorgewärmten (37 ° C) vollständigem Medium (Gesamtvolumen: 500 ul). Die Zellen O / N bei 37 ° C.
2. Innerhalb von 24 Stunden nach der Inkubation die Wells vorsichtig fügen 500 ul Vollmedium in jede Vertiefung.
   Hinweis: die ersten paar Stunden ist die kritischste Phase für das Überleben von dopaminergen Neuronen und die Anzahl der überlebenden Zellen nicht signifikant über diesen Punkt hinaus zu ändern.
3. Sie zusätzliche Medien hinzufügen, nicht zu den Kulturen in den ersten zwei Wochen, bis das Medium wird gelb. Wenn Kultivierung für mehr als zwei Wochen oder mittlere Farbumschlag nach gelb, Austausch Hälfte der Medien (500 ul) mit frischem Komplettvorgewärmten Medien (in der Regel alle zwei Wochen).
   HINWEIS: Die dopaminerge Neuronen innerhalb derKulturen würden für mehr als 6 Wochen unter diesen Bedingungen zu überleben.

Ergebnisse

Immunhistochemie gegen Tyrosinhydroxylase (Th) zeigt, dass zwischen 0,5-1% der Zellen in Kultur sind dopaminergen. Neuronale Projektionen erscheinen innerhalb von 2 Stunden nach dem Ausstreichen von dem ersten Tag, Axonen und Dendriten unterscheidbar sind (Abbildung 2), unter Verwendung von Tyrosin-Hydroxylase (TH) und Microtubule-Associated Protein 2 (Map2) Antikörper (Abbildung 3). Die Neuronen überleben länger als sechs Wochen zeigen umfangreiche Auswuchs. Das Neuron-Glia-Verhält...

Diskussion

Dopaminerge Neuronen im Mittelhirn sind die Hauptquelle von Dopamin im ZNS. Sie werden in drei Gruppen unterteilt, Substantia nigra pars compacta (SNpc), ventralen Tegmentum (VTA) und retrorubral Feld (RRF) ^{10, 11.} Die Neuronen im VTA SNpc und führen zu großen dopaminergen Bahnen, mesocorticalen, mesolimbischen und nigrostriatalen, in Funktionen beteiligt wie die Kontrolle der Emotionen, Motivation und Verhalten des Motors. Untergang der Neuronen in SNpc und funktionellen Störung des nigrostriatalen System...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12	Invitrogen	11330
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid	Invitrogen	24020-117
Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS)	Invitrogen	16140
N2 Supplement (100X), liquid	Invitrogen	17502-048
D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water	Sigma	G8769
Bovine serum albumin BSA	Sigma	A9430
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Sigma	L2020
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15070
Trypsin (0.05% (wt/vol)	Invitrogen	25300
Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested	Sigma	A9418
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P3813
Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody	Pel-Freez Biologicals	P60101-0
Poly-L-ornithine, 0.01% solution	Sigma	P4957
Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody	Millipore	MAB3418
Anti-Synapsin-1 antibody	Millipore	AB1543P
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG   antibody	Molecular Probes	A-21206
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG   antibody	Molecular Probes	A-21207
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG   antibody	Molecular Probes	A-11015
Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG   antibody	Molecular Probes	A-11016
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG   antibody	Molecular Probes	A-21203
Trypan blue solution (0.4% (wt/vol))	Biowhittaker	17-942E
Stereo Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
Inverted phase contrast microscope	Carl Zeiss	Axiovert 40 C
Dumont Forceps	Fine Scientific Tools	May-45
Cover Slip Forceps – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11251-33
Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11245-30
Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm	Fine Scientific Tools	10052-11
Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm	Fine Scientific Tools	91460-11
Fiber optic halogen illuminator	Nikon	MKII
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes	Fisherbrand	13-678-20C
Hemocytometer	Proscitech	SVZ2NIOU
0.2 µm sterile filter units	Nalgene	NL-CE-156-4020
100x20 mm Petri dishes	BD Biosciences	351005
Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm	Bellco Glass	1943-10012