Verwenden von Maus-Brusttumorzellen Kern Biology Concepts Lehren: A Simple Lab Module

Zusammenfassung

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Zusammenfassung

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

Einleitung

Oft in Bachelor allgemeine Biologie Kurse werden die Themen der Regulation des Zellzyklus und Krebs berührt, aber nicht im Detail untersucht, da die Breite der Inhalte in diesen Kursen lässt wenig Zeit für die Tiefe. Außerdem Bachelor Biologie-Studenten sind normalerweise nicht zu den fortgeschrittenen Techniken mit tierischen Zellkultur ausgesetzt. Die Schüler entwickeln ein tieferes Verständnis dieser Konzepte, während der Anwendung und zu analysieren, was sie gelernt haben, wurde ein Labor-Aktivität als eine Modifikation des Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) erweitert Labortätigkeit ¹ entwickelt. Das Labor-Modul verwendet eine stufenweise, experimentelle Strategie, die wachsen und Charakterisierung einer Krebszellmodell die Entwicklung und Durchführung der Zellzählung Methoden zur Einführung optimalen zeitlichen Verlauf und die Dosierungen für die Behandlung von Zellen, die mit anti-proliferative Mittel, und Identifizieren aberrante Zelle-Signalwege umfasst . Das Experiment ermöglicht auch offen-ended Anfrage.

Die meisten Techniken für diese Tätigkeit erforderlich ist, kann in einem typischen Biologie-Unterricht Labor durchgeführt werden. Die Aktivität beginnt mit Studenten Charakterisierung der Morphologie und Wachstumsrate des Maus-Mamma-Tumor (MMT) Zelllinie, ein Modell für die menschliche ^{Brustkrebs-2.} Brustkrebs wurde als Modell Krebs wegen seiner Verbreitung in der Bevölkerung, seine Bekanntheit bei den College-Alter Studenten, und den weit verbreiteten Daten ausgewählt. Die MMT-Zelllinie wurde speziell ausgewählt, weil es leicht erhältlich, gut charakterisierte, hat eine kurze Verdopplungszeit und ist einfach zu züchten. Außerdem MMT Zellen sind östrogenabhängigen die im Einklang mit den meisten weiblichen Brustkrebs ist. Studenten dann identifizieren aberrante Zelle-Signalwege in den MMT-Zellen durch Behandlung der Zellen mit Chemotherapeutika, deren Wirkungsmechanismus auch established.The Konzentration von Arzneimitteln und der Länge der Behandlung variiert werden, damit die Schülerum die Wirkung dieser Variablen auf die Geschwindigkeit der Zellteilung zu bewerten. Der Schlüssel-Assay für diese Aktivität ist die Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zellen, die einfach erfordert Zellzählung unter Verwendung eines von zwei Verfahren. Jede Methode ist abhängig von starken Mikroskopie Fähigkeiten. Die Schüler bestimmen, die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung eines Standard Hämozytometer Verfahren und eine neue Photomikroskopie Verfahren und vorzuschlagen. Auf der Grundlage ihrer Erkenntnisse, sie schlagen und testen Sie Änderungen an der Aktivität. Studenten dann ihre Daten darstellen und die Ergebnisse zu interpretieren, um ihre Hypothese zu verfeinern und entwickeln neue experimentelle Strategien.

Dieses Labor-Aktivität ist für Erstsemester oder College-Student-Ebene Studenten im Hauptstudium der Biologie geeignet. Es ist in einem einwöchigen Labormodul, das in einem ersten Jahres abgeschlossen werden kann, allgemeine Biologie oder zweiten Jahr zellulären / molekularen Biologie natürlich kondensiert. Fähigkeiten für die ordnungsgemäße Beendigung der Tätigkeit erforderlich sind grundlegende Arithmetik und Algebra, Vertrautheit mit einer Reihe von core Labor Fähigkeiten (zB Pipettieren, Lösung Herstellung, steriler Technik), Datenanalyse, Grundlichtmikroskopie und Zeitmanagement, zusammen mit Instructor Wissen der Zellkultur und Tabellenkalkulationssoftware. Erforderliche Reagenzien gehören Tierzellinie Modell für Krebs (zB Maus-Brusttumorzellen, MMT ^2), Chemotherapeutika (zB Tamoxifen, Curcumin, Metformin und Aspirin), Trypanblau und Zellkulturmedien (zB Eagles Minimum Essential Medium ; EMEM) mit entsprechenden Ergänzungen (zB Geber Pferd und fötales Rinderserum). Benötigte Instrumente umfassen einen invertierten Lichtmikroskop mit Digitalkamera Anlage, Computer, 100 mm und 24 Gewebekulturplatten, CO ₂ Inkubator (oder gleichwertig), Biosicherheitswerkbank (BSC; Klasse II), Hämozytometer und digitale Mikroskopie-Software.

Es gibt gute Beispiele für spezifische Laboraktivitäten, die auf tierische Zellkultur verlassen, um TEACh Studenten über Konzepte in der Zellbiologie ^3. Allerdings erfordern viele Lieferungen oder Techniken, die nicht leicht zugänglich sind (zB radioaktive Isotope, Live tierischem Gewebe, moderne bildgebende Geräte ^1,4,5), beschreiben Protokolle, die recht weit fortgeschritten (zB für eine 400-Level-Kurs ⁶⁾ sind, oder erfordern mehrwöchigen oder Semester lang Projekte ^6,7. Die hier beschriebene Labortätigkeit ist einfach und kann in einer einzigen Woche mit gemeinsamen Laborausrüstung durchgeführt werden.

Zusammenfassend diese Labormodul effektiv führt oder stärkt die Konzepte der Zellzyklus, zelluläre Signalwege und Krebs beim Unterrichten grundlegende und erweiterte Laborkenntnisse, experimentellen Datenanalyse, die Methode der Tierzellkultur und den wissenschaftlichen Prozess. Das Labor-Modul ist einfach und wirtschaftlich erreichbar und bietet Flexibilität und Gelegenheit für offene Anfrage. Die Aktivität fördert Studenten Kreativitätdurch die Bereitstellung einer Vorlage experimentelle Strategie, die als Leitfaden, aber nicht ein Rezept wirkt. Am wichtigsten ist, die Aktivität erfüllt alle Lerndomänen von Blooms Taxonomie ^8, wie es erfordert Erinnerung, Verständnis, Anwendung, Analyse, Bewertung und die Schaffung von durch die Gewinnung Studenten in einem Prozess, der sie aus dem Lehrbuch und in die Welt der wissenschaftlichen Forschung zieht.

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Protokoll

Hinweise: Conduct alle Arbeiten mit Zellen und Zellkultur-Reagenzien in der Klasse II Biosicherheitswerkbank (BSC) ^9. MMT Zellen als Biosafety Level I klassifiziert, da sie geringe bis mäßige biologische Risiko darstellen. Wenden Sie korrekte Reinigung und Dekontamination Verfahren im Rahmen der BSC zwischen Nutzungen (zB UV-Licht, 70% Ethanol abwischen).

1. Wachsen MMT Zellen

1. Wachsen Zellen in 10 cm-Gewebekulturschalen mit 10 ml nährstoffreichen Medium, Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) aus mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Glutamin und 1% antimykotische / Antibiotika (Penicillin 10 Einheiten , 100 ug Streptomycin, 0,25 ug Amphotericin B). Kultivieren Zellen in einer befeuchteten 5% CO ₂ Kammer bei 37 ° C. Platten Zellen in einer Dichte von 3,6 x 10 ⁶ Zellen / cm ² (siehe die Zellzählung im Schritt 2).
2. Ersetzen Sie die Hälfte der Zellkulturmedien durch frisches Medium alle 48 Stunden unless anders angegeben. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen und Morphologie durch Untersuchung mit einem invertierten Phasenkontrastlichtmikroskop.
   1. Hinweis und zu charakterisieren Zellen für Größe, Struktur, Form, Organisation und geschätzte Zahl unter 100 - 200-facher Vergrößerung. Bei dieser Dichte sollten die Zellen in einer Ebene angezeigt werden, nicht übereinander und in großer Nähe verklumpt. Jede Zelle besteht aus einem dichten, kugelförmigen Kern mit dünnen, langen, zweigartigen Erweiterungen Erweiterung aus, die es zu einem Punkt zu kommen (siehe Abbildung 1).
3. Zellen zu unterteilen, wenn sie eine Zelldichte von 7,2 x 10 ⁶ Zellen / cm ² zu erreichen. Zellen weisen eine Verdopplungsrate von 1,8 x 10 ⁶ Zellen / cm ² pro 24 Std. Bezeichnen Zellen Passage X (Px), die Anzahl der Zeiten, die sie aufgeteilt worden zu bezeichnen.
   1. An Generation 3 (dh nach drei Durchgängen, P3), der Ernte, zu zählen, und die Platte, die Zellen auf eine 24-Well-Gewebekulturplatte mit einer Dichte von 3,6 x 10 ⁶ Zellen / cm ^2.
4. Ansicht Zellen jeden Tag und Rekord digitale Mikrofotografien. Hinweis und beschreiben Zellmorphologie (dh Größe, Form, Licht reflektierenden Eigenschaften). Bestimmen Sie Zellverdopplungszeit durch Zählen Zellen regelmäßig und über die verstrichene Zeit auf die Zellzahl.

2. Zählen MMT Cells

Hinweis: Zählen von Zellen zu bestimmen, ob Zellen müssen subkultiviert werden, um für ein Experiment einzurichten oder um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Es gibt zwei Möglichkeiten vorgestellt.

1. Verwendung einer Zählkammer, ein Standardverfahren, um Zellen zu zählen.
   1. Besorgen Sie sich eine hell-line Hämozytometer, eine 0,2% ige Lösung von Trypanblau, einer Verbindung Lichtmikroskop, sterile Reagenzgläser, Pipetten und einem manuellen Zellzähler.
   2. Unter dem BSC, verwenden Sie ein 10 ml-Pipette, um Zellen aus einer 10 cm Gewebekulturschale zu entfernen. Wenn die Zellen auf einer Platte mit 24 Vertiefungen gezüchtet Verwendung einer 1 ml Pipette oder 1.000 & mgr; l-Mikropipette, um das Medium zu entfernen.
   3. Zeichnen Zellmedien in die Pipette, legen Sie die Spitze der Pipette gegen den Boden der Schale und vertreiben die Medien während Sie die Pipettenspitze über die Platte. Wiederholen Sie 4-5 mal, um zu verdrängen Zellen, distanzieren Klumpen und führen zu einer genaueren Zellzahl.
   4. Legen Sie die resultierende Zellsuspension in ein 15 ml sterilen Röhrchen (oder 1 ml Mikrozentrifugen oder andere kleine Volumen Rohr). Ansonsten lassen Sie die Zellen in der ursprünglichen Gewebekulturplatte / well.
   5. Unter dem BSC kombinieren 10 ul der Zellsuspension mit 10 ul der Trypanblau-Lösung (Verhältnis 1: 1) in einem nicht-sterilen Mikrozentrifugen oder andere kleine Volumen Röhre.
      Hinweis: Trypanblau ist ein Vitalfarbstoff, der nicht von gesunden lebenden Zellen aufgenommen wird. Wenn Zellen beschädigt oder tot, Trypanblau kann die Zelle so toten Zellen zu zählen, geben Sie (aka Farbausschlussverfahren). Daher unter dem Mikroskop, tote Zellen erscheinen dunkelviolett, während lebensfähige Zellen sind eine helle und hell in der Farbe.
   6. Bebrütenbei RT für 5 min.
   7. Legen Sie das Deckglas auf der Zählkammer. Auftragen von 10 ul des Trypanblau-Zellsuspensionsmischung in die Nut. Sehen Sie sich die Zählkammer bei 100 - 200-facher Vergrößerung. Ein Vier-Ecken-Gitter ist offensichtlich (siehe Abbildung 2).
   8. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen (ungefärbten) gegenüber Gesamtzellen in jeder Rasterfläche. Der Mittelwert der vier Gitter und multiplizieren mit 1 x 10 ⁴ bis Zellen / ml zu erhalten.
      1. Zu extrapolieren, die Gesamtzahl der Zellen pro Schale (oder Zellen / cm ^2). Verwenden Sie diese Nummer, um entweder zu bestimmen, das richtige Volumen der Zellsuspension zu verwenden, um eine neue Gewebekulturplatte mit der gewünschten Dichte von 3,6 x 10 ⁶ Zellen / cm ² Samen oder bestimmen Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen auf der Platte oder in den Brunnen.
         Hinweis: Weitere Leitlinien für die Verwendung von einem Hämocytometer, siehe ^10.
2. Verwenden Software und eine Digitalkamera an lebensfähigen Zellen zu zählen.
   1. Besorgen Sie sich eine digital-Kamera, die dazugehörige Software, eine 0,4% ige Lösung von Trypanblau, einer Verbindung Lichtmikroskop, sterile Reagenzgläser, Pipetten und einem Computer.
      Hinweis: Ein Moticam 2.000 Digitalkamera mit begleitenden Software Motic ist hier beschäftigt. Alle vergleichbaren Kamera und Software sollte ausreichend sein. Sicherzustellen, dass der Digitalkamera-Software wurde vorab (nach dem Protokoll des Herstellers) kalibriert.
   2. Unter dem BSC, verwenden Sie ein 1 ml-Pipette oder 1000 ul-Mikropipette, um die Medien von den MMT Zellen wachsen in einem 24-Well-Gewebekulturschale zu entfernen. Waschen Sie die anhaftenden Zellen durch leichtes Anlegen einer geringen Menge (etwa 500 ul) der un-ergänzt (dh EMEM ohne Ergänzungen) frisches Medium auf die Platte dann entfernen. Direkt an den gut: Übernehmen 10 ul 0,2% Trypanblau (1 mit un-EMEM ergänzt durch Verdünnen von 1 gemacht).
   3. Die Platte bei Raumtemperatur für 5 min.
   4. Sehen Sie sich die Platte unter dem Mikroskop bei 100 - 200-facher Vergrößerung with eine Digitalkamera angeschlossen. Platte kann mit nicht ergänzten Medium gewaschen werden, wenn Färbung mit 2% Trypanblau ist zu dunkel.
   5. Öffnen Sie die Software auf dem Computer ein nd überprüfen, ob die Software mit dem Ziel, über die Registerkarte Einstellungen verwendet, kalibriert. Ein Bild von dem FOV sollte angezeigt werden.
   6. Wählen Sie das Gitter auf der Registerkarte Measure. Ein Raster aus Quadraten etwa 0,005 cm in der Breite wird angezeigt. Wählen Sie Grid Info, um die Fläche jedes Quadrat zu bestätigen.
   7. Wählen Sie einen bestimmten Bereich des Netzes, um Zellen zu zählen (dh 5 x 9 Quadrate Quadrate). Wählen Sie Rechteck auf der Registerkarte Measure. Klicken Sie auf die Ecke eines Quadrats und ziehen Sie den Cursor, um die Quadrate der Wahl umfassen.
      Hinweis: Ein Schatten des Grüns wird die Quadrate der Auswahl und einem weißen Feld wird in der Ecke, die Breite, Höhe, Fläche bietet erscheinen und Umfang der Abschnitt des gewählten Gitterabdeckung (siehe Abbildung 3).
   8. Die Anzahl der VIABle Zellen innerhalb der ermittelten Fläche. Machen Sie dasselbe für zwei weitere Standorte in der gleichen gut oder Platte durch Bewegen der Platte unter dem Mikroskop.
   9. Achten Sie darauf, dass der gemessene Bereich ist der gleiche und die Vergrößerung nicht geändert hat. Berechnung der durchschnittlichen Zahl der lebensfähigen Zellen innerhalb der Region. Verwendung der Fläche der Bohrung (für eine 24-Well-Platte besitzt eine Vertiefung eine Fläche von 2 cm ^2, für eine 100-mm-Schale die Fläche 78,6 cm ²⁾ zu extrapolieren, die Anzahl lebensfähiger Zellen, die aus dem Bereich, in dem Gitterrahmen abgegrenzt die Gesamtzahl von Zellen innerhalb des Bohrlochs (Zellen / cm ^2).

3. Gönnen MMT Zellen, die mit anti-proliferative Agents

1. Werden die Lösungen der ausgewählten antiproliferative therapeutische Mittel (Tamoxifen, Curcumin und Metformin) und optional Medikament, Aspirin unter der BSC.
   1. Aufzulösen Curcumin und Tamoxifen in 100% Ethanol, um eine Stammkonzentration von 27 mM zu erzeugen. Löse Metformin und Aspirin in unsupplemented EMEM, um eine Stammkonzentration von 500 mM und 15 mM zu erzeugen sind.
2. Stellen Sie eine Dose Response.
   1. Gönnen MMT Zellen mit den drei antiproliferative therapeutische Mittel (Tamoxifen, Curcumin und Metformin) und optional Medikament (Aspirin) bei verschiedenen Konzentrationen für 96 Stunden, um eine Dosis-Wirkungskurve zu erzeugen. Zunächst verwalten alle Medikamente zu einem Bereich von Konzentrationen auf der Grundlage veröffentlichter Berichte ^1,11-16 und dann in Konzentrationen größer oder kleiner als die veröffentlicht.
      Anmerkung: Eine Dosis-Antwort bestimmt die minimale Konzentration eines Arzneimittels notwendig, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Hier kann die gewünschte Ergebnis ist eine Verringerung der Zellproliferation im Vergleich zu der Kontrolle.
      1. Für Tamoxifen und Curcumin, benutzen Konzentrationen (und entsprechenden Volumina) von 0,054 mm (1 & mgr; l), 0.108 mm (2 ul), 0,162 mm (3 ul) und 0,216 mm (4 ul).
      2. Für Metformin, verwenden Konzentrationen (und entsprechenden Volumina) von 2 mm (2 & mgr;), 4 mm (4 & mgr; l), 6 mM (6 ul), 8 mM (8 ul) und 10 mM (10 & mgr; l).
      3. Aspirin, Anwendungskonzentrationen (und die entsprechenden Volumina) von 0,030 mm (1 ul), 0,060 mm (2 ul), 0,099 mM (3,3 ul), 0,150 mm (5 & mgr; l) und 0,216 mM (6,7 ul).
   2. Aufgeteilt MMT Zellen von der 10-cm-Schale auf eine Platte mit 24 Vertiefungen bei einer Konzentration von 3,6 x 10 ⁶ Zellen / cm ^2. Bestimmen anfänglichen Zellkonzentration von beiden Zell Zählverfahren (Schritt 2). Rufen Sie diese neue 24-Well-Platte von Zellen "Day Split".
   3. 24 h nach der Zell Plattieren, behandeln die MMT-Zellen mit jeder der antiproliferative therapeutische Mittel, Tamoxifen, Curcumin, Metformin und Aspirin, bei dem in Schritt 3.2.1 beschriebenen Konzentrationen. Bezeichnen dies als "Tag 0".
      1. Wie jede Vertiefung kann maximal 500 ul Medien, Nutzung Mikropipetten mit sterilen Mikropipettenspitzen und eine neue Spitze jedes Mal eine neue gut behandelt wird, um zu vermeiden, halten Sie cross Kontamination. Mit zwei Vertiefungen als Kontrolle: Zellen in der Abwesenheit einer Medikamentenbehandlung (Negativkontrolle) und Zellen in Gegenwart von 100% Ethanol (Lösungsmittel Kontrolle) gezüchtet gezüchtet.
   4. Wachsen Zellen und neu zu verwalten Drogen an den beschriebenen Konzentrationen, wenn die Zellen jeden zweiten Tag gefüttert (siehe Schritt 1.2) für 96 Stunden (bis zum Tag 4) an den Tagen 1 -. 4 der Behandlung, beachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop und zählen mit das Verfahren in Schritt 2.2 (siehe Figur 4).
   5. Wiederhole den Versuch mindestens drei Mal.
   6. Bestimmen optimale Wirkstoffkonzentration, durch die grafische Darstellung der Beziehung zwischen Zelllebensfähigkeit und Medikamentendosierung über die Länge des Experiments (siehe Abbildung 5).
3. Stellen Sie den Zeitverlauf.
   1. Behandeln MMT Zellen mit den drei antiproliferative therapeutische Mittel (Tamoxifen, Curcumin und Metformin) bei einer festen Konzentration für verschiedene Zeitabstände. Verwenden Sie die optimale Konzentration identifdurch die Dose Response Experimente ied (siehe Schritt 3.2).
      1. Verwenden Sie die folgenden Konzentrationen: 0,216 mM Tamoxifen, 0,216 mM Curcumin und 10 mM Metformin.
         Hinweis: Ein Zeitverlauf bestimmt die Menge an Zeit, die für ein Arzneimittel, ihre optimale gewünschte Ergebnis zu erzeugen. Hier ist das gewünschte Ergebnis eine Verringerung der Zellproliferation im Vergleich zu der Kontrolle.
   2. Aufgeteilt MMT Zellen von der 10-cm-Schale auf eine Platte mit 24 Vertiefungen bei einer Konzentration von 3,6 x 10 ⁶ Zellen / cm ^2. Bestimmen anfänglichen Zellkonzentration von beiden Zell Zählverfahren (Schritt 2). Rufen Sie diese neue 24-Well-Platte von Zellen "Day Split".
   3. 24 h nach der Zell Plattieren, behandeln die MMT-Zellen mit jeder der antiproliferative therapeutische Mittel, Tamoxifen, Curcumin, Metformin und Aspirin an den optimalen Konzentrationen in Schritt 3.2 identifiziert. Bezeichnen dies als "Tag 0".
      1. Da jeder kann auch ein Maximum von 500 ul Medium zu halten, unse-Mikropipetten mit sterilen Mikropipettenspitzen und eine neue Spitze jedes Mal eine neue gut behandelt wird, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
      2. Mit zwei Vertiefungen als Kontrolle: Zellen in der Abwesenheit einer Medikamentenbehandlung (Negativkontrolle) und Zellen in Gegenwart von 100% Ethanol (Lösungsmittel Kontrolle) gezüchtet gezüchtet.
4. Wachsen Zellen und neu zu verwalten Drogen in der gewählten Konzentration, wenn die Zellen jeden zweiten Tag gefüttert (siehe Schritt 1.2) für 96 Stunden (bis zum Tag 4). An den Tagen 1 - 4 von Behandlung, beachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop zu zählen und mit der Methode in Schritt 2.2 (siehe Abbildung 4).
5. Wiederhole den Versuch mindestens drei Mal.
6. Bestimmen, optimalen Belichtungszeit von MMT Zellen miteinander Arzneimittels durch die grafische Darstellung der Beziehung zwischen der Lebensfähigkeit der Zellen und die Länge (Zeit) der medikamentösen Behandlung in der gewählten Konzentration (siehe Abbildung 6).

4. Die Lab-Modul

Hinweis: Das Folgende ist eine 5-Tage-lab Zeitplan für Labor-Modul. 7 ist ein Flußdiagramm, was der Zeitplan würden innerhalb der 5 Tage bringen. Für diese Tätigkeit in fünf Tagen abgeschlossen sein entweder ein Zeitverlauf oder eine Dosis-Wirkungskurve erzeugt wird. Es ist nicht ausreichend Zeit, um die beiden Kurven zu erzeugen. Eine Dosis-Antwort-Experiment wird nachstehend beschrieben. Ein Zeitverlauf Experiment kann leicht ausgetauscht werden

1. Teilen Sie die Klasse in Gruppen: haben eine Gruppe stellen Sie eine Dosis-Wirkung und die andere eine zeitliche Verlauf der Wahl einer Konzentration in der Mitte der vorgeschlagenen Dosis-Wirkungs-Konzentrationen.
   1. Achten Sie auf ausreichende Kulturen und Pharma-Aktien in geeigneten Konzentrationen. Wenn nicht anders angegeben, führen alle Arbeiten im Rahmen des BSC.
2. Tag 1
   1. Direkter Schüler Medien machen und wachsen Zellen (wie in Schritt 1).
   2. Als Studenten erhalten einen Bestand von MMT Zellen auf einer 10 cm Platte, leiten die Schüler zu Zellkulturmedien vorbereiten und ein Tutorial in der Verwendung des hemocytometer, digitale Mikroskopie und die Digitalkamera Mikroskopie-Software (wie in Schritt 2).
   3. Kalibrieren der Software auf die auf dem Mikroskop verwendet Ziele (zB, 4X, 10X, 20X) nun mit dem Protokoll des Herstellers.
3. Tag 2
   1. Lassen Sie die Schüler bestätigen, Gesamtzellzahl und Zelllebensfähigkeit (wie in Schritt 2).
   2. Lassen Sie die Schüler zählen Zellen auf der 100 mm-Schale unter Verwendung sowohl der Mikroskopie-Software und die Zählkammer Methoden, um zu bestätigen, ähnliche Ergebnisse erzielt werden.
   3. Direkter Schüler eine Platte mit 24 Vertiefungen und Split-Zellen aus der 100-mm-Schale, um den 24-Well-Platten auf die gewünschte Ausgangszelle Beschichtungs-Dichte (wie in Schritt 1) ​​zu erhalten. Dies wird als Tag Split. Legen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen in einem Zellkulturbrutschrank für 24 Stunden.
4. Tag 3
   1. Wachsen MMT Zellen für 24 Stunden auf einer 24-Well-Platte. Lassen Sie die Schüler Zellen unter dem Mikroskop beobachten und zählen mit Mikroskopie-Software (wie in Schritt 2).
   2. Geben Sie dem Schüler / tebin Proben der Krebsbehandlung Drogenbestände. Haben sie vorbereiten und verdünnen das ursprüngliche Stammlösung (wie in Schritt 3). Hinzufügen der verschiedenen Konzentrationen der Wirkstoffe, ihre Zellen, um eine Standardkurve herzustellen. Dies wird als Tag 0.
   3. Inkubiere Zellen (Schritt 1.2) mit den Medikamenten für maximal 48 Stunden.
5. Tag 4
   1. Lassen Sie die Schüler behandelten Zellen beobachten, nach 24 Stunden. Dies ist Tag 1.
   2. Zählen Sie jeden gut mit Mikroskopie-Software. Record Fotografien jedes gut, so dass das Zählen kann außerhalb des Labors (wie in Schritt 2) durchgeführt werden.
   3. Inkubieren Zellen (Schritt 1.2) mit den Medikamenten für weitere 24 Stunden.
      Hinweis: Instructor bietet zusätzliche Tutorials und Bewertungen der Datenanalyse und grafische Darstellung. Die Studierenden lernen, Zahlen, Grundstücke, und die statistische Analyse für den nächsten Tag der Datensammlung zu erstellen.
6. Tag 5
   1. Lassen Sie die Schüler behandelten Zellen nach 48 Stunden, Tag 2.
   2. Zählen Sie jeweilsauch mit Hilfe der Mikroskopie-Software. Record Fotografien jedes gut, so dass das Zählen kann außerhalb des Labors (wie in Schritt 2) durchgeführt werden.
   3. Ernte und sammeln Zellen zum Zählen von der traditionellen Hämozytometer Verfahren als Mittel zur Überprüfung der Student Fähigkeit, effektiv zu nutzen die Mikroskopie-Software-Methode (wie in Schritt 2).
      Hinweis: Sammeln von Daten und Schlussfolgerungen zu ziehen oder zu revidieren, Hypothesen, entsprechend.

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Ergebnisse

Wachsende MMT Zellen und Vergleichen Zählverfahren.

Mäusebrusttumorzellen wurden erfolgreich gezüchtet und charakterisiert (Figur 1) und ein neues Verfahren der Zellzählung unter Verwendung Motic Software, eine Digitalkamera-assoziierten Softwareprogramm für ein Mikroskop entwickelt. Diese neue Zell Zählverfahren wurde zu einem traditionellen Zählverfahren unter Verwendung eines Hämocytometers (Abbildung 2) verglichen, und es zeigte ebenso g...

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Diskussion

Ein Labormodul vorgestellt, um eine Vielzahl von Themen in der Zellbiologie durch die fortgeschrittene Techniken der Tierzellkulturen lehren sollen. Das Modul erreicht dies durch die Analyse der Wirkung einer Reihe von anti-proliferative Chemikalien auf die Vermehrung von Zellen, die menschliche Brustkrebsmodell. Der primäre Assay beruht auf der grundlegenden Technik der Zellzählung und stellt einen neuen Weg, um Zellen mittels Mikroskopie-Software zählen. Die Aktivitäten, die das Modul kann mit Instrumenten und Ger...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Culture Hood	ESCO Labculture Reliant		Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Waterjactor CO2 Incubator	CEDCO	Model 1510
Bright-line Hemocytometer	American Optical		with two separate grids
Motic Images Plus			Mac OSX Verison 2.0 or higher
Gilson Pipetman	Rainin instrument co. inc		P-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Culture Microscope	Olympus		4 objective inverted light microscope with camera
200 μl Pipet tips	MidSci	40200C
1,000 μl Pipet tips	MidSci	AVR4
10 ml Seriological Pipets	TPP	TP94010
24 well plates	CoStar- Tissue Culture Cluster	3524	24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized
Trypan Blue Solution 0.4%	Sigma	T8154	100 ml, cell culture tested non-haz
Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz	Sigma	Z375357
Mouse Mammary Tumor(MMT) cells	ATCC	CCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM)	ATCC	30-2003	500 ml
Fetal Bovine Serum	Sigma	F0926	500 ml
Metformin Hydrochloride	Sigma	PHR1084	500 mg
Tamoxifen	Sigma	T5648	white or white-yellow powder
Curmumin	Sigma	C1386	yellow-orange powder
Aspirin	Sigma	A2093	meets USP testing specifications