JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Abstract

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

Introduction

في كثير من الأحيان في دورات الأحياء الجامعية العامة، وتطرق موضوعات تنظيم دورة الخلية والسرطان ولكن ليس على دراسة مفصلة لأن اتساع نطاق المحتوى في هذه الدورات يترك القليل من الوقت للعمق. وبالإضافة إلى ذلك، لا يتم عادة يتعرض الطلاب الأحياء الجامعية للتقنيات المتقدمة المرتبطة بالثقافة الخلية الحيوانية. لمساعدة الطلاب على تطوير فهم أعمق لهذه المفاهيم، في حين أن تطبيق وتحليل ما تعلموه، تم تطوير النشاط مختبر بمثابة تعديل للمعهد والتر ريد للأبحاث (WRAIR) بمد النشاط المختبر 1. تستخدم وحدة المختبر لذلك، استراتيجية تدريجية التجريبية التي تشمل النمو وتميز نموذج الخلايا السرطانية وتطوير وتنفيذ أساليب عد الخلايا، وإقامة دورة الوقت الأمثل وجرعات لعلاج الخلايا مع عوامل مضادة للالتكاثري، وتحديد ممرات إشارة الخلية الشاذة . التجربة يسمح أيضا للفتحالتحقيق -ended.

معظم التقنيات اللازمة لهذا النشاط يمكن أن يتحقق في مختبر البيولوجيا تعليم نموذجي. يبدأ النشاط مع الطلاب تميز سعر الصرف ونمو الورم الماوس الثدي (MMT) خط الخلية، وهذا نموذج لسرطان الثدي البشري 2. وقد تم اختيار سرطان الثدي السرطان نموذج بسبب انتشاره في عدد السكان والألفة لطلاب كلية العمر، والبيانات واسعة النطاق المتاحة. تم اختيار خط الخلية MMT على وجه التحديد لأنه يمكن الحصول عليها بسهولة، وتتميز بشكل جيد، لديه الوقت تضاعف قصيرة وسهلة في النمو. بالإضافة إلى ذلك، خلايا MMT هي التي تتفق مع معظم سرطانات الثدي الإناث تعتمد على هرمون الاستروجين. الطلاب ثم تحديد مسارات إشارة الخلية الشاذة في الخلايا MMT عن طريق علاج الخلايا مع أدوية العلاج الكيميائي الذي آلية عمل شيء على ما يرام established.The تركيز الأدوية وطول العلاج وتتنوع السماح للطلابلتقييم تأثير هذه المتغيرات على معدل انقسام الخلايا. مقايسة الرئيسي لهذا النشاط هو تحديد بقاء الخلية، الأمر الذي يتطلب ببساطة عد الخلايا، وذلك باستخدام واحدة من طريقتين. يعتمد كل أسلوب على مهارات الفحص المجهري قوية. الطلاب تحديد بقاء الخلية باستخدام معيار أو أسلوب عدادة الكريات وطريقة تصوير مجهري رواية واقتراح. وبناء على النتائج التي توصلوا إليها، فإنها يمكن أن تقترح واختبار تعديلات على النشاط. الطلاب ثم تمثل البيانات وتفسير النتائج إلى صقل فرضيتهم ووضع استراتيجيات تجريبية جديدة.

يناسب هذا النشاط مختبر للطالبة أو مستوى السنة الثانية طلاب تخصص في العلوم البيولوجية. ويتم تكثيف قبل أن تتحول إلى وحدة المختبر مدة أسبوع واحد يمكن أن تكتمل في السنة الأولى، البيولوجيا العام أو السنة الثانية الخلوية / الجزيئية علم الأحياء. المهارات اللازمة لاستكمال السليم للنشاط وتشمل العمليات الحسابية الأساسية والجبر، والألفة مع مجموعة من جالمهارات المختبرية خام (على سبيل المثال، pipetting ل، وصنع الحل، تقنية معقمة)، وتحليل البيانات، المجهر الضوئي وإدارة الوقت الأساسية، جنبا إلى جنب مع المعرفة مدرب الثقافة الخلية وبرنامج جداول البيانات. وتشمل الكواشف اللازمة نموذج خط الخلية الحيوانية لسرطان (مثل خلايا فأر الثدي السرطانية، MMT 2)، وكلاء العلاج الكيميائي (على سبيل المثال، تاموكسيفين، الكركمين، الميتفورمين، والأسبرين)، التريبان وسائل الإعلام ثقافة الزرقاء وخلية (على سبيل المثال، النسر الأساسية الدنيا والمتوسطة ؛ EMEM) مع المكملات الغذائية المناسبة (على سبيل المثال، الحصان المانحة والمصل البقري الجنين). وتشمل الأدوات اللازمة ضوء المجهر المقلوب مع المرفقات كاميرا رقمية، كمبيوتر، و 100 ملم و 24 جيدا لوحات زراعة الأنسجة، CO 2 حاضنة (أو ما يعادلها)، ومجلس الوزراء للسلامة الأحيائية (BSC، من الدرجة الثانية)، عدادة الكريات، والبرمجيات المجهر الرقمي.

هناك أمثلة جيدة للأنشطة المختبر المحددة التي تعتمد على زراعة الخلايا الحيوانية لTEACالطلاب ح الجامعية حول المفاهيم في بيولوجيا الخلية 3. ومع ذلك تتطلب العديد من الإمدادات أو التقنيات التي لا يمكن الوصول إليها بسهولة (مثل النظائر المشعة، الأنسجة الحيوانية الحية، ومعدات التصوير المتقدمة 1،4،5)، يصف البروتوكولات التي هي متقدمة جدا (على سبيل المثال، ومناسبة لدورة مستوى 400 6)، أو يتطلب عدة أسابيع أو فصل دراسي مشاريع طويلة 6،7. النشاط المختبر الموصوفة هنا واضح وصريح ويمكن أن تتم في غضون أسبوع واحد مع معدات المختبرات المشتركة.

باختصار، هذه الوحدة مختبر يقدم بشكل فعال أو تعزز مفاهيم دورة الخلية، مسارات الإشارات الخلوية والسرطان في حين تدريس المهارات المعملية الأساسية والمتقدمة، وتحليل البيانات التجريبية، وطريقة زراعة الخلايا الحيوانية والعملية العلمية. وحدة المختبر هي بسيطة وسهلة اقتصاديا ويوفر المرونة وفرصة لتحقيق مفتوح. يشجع النشاط الإبداع طالبمن خلال توفير استراتيجية التجريبية القالب الذي يعمل كدليل لكنها ليست وصفة. الأهم من ذلك، يرضي النشاط كافة المجالات تعلم من الزهور تصنيف 8 كما يتطلب التذكر، الفهم، التطبيق، التحليل وتقييم وخلق من خلال إشراك الطلاب في عملية تسحب منهم من الكتب المدرسية وإلى عالم البحث العلمي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظات: السلوك عن العمل مع الخلايا والكواشف ثقافة خلية في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية (BSC) 9. تصنف الخلايا MMT كما السلامة الأحيائية المستوى الأول، لأنها تشكل منخفض إلى متوسط ​​المخاطر البيولوجية. تطبيق إجراءات التنظيف والتطهير المناسبة لBSC بين الاستخدامات (على سبيل المثال، الأشعة فوق البنفسجية، و 70٪ من الإيثانول مسح أسفل).

1. تنمو الخلايا MMT

  1. زراعة خلايا في 10 سم أطباق زراعة الأنسجة التي تحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام المغذيات الغنية التي تتكون من النسور الحد الأدنى الضروري المتوسطة (EMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، 2 ملي الجلوتامين، و 1٪ فطري / المضادات الحيوية (البنسلين 10 وحدة ، 100 ميكروغرام الستربتومايسين، 0.25 ميكروغرام الأمفوتريسين B). زراعة خلايا في ترطيب 5٪ CO 2 غرفة، عند 37 درجة مئوية. لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 3.6 × 10 6 خلية / سم 2 (انظر عد الخلايا في الخطوة 2).
  2. استبدال نصف وسائل الإعلام ثقافة الخلية مع وسائل الاعلام جديدة كل 48 ساعة نتحدث عنه اليوموفاق سطيف يذكر خلاف ذلك. تحقق بقاء الخلية ومورفولوجيا عن طريق الفحص مع المرحلة مقلوب المجهر ضوء التباين.
    1. لاحظ وتميز الخلايا للحجم وهيكل والشكل والتنظيم والعدد المقدر تحت 100 - 200X التكبير. في هذه الكثافة، يجب أن تظهر الخلايا في طائرة واحدة، وليس تجمعت فوق بعضها البعض وعلى مقربة. تتكون كل خلية من خلايا سميكة، وجوهر كروية مع رقيقة، طويلة، ملحقات مثل فرع توسيع منه أن يأتي إلى نقطة (انظر الشكل 1).
  3. تقسيم الخلايا عندما تصل إلى كثافة الخلايا 7.2 × 10 6 خلية / سم 2. خلايا يحمل نسبة مضاعفة من 1.8 × 10 6 خلية / سم 2 لكل 24 ساعة. تعيين الخلايا مرور X (مقصف) للدلالة على عدد المرات التي تم تقسيمها.
    1. في الجيل 3 (أي بعد ثلاثة مقاطع، P3)، والحصاد، العد، ولوحة الخلايا على لوحة الثقافة 24 الأنسجة بشكل جيد في مناطق ذات كثافة من 3.6 × 10 6 خلية / سم 2.
  4. عرض الخلايا كل يوم وphotomicrographs الرقمية القياسية. ملاحظة ووصف مورفولوجيا الخلايا (أي الحجم والشكل والخصائص الانعكاسية الخفيفة). تحديد الخلية مضاعفة الوقت عن طريق عد الخلايا بشكل منتظم والمتعلقة الوقت المنقضي لعدد الخلايا.

2. عدد الخلايا MMT

ملاحظة: عد الخلايا لتحديد ما إذا كان هناك حاجة الخلايا المراد subcultured، لإعداد لتجربة أو لتحديد بقاء الخلية. هناك نوعان من الأساليب المقدمة هنا.

  1. استخدام عدادة الكريات، وهي تقنية القياسية لحساب الخلايا.
    1. الحصول على عدادة الكريات خط مشرق، حل 0.2٪ من صبغة التريبان الأزرق، المجهر ضوء مركب، وأنابيب الاختبار العقيمة، الماصات وعداد خلية اليدوية.
    2. تحت BSC، واستخدام ماصة 10 مل لإزالة الخلايا من صحن 10 سم زراعة الأنسجة. إذا نمت الخلايا على 24 لوحة جيدا استخدام ماصة 1 مل أو 1000 micropipette ميكرولتر لإزالة وسائل الإعلام.
    3. رسم وسائل الاعلام الخلايا في ماصة، ضع غيض من ماصة ضد قاع الطبق وطرد وسائل الإعلام في حين ينزلق طرف ماصة عبر لوحة. كرر 4-5 مرات للمساعدة في إزاحة الخلايا، فصل كتل ويؤدي إلى عدد خلايا أكثر دقة.
    4. ضع تعليق الخلية مما أدى إلى 15 مل أنبوب معقم (أو 1 مل الطرد المركزي الجزئي أو غيرها من أنبوب حجم صغير). خلاف ذلك، وترك الخلايا في الأصلية لوحة زراعة الأنسجة / جيد.
    5. تحت BSC، والجمع بين 10 ميكرولتر من تعليق زنزانة مع 10 ميكرولتر من محلول أزرق التريبان (نسبة 1: 1) في أجهزة الطرد المركزي الصغيرة غير معقمة أو غيرها من أنبوب حجم صغير.
      ملاحظة: أزرق التريبان وصمة الحيوية التي لم يتم استيعابها من قبل خلايا قابلة للحياة صحية. عندما تلف الخلايا أو ميت، الأزرق التريبان يمكن أن تدخل الخلية مما يسمح للخلايا الميتة ليتم احتساب (ويعرف أيضا باسم صبغ طريقة الاستبعاد). لذا تحت المجهر والخلايا الميتة تظهر الأرجواني الداكن بينما خلايا قابلة للحياة هي لامع وخفيف في اللون.
    6. احتضانفي RT لمدة 5 دقائق.
    7. ضع زلة تغطية على عدادة الكريات. تطبيق 10 ميكرولتر من التريبان الخلية الزرقاء تعليق الخليط في الأخدود. عرض عدادة الكريات في 100 - 200X التكبير. A شبكة أربع الزاوية هو واضح (انظر الشكل 2).
    8. حساب عدد خلايا قابلة للحياة (غير ملوثين) مقابل مجموع الخلايا في كل منطقة الشبكية. متوسط ​​الشبكات الأربع وتتضاعف بحلول 1 × 10 4 للحصول على خلايا / مل.
      1. استقراء العدد الكلي للخلايا في طبق (أو خلية / سم 2). استخدام هذا الرقم إما تحديد حجم الصحيح لتعليق الخلية لاستخدام البذور لوحة زراعة الأنسجة الجديدة في الكثافة المطلوبة من 3.6 × 10 6 خلية / سم 2 أو تحديد العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة على لوحة أو في البئر.
        ملاحظة: للحصول على إرشادات إضافية بشأن استخدام عدادة الكريات، انظر 10.
  2. استخدام البرمجيات وكاميرا رقمية لحساب خلايا قابلة للحياة.
    1. الحصول على ديكاميرا gital والبرامج المصاحبة لها، وإيجاد حل 0.4٪ من صبغة التريبان الأزرق، المجهر ضوء مركب، وأنابيب الاختبار العقيمة، الماصات وجهاز كمبيوتر.
      ملاحظة: كاميرا رقمية Moticam 2000 مع المرافق Motic البرمجيات يعمل هنا. وينبغي أن يكون أي كاميرا قابلة للمقارنة والبرمجيات كافية. تأكد من أن برنامج الكاميرا الرقمية تم معايرة مقدما (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة).
    2. تحت BSC، استخدم 1 مل الماصة أو 1000 ميكرولتر micropipette لإزالة وسائل الإعلام من الخلايا MMT المتزايد في 24 طبق جيدا زراعة الأنسجة. غسل الخلايا الملتصقة من خلال تطبيق بلطف كمية صغيرة (حوالي 500 ميكرولتر) من تستكمل الامم المتحدة (أي EMEM دون أي إضافات) وسائل الإعلام الجديدة على لوحة ثم إزالته. تطبيق 10 ميكرولتر من 0.2٪ التريبان الأزرق (الذي أدلى به تمييع 1: 1 مع الامم المتحدة وتستكمل EMEM) مباشرة إلى البئر.
    3. احتضان لوحة في RT لمدة 5 دقائق.
    4. عرض لوحة تحت المجهر في 100 - 200X التكبير ثإيث تعلق كاميرا رقمية. يمكن غسلها لوحة مع وسائل الإعلام unsupplemented إذا تلطيخ مع 2٪ أزرق التريبان مظلمة جدا.
    5. فتح البرنامج على الكمبيوتر والثانية التحقق من أن البرنامج يتم معايرة للهدف المستخدمة من خلال علامة التبويب إعدادات. يجب أن تظهر صورة لفوف.
    6. حدد الشبكة من علامة التبويب قياس. شبكة من المربعات تقريبا سوف 0.005 سم في العرض تظهر. حدد شبكة معلومات لتأكيد مساحة كل مربع.
    7. اختيار منطقة معينة من الشبكة لعدد الخلايا (أي 5 مربعات × 9 مربعات). حدد مستطيل من علامة التبويب قياس. انقر فوق الزاوية من الساحة واسحب المؤشر ليشمل الساحات في الاختيار.
      ملاحظة: سوف الظل الأخضر تغطي الساحات الاختيار ومربع أبيض سيظهر في الزاوية التي توفر العرض والطول، المنطقة، ومحيط قسم من الشبكة المختارة (انظر الشكل 3).
    8. حساب عدد viabخلايا جنيه داخل منطقة محددة. نفعل نفس الشيء بالنسبة موقعين آخرين في نفس البئر أو لوحة بتحريك لوحة تحت المجهر.
    9. مما لا شك فيه أن منطقة قياس هو نفسه ولم يتغير التكبير. حساب متوسط ​​عدد خلايا قابلة للحياة في المنطقة. باستخدام مجال البئر (لمدة 24 لوحة جيدا، وأيضا واحدة تبلغ مساحتها 2 سم 2، على 100 ​​ملي طبق المنطقة هي 78.6 سم 2)، استقراء عدد من خلايا قابلة للحياة من المنطقة المحددة في الشبكة ل العدد الكلي للخلايا داخل البئر (خلية / سم 2).

3. علاج الخلايا MMT مع وكلاء مكافحة التكاثري

  1. إعداد الحلول للعملاء اختيار مكافحة التكاثري العلاجي (تاموكسيفين، الكركمين والميتفورمين) والمخدرات اختياري، والأسبرين تحت BSC.
    1. حل الكركمين وتاموكسيفين في الإيثانول بنسبة 100٪ لتوليد تركيز الأسهم من 27 ملي. حل الميتفورمين والأسبرين في unsupplementإد EMEM لتوليد تركيز الأسهم من 500 ملي و 15 ملي، على التوالي.
  2. إنشاء الاستجابة للجرعة.
    1. علاج الخلايا MMT مع وكلاء ثلاثة مكافحة التكاثري العلاجي (تاموكسيفين، الكركمين والميتفورمين) والاختيارية المخدرات (الأسبرين) بتركيزات متفاوتة لمدة 96 ساعة لتوليد منحنى الاستجابة للجرعة. في البداية إدارة جميع الأدوية في مجموعة من تركيزات استنادا إلى تقارير نشرت 1،11-16 ثم بتركيزات أكبر أو أصغر من تلك التي نشرت.
      ملاحظة: يحدد الاستجابة للجرعة الحد الأدنى للتركيز الدواء اللازمة لتحقيق النتائج المرجوة. هنا النتيجة المرجوة هي انخفاض في تكاثر الخلايا بالمقارنة مع السيطرة.
      1. لتاموكسيفين والكركمين، استخدام تركيزات (وحدات التخزين المقابلة) من 0.054 ملم (1 ميكرولتر)، 0،108 ملم (2 ميكرولتر)، 0،162 ملم (3 ميكرولتر) و0.216 مم (4 ميكرولتر).
      2. للميتفورمين، واستخدام تركيزات (وحدات التخزين المقابلة) 2 مم (2 ميكرولتر)، 4 مم (4 ميكرولتر)، 6 ملم (6 ميكرولتر)، 8 ملم (8 ميكرولتر) و 10 مم (10 ميكرولتر).
      3. لالأسبرين، استخدام تركيزات (وحدات التخزين المقابلة) من 0.030 ملم (1 ميكرولتر)، 0.060 ملم (2 ميكرولتر)، 0،099 ملم (3.3 ميكرولتر)، 0،150 ملم (5 ميكرولتر)، و0.216 ملم (6.7 ميكرولتر).
    2. تقسيم الخلايا MMT من صحن 10 سم على 24 لوحة جيدا بتركيز 3.6 × 10 6 خلية / سم 2. تحديد تركيز الخلية الأولي من جانب كل وسائل خلية العد (الخطوة 2). دعوة جديدة هذا وحة 24 بئر خلايا "يوم سبليت".
    3. 24 ساعة بعد طلاء الخلايا، وعلاج الخلايا MMT مع كل من العوامل العلاجية لمكافحة التكاثري، تاموكسيفين، الكركمين، الميتفورمين والأسبرين، في تركيزات هو موضح في الخطوة 3.2.1. أشير إلى هذا النحو "يوم 0".
      1. كما كل بئر يمكن أن تعقد بحد أقصى 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام، بال micropipettes استخدام مع نصائح micropipette معقمة ومعلومات جديدة في كل مرة يتم التعامل بئر جديدة لتجنب كرتلوث برمجيات المصدر المفتوح. استخدام اثنين من الآبار والضوابط: الخلايا المزروعة في غياب أي علاج المخدرات (المراقبة السلبية) والخلايا المزروعة في وجود الإيثانول بنسبة 100٪ (مراقبة المذيبات).
    4. تنمو الخلايا وإعادة إدارة المخدرات في تركيزات صفها عندما يتم تغذية الخلايا كل يوم (انظر الخطوة 1.2) لمدة 96 ساعة (حتى يوم 4) في أيام 1 - 4 من العلاج، ومراقبة الخلايا تحت المجهر والعد باستخدام الأسلوب في الخطوة 2.2 (انظر الشكل 4).
    5. تكرار التجربة ثلاث مرات على الأقل.
    6. تحديد تركيز الأمثل لكل المخدرات عن طريق الرسوم البيانية العلاقة بين بقاء الخلية وجرعة المخدرات على طول التجربة (انظر الشكل 5).
  3. إقامة دورة الوقت.
    1. علاج الخلايا MMT مع العوامل العلاجية لمكافحة التكاثري الثلاثة (تاموكسيفين، الكركمين والميتفورمين) في تركيز ثابتة لفترات زمنية متفاوتة. استخدام identif تركيز الأمثلالعبوات الناسفة خلال التجارب الاستجابة للجرعة (انظر الخطوة 3.2).
      1. استخدام تركيزات التالية: 0.216 مم تاموكسيفين، 0،216 ملم الكركمين و 10 ملي الميتفورمين.
        ملاحظة: يحدد دورة الوقت مقدار الوقت اللازم للدواء لإنتاج الأمثل نتيجة المرجوة. هنا، والنتيجة المرجوة هي انخفاض في تكاثر الخلايا بالمقارنة مع السيطرة.
    2. تقسيم الخلايا MMT من صحن 10 سم على 24 لوحة جيدا بتركيز 3.6 × 10 6 خلية / سم 2. تحديد تركيز الخلية الأولي من جانب كل وسائل خلية العد (الخطوة 2). دعوة جديدة هذا وحة 24 بئر خلايا "يوم سبليت".
    3. 24 ساعة بعد طلاء الخلايا، وعلاج الخلايا MMT مع كل من العوامل العلاجية لمكافحة التكاثري، تاموكسيفين، الكركمين، الميتفورمين والأسبرين، في تركيزات المثلى التي تم تحديدها في الخطوة 3.2. أشير إلى هذا النحو "يوم 0".
      1. حيث أن كل جانب يمكن أن تعقد بحد أقصى 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام، لنابال micropipettes ه مع نصائح micropipette معقمة ومعلومات جديدة في كل مرة يتم التعامل بئر جديدة لتجنب التلوث المتبادل.
      2. استخدام اثنين من الآبار والضوابط: الخلايا المزروعة في غياب أي علاج المخدرات (المراقبة السلبية) والخلايا المزروعة في وجود الإيثانول بنسبة 100٪ (مراقبة المذيبات).
  4. تنمو الخلايا وإعادة إدارة المخدرات في تركيز المحددة عند ويتم تغذية الخلايا كل يوم (انظر الخطوة 1.2) لمدة 96 ساعة (حتى يوم 4). في الأيام 1-4 من العلاج، ومراقبة الخلايا تحت المجهر والعد باستخدام الأسلوب في الخطوة 2.2 (انظر الشكل 4).
  5. تكرار التجربة ثلاث مرات على الأقل.
  6. تحديد الوقت الأمثل التعرض للخلايا MMT إلى كل المخدرات عن طريق الرسوم البيانية العلاقة بين بقاء الخلية وطول (الوقت) من العلاج من تعاطي المخدرات في تركيز المحدد (انظر الشكل 6).

4. مختبر وحدة

ملاحظة: فيما يلي ليوم 5جدول مختبر لمختبر وحدة. الشكل 7 هو مخطط تدفق ما الجدول الزمني يستتبع خلال 5 أيام. لهذا النشاط أن تكتمل في غضون خمسة أيام يتم إنشاء أي دورة زمنية أو منحنى الاستجابة للجرعة. ليس هناك وقت كاف لتوليد كل من المنحنيات. ووصف تجربة الاستجابة للجرعة أدناه. تجربة بالطبع الوقت يمكن أن يكون متبادل بسهولة

  1. تقسيم الصف إلى مجموعات: لدينا مجموعة واحدة تؤسس الاستجابة للجرعة وغيرها من مجرى وقت اختيار تركيز في منتصف تركيزات الاستجابة للجرعة المقترحة.
    1. الحفاظ على الثقافات كافية والمخزونات المخدرات بتركيزات مناسبة. ما لم يذكر خلاف ذلك، أداء كل الأعمال تحت BSC.
  2. اليوم 1
    1. الطلاب مباشرة لجعل وسائل الإعلام وتنمو الخلايا (كما في الخطوة 1).
    2. كما طالب الحصول على مخزون من خلايا MMT على 10 سم لوحة، وتوجيه الطلاب لإعداد وسائل الاعلام زراعة الخلايا وإعطاء دروس في استخدام hemocytomeثالثا، المجهر الرقمي والرقمية برنامج الكاميرا المجهر (كما في الخطوة 2).
    3. معايرة البرنامج لأهداف المستخدمة في المجهر (على سبيل المثال، 4X، 10X، 20X) الآن باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة.
  3. يوم 2
    1. اطلب من الطلاب تأكيد مجموع عدد الخلايا وبقاء الخلية (كما في الخطوة 2).
    2. اطلب من الطلاب عد الخلايا على طبق 100 ملم باستخدام كل برنامج الفحص المجهري والأساليب عدادة الكريات، لتأكيد ويتم الحصول على نتائج مماثلة.
    3. الطلاب مباشرة للحصول على 24 لوحة وانقسام الخلايا بشكل جيد من 100 مم طبق على 24 لوحات جيدة للالمطلوبة بدءا كثافة الطلاء خلية (كما في الخطوة 1). ويعتبر هذا اليوم سبليت. وضع لوحة 24 جيدا في حاضنة الثقافة خلية لمدة 24 ساعة.
  4. اليوم 3
    1. زراعة خلايا MMT لمدة 24 ساعة على 24 لوحة جيدا. اطلب من الطلاب مراقبة الخلايا تحت المجهر والعد باستخدام برنامج المجهر (كما في الخطوة 2).
    2. إعطاء الطالب / الشركة المصرية للاتصالاتأنا عينات من مخزون الدواء لعلاج السرطان. يتسنى لهم التحضير وتمييع الحل المخزون الأصلي (كما في الخطوة 3). إضافة تركيزات مختلفة من المخدرات إلى زنازينهم لإنشاء منحنى الاستجابة للجرعة. وهذا ما يسمى اليوم 0.
    3. احتضان الخلايا (الخطوة 1.2) مع الأدوية لأقصى 48 ساعة.
  5. اليوم 4
    1. اطلب من الطلاب مراقبة الخلايا المعالجة بعد 24 ساعة. هذا هو يوم 1.
    2. عد كل بئر باستخدام برنامج المجهر. ويمكن إجراء الصور سجل كل بئر بحيث عد خارج المختبر (كما في الخطوة 2).
    3. احتضان الخلايا (الخطوة 1.2) مع الأدوية لمدة 24 ساعة أخرى.
      ملاحظة: يوفر مدرس الدروس والاستعراضات لتحليل البيانات وعرض رسومية إضافية. يتعلم الطلاب لخلق شخصيات والمؤامرات، والتحليل الإحصائي لليوم التالي لجمع البيانات.
  6. اليوم 5
    1. اطلب من الطلاب معاملة الخلايا بعد 48 ساعة، يوم 2.
    2. عد كلجيدا باستخدام برنامج المجهر. ويمكن إجراء الصور سجل كل بئر بحيث عد خارج المختبر (كما في الخطوة 2).
    3. الحصاد وجمع الخلايا لحساب من طريقة عدادة الكريات التقليدي كوسيلة للتحقق من قدرة الطالب على الاستخدام الفعال لطريقة البرنامج المجهري (كما في الخطوة 2).
      ملاحظة: جمع البيانات واستخلاص استنتاجات أو مراجعة الفرضيات، وفقا لذلك.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تزايد الخلايا MMT ومقارنة أساليب العد.

كانت تزرع بنجاح الماوس الخلايا السرطانية الثديية وتتميز (الشكل 1)، ورواية أسلوب العد الخلية تطويرها باستخدام Motic البرامج، برنامج حاسوبي المرتبطة كاميرا رقمية للالمجهر. وتمت مقا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويرد وحدة المختبر الذي يهدف إلى تعليم مجموعة متنوعة من المواضيع في بيولوجيا الخلايا عن طريق تقنيات متقدمة للثقافة الخلية الحيوانية. وحدة تحقق ذلك من خلال تحليل الآثار المترتبة على عدد من المواد الكيميائية المضادة للالتكاثري على تكرار الخلايا التي نموذج سرطان الثدي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

تلقت الكتاب أي دعم مالي أو قابلة للمقارنة من Motic.

Acknowledgements

This work is supported by the Joseph Alexander Foundation, the ASBMB Undergraduate Research Award, 2013-2014, and a Science Award Grant, Marymount Manhattan College, 2012-2013.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue Culture HoodESCO Labculture ReliantClass II Type A2 Biological Safety Cabinet
Waterjactor CO2 IncubatorCEDCOModel 1510
Bright-line HemocytometerAmerican Opticalwith two separate grids
Motic Images PlusMac OSX Verison 2.0 or higher
Gilson PipetmanRainin instrument co. incP-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Culture MicroscopeOlympus4 objective inverted light microscope with camera
200 μl Pipet tipsMidSci40200C
1,000 μl Pipet tipsMidSciAVR4
10 ml Seriological PipetsTPPTP94010
24 well platesCoStar- Tissue Culture Cluster352424 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized
Trypan Blue Solution 0.4%SigmaT8154100 ml, cell culture tested non-haz
Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-hazSigmaZ375357
Mouse Mammary Tumor(MMT) cellsATCCCCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM)ATCC30-2003500 ml
Fetal Bovine SerumSigmaF0926500 ml
Metformin HydrochlorideSigmaPHR1084500 mg
TamoxifenSigmaT5648white or white-yellow powder
CurmuminSigmaC1386yellow-orange powder
AspirinSigmaA2093meets USP testing specifications

References

  1. Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
  2. Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
  3. Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
  4. Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
  5. Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
  6. Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
  7. Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. usanD. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
  8. Anderson, L. W., et al. A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom's Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , Longman, London, England. (2001).
  9. Centers for Disease Contol and Prevention. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
  10. Davis, J. M. Basic Cell Culture: A Practical Approach. , 2nd edn, Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  11. Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
  12. Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an 'old-age' disease with an 'age-old' solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
  13. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180(2011).
  14. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
  15. Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865(2012).
  16. Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
  17. Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
  18. Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
  19. Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
  20. Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
  21. Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician--the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

100 MMT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved