JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Abstract

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

Introduction

לעתים קרובות בקורסי ביולוגיה כללית לתואר ראשון, בנושאים של רגולציה מחזור התא וסרטן נגעו אך לא נחקרו בפירוט כי רוחבו של תוכן בקורסים אלה משאיר מעט מאוד זמן לעומק. בנוסף, סטודנטים לתואר ראשון בביולוגיה אינם חשופים בדרך כלל לטכניקות המתקדמות הקשורות לתרבות תא של בעלי החיים. כדי לסייע לתלמידים לפתח הבנה עמוקה יותר של מושגים אלה, תוך יישום והניתוח מה שהם למדו, פעילות מעבדה פותחה כשינוי של וולטר ריד צבא מכון המחקר (WRAIR) הרחיב את פעילות המעבדה 1. מודול המעבדה משתמש ב, אסטרטגיה ניסיונית צעד חכם שכוללת גידול ואפיון מודל של תאי סרטן, בפיתוח ובביצוע שיטות ספירת תאים, ההקמה כמובן זמן אופטימלי ומינונים לטיפול בתאים עם סוכנים אנטי-שגשוג, וזיהוי מסלולי איתות תאים חריגים . הניסוי גם מאפשר פתוחהודעה -ended.

רוב הטכניקות הנדרשות לפעילות זו יכולה להתבצע במעבדה הוראת ביולוגיה-טיפוסית. הפעילות מתחילה עם תלמידים המאפיינים את שיעור המורפולוגיה וצמיחה של קו התאים סרטני החלב עכבר (MMT), מודל לסרטן השד אנושי 2. סרטן השד נבחר כמודל הסרטן בגלל שכיחותה באוכלוסייה, היכרותה לתלמידים בגילי קולג ', ונתונים נרחבים הזמינים. שורת תאי MMT נבחרה במיוחד משום שהוא בר השגה בקלות, מאופיין היטב, יש זמן הכפלה קצר וקל לגדול. בנוסף, תאי MMT הם תלויים באסטרוגן אשר עולה בקנה אחד עם רוב מקרי סרטן השד נשיים. תלמידים לאחר מכן לזהות מסלולי איתות תאים חריגים בתאי MMT על ידי טיפול בתאים עם תרופות כימותרפיות מנגנון פעולה שלו הוא גם established.The ריכוז של התרופות והאורך של הטיפולים מגוונים המאפשרים לתלמידיםכדי להעריך את ההשפעה של המשתנים הללו על קצב חלוקת תאים. Assay מפתח לפעילות זו הוא קביעת כדאיות תא, שפשוט דורשת ספירת תאים, באמצעות אחת משתי שיטות. כל שיטה תלויה בכישורי מיקרוסקופ חזקים. תלמידים לקבוע כדאיות תא על ידי שימוש סטנדרטי, שיטת hemocytometer ושיטת photomicroscopy רומן ולהציע. בהתבסס על הממצאים שלהם, הם יכולים להציע ולבחון שינויים בפעילות. תלמידים אז לייצג את הנתונים שלהם ולפרש את התוצאות כדי לחדד את השערתם ולתכנן אסטרטגיות ניסיוניות חדשות.

פעילות מעבדה זה מתאים לתלמידי כיתה ט 'או בכיתה י' ברמת התמחות במדעים הביולוגיים. הוא מרוכז במודול מעבדה של שבוע שניתן להשלים בשנה ראשונה, ביולוגיה כללית או שנה שנייה, כמובן ביולוגיה תאית / מולקולריים. כישורים דרושים להשלמה נכונה של הפעילות כוללים חשבון בסיסי ואלגברה, היכרות עם מערך של גמיומנויות מעבדה עפרות (למשל, pipetting, פתרון קבלת, טכניקה סטרילית), ניתוח נתונים, ניהול מיקרוסקופ האור והזמן בסיסי, יחד עם ידע מורה של תרבית תאים ותוכנת גיליון אלקטרוני. ריאגנטים הנדרשים כוללים מודל שורת התאים של בעלי חיים לסרטן (לדוגמא, תאי החלב עכבר גידול, MMT 2), סוכני כימותרפיה (למשל, טמוקסיפן, כורכום, מטפורמין, ואספירין), תקשורת והתרבות כחולה ותא trypan (למשל, בינוני חיונית המינימלית של הנשר ; EMEM) עם תוספי מזון מתאימים (למשל, סוס תורם וסרום שור עוברי). מכשירים הדרושים כוללים מיקרוסקופ הפוך אור עם קובץ מצורף מצלמה דיגיטלית, מחשב, 100 מ"מ ו -24 צלחות תרבית רקמה היטב, CO 2 באינקובטור (או שווה ערך), ארון בטיחות ביולוגית (BSC; Class II), hemocytometer, ותוכנת מיקרוסקופיה דיגיטלית.

ישנן דוגמאות טובות של פעילויות מעבדה ספציפיות המסתמכות על תרבות תאים של בעלי החיים לTEACסטודנטים לתואר ראשון h על מושגים בביולוגיה של תא 3. עם זאת רבים דורשים אספקה ​​או טכניקות שאינן נגישים בקלות (למשל, איזוטופים רדיואקטיביים, רקמת חיה של בעלי חיים, ציוד הדמיה מתקדם 1,4,5), מתארים פרוטוקולים שהם די מתקדמים (למשל, מתאימים לקורס 400 רמה 6), או דורשים פרויקטים ארוכים רב-שבוע סמסטר או 6,7. פעילות המעבדה המתוארת כאן היא פשוטה ויכולה להיות שנערכה בשבוע עם ציוד מעבדה משותף אחת.

לסיכום, מעבדה מודול זה ביעילות מציג או מחזק את המושגים של מחזור תא, מסלולי איתות תאיים וסרטן תוך הקניית מיומנויות בסיסיות ומתקדמות במעבדה, ניתוח נתוני ניסוי, השיטה של ​​תרבית תאים של בעלי חיים ואת התהליך המדעי. מודול המעבדה הוא פשוט ונגיש מבחינה כלכלית והן מספק גמישות והזדמנות לחקירה פתוחה. הפעילות מעודדת את יצירתיות תלמידעל ידי מתן אסטרטגיה ניסיונית תבנית שפועלת כמדריך, אבל לא מתכון. והכי חשוב, מספק פעילות בכל תחומי הלימוד של טקסונומיה פורח 8 כפי שהוא דורש לזכור, הבנה, יישום, ניתוח, הערכה ויצירה על ידי העוסק תלמידים בתהליך שמושך אותם אל מחוץ לספר הלימוד ולתוך העולם של מחקר מדעי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערות: ניהול כל העבודה עם תאים וחומרים כימיים תרבית תאים בארון בטיחות ביולוגית Class II (BSC) 9. תאי MMT מסווגים כרמת בטיחות ביולוגית אני, כפי שהם מהווים נמוכים עד בינוניים ביולוגי סיכון. החל הליכי ניקוי וטיהור מתאימים לBSC בין שימושים (לדוגמא, אור אולטרה סגול, 70% אתנול לנגב).

1. לגדל תאי MMT

  1. לגדל תאים בצלחות תרבית רקמת 10 סנטימטרים המכילות 10 מיליליטר של תקשורת המזינה העשירה שכוללת הנשרים המינימום ההכרחי בינוני (EMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), גלוטמין 2 מ"מ, ו -1% antimycotic / אנטיביוטי (10 יחידות פניצילין , 100 מיקרוגרם סטרפטומיצין, 0.25 מיקרוגרם amphotericin B). לטפח תאים בתא 5% CO 2 humidified, על 37 מעלות צלזיוס. תאי פלייט בצפיפות של 3.6 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר (ראו ספירת תאים בשלב 2).
  2. להחליף מחצית מתרבית תאי התקשורת עם תקשורת טרי כל 48 שעות UNLESS צוין אחרת. בדוק כדאיות תא ומורפולוגיה בבדיקה עם מיקרוסקופ לעומת אור שלב הפוך.
    1. שים לב ולאפיין תאים לגודל, מבנה, צורה, ארגון ומספר משוער תחת ב 100 - הגדלת 200X. בצפיפות זה, התאים אמורים להופיע במישור אחד, לא בכבדות על גבי זה בזה ובקרבה. כל תא מורכב מליבה עבה, כדורית עם סיומות דקות, ארוכות, כמו סניף ומתרחבות מזה שמגיע לנקודה (ראה איור 1).
  3. לחלק תאים כאשר הם מגיעים לצפיפות תאים של 7.2 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר. תאים להציג שיעור הכפלה של 1.8 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר לכל 24 שעות. לייעד X מעבר תאים (פיקסלים) כדי לציין את מספר פעמים שהם כבר נפרדו.
    1. בדור 3 (כלומר, לאחר שלושה קטעים, P3),, קציר לספור, וצלחת התאים על צלחת תרבות 24 רקמות גם בצפיפות של 3.6 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר.
  4. צפה בתאים בכל יום וphotomicrographs הדיגיטלי השיא. שים לב ולתאר מורפולוגיה תא (כלומר, גודל, צורה, מאפיינים רעיוני אור). לקבוע זמן תא הכפלה על ידי ספירת תאים באופן קבוע ונוגע זמן שחלף למספר תא.

2. ספירת תאי MMT

הערה: ספירת תאים כדי לקבוע אם תאים צריכים להיות subcultured, להקים לניסוי או לקבוע כדאיות תא. ישנן שתי שיטות שהוצגו כאן.

  1. שימוש בhemocytometer, טכניקה סטנדרטית לספור תאים.
    1. להשיג hemocytometer בהיר-קו, פתרון 0.2% של צבע הכחול trypan, מיקרוסקופ אור מתחם, מבחנות סטרילית, טפטפות ודלפק תא במדריך.
    2. תחת BSC, להשתמש פיפטה 10 מיליליטר כדי להסיר תאים מצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים. אם תאים גדלים על צלחת גם 24 להשתמש פיפטה 1 מיליליטר או 1,000 micropipette μl להסיר את המדיה.
    3. צייר תקשורת סלולארי לפיפטה, מקום הקצה של פיפטה נגד תחתית הצלחת ולגרש את התקשורת בזמן הזזה קצה פיפטה על פני הצלחת. חזור על 4-5 פעמים כדי לעזור לסלק תאים, לנתק גושים ולהוביל לספירה תאים מדויקת יותר.
    4. מניחים את ההשעיה תא וכתוצאה מכך צינור 15 מיליליטר סטרילי (או 1 מיליליטר צנטריפוגות מיקרו או צינור נפח קטן אחר). אחרת, לעזוב את התאים בצלחת תרבית רקמה המקורית / טוב.
    5. תחת BSC, לשלב 10 μl של ההשעיה התא עם 10 μl של פתרון trypan הכחול (1: 1 יחס) בצנטריפוגה מיקרו אינו סטרילי או צינור נפח קטן אחר.
      הערה: כחול Trypan הוא כתם חיוני שאינו נקלט על ידי תאי קיימא בריאים. כאשר תאים פגומים או כחול מת, trypan יכול להיכנס לתא ומאפשר לתאים מתים ייספרו (aka לצבוע שיטת הדרה). לכן תחת מיקרוסקופ, תאים מתים יופיעו בצבע סגול כהים ואילו תאי קיימא הם בהיר ואור בצבע.
    6. דגירהב RT במשך 5 דקות.
    7. מניחים את תלוש לכסות על hemocytometer. החל 10 μl של תערובת ההשעיה כחול-תא trypan לתוך החריץ. צפה hemocytometer ב 100 - 200X הגדלה. רשת ארבע-פינה היא לכאורה (ראה איור 2).
    8. לספור את מספר תאי קיימא (בלא כתם) לעומת תאים הכולל בכל אזור gridded. ממוצע ארבע הרשתות ולהתרבות על ידי 1 x 10 4 להשיג תאים / מיליליטר.
      1. להסיק את המספר הכולל של תאים לכל צלחת (או תאים / 2 סנטימטר). להשתמש במספר זה או כדי לקבוע את עוצמת הקול הנכונה של ההשעיה התא להשתמש זרע צלחת תרבית רקמה חדשה בצפיפות הרצויה של 3.6 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר או לקבוע מספר כולל של תאי קיימא על הצלחת או בבאר.
        הערה: לקבלת הדרכה נוספת על השימוש בhemocytometer, ראה 10.
  2. השתמש בתוכנה ומצלמה דיגיטלית לספור תאי קיימא.
    1. להשיג diהמצלמה gital, תוכנה הנלווית אליו, פתרון 0.4% של צבע הכחול trypan, מיקרוסקופ אור מתחם, מבחנות סטרילית, טפטפות ומחשב.
      הערה: מצלמה דיגיטלית Moticam 2,000 עם נלווה MOTIC תוכנה מועסקת כאן. כל מצלמה ותוכנה דומות צריכה להיות מספיק. ודא שתוכנת המצלמה הדיגיטלית כבר מכוילת מראש (על פי הפרוטוקול של היצרן).
    2. תחת BSC, להשתמש pipet 1 מיליליטר או 1,000 micropipette μl להסיר את המדיה מתאי MMT גדלו בצלחת תרבית רקמת 24 גם. לשטוף את התאים חסיד בעדינות על ידי מריחת כמות קטנה (כ -500 μl) של (כלומר, ללא כל תוספי EMEM) תקשורת טרי-בתוספת של האו"ם לצלחת אז להסיר אותו. החל 10 μl של 0.2% trypan כחולים (שנעשה על ידי דילול 1: 1 עם EMEM-בתוספת של האו"ם) ישירות לטוב.
    3. דגירה את הצלחת על RT במשך 5 דקות.
    4. צפה הצלחת מתחת למיקרוסקופ ב 100 - 200X הגדלה wה- i מצלמה דיגיטלית מצורף. צלחת עשויה לשטוף עם תקשורת unsupplemented אם צביעה עם 2% trypan הכחולים כהה מדי.
    5. פתח את התוכנה על מחשב ND לוודא שהתוכנה מכוילת למטרת שימוש באמצעות כרטיסיית ההגדרות. תמונה של FOV אמורה להופיע.
    6. בחר את הרשת מכרטיסיית מדוד. רשת של ריבועים כ 0.005 ס"מ רוחב יופיעו. בחר רשת מידע כדי לאשר את האזור של כל ריבוע.
    7. בחר אזור ספציפי של הרשת לספור תאים (כלומר, 5 ריבועים x 9 ריבועים). בחר מלבן מכרטיסיית מדוד. לחץ על הפינה של ריבוע ולגרור את הסמן כדי להקיף את הריבועים של בחירה.
      הערה: צל של ירוק יכסה את הריבועים של בחירה וקופסא לבנה תופיע בפינה שמספקת את הרוחב, גובה, האזור, והיקף של הסעיף של הרשת שנבחרה (ראה איור 3).
    8. לספור את מספר viabתאים לה באזור הנחוש. לעשות את אותו הדבר עבור שני מקומות אחרים באותו היטב או צלחת על ידי הזזת הצלחת מתחת למיקרוסקופ.
    9. הקפד שהאזור שנמדד הוא זהה והגדלה לא השתנתה. לחשב את המספר הממוצע של תאי קיימא באזור. שימוש בשטח של הבאר (לצלחת גם 24, יש גם אחד על שטח של 2 סנטימטר 2, ל100 מ"מ צלחת האזור הוא 78.6 סנטימטר 2), להסיק מספר תאי קיימא מהאזור שמסומן ברשת ל המספר הכולל של תאים בתוך הבאר (תאים / 2 סנטימטר).

3. לטפל בתאי MMT עם סוכנים אנטי-שגשוג

  1. הכן את הפתרונות של הסוכנים נבחרו אנטי-השגשוג הטיפוליים (טמוקסיפן, כורכום ומטפורמין) ותרופה אופציונלית, אספירין תחת BSC.
    1. לפזר כורכום וטמוקסיפן באתנול 100% כדי ליצור ריכוז המניה של 27 מ"מ. לפזר מטפורמין ואספירין בunsupplementאד EMEM ליצור ריכוז מניות של 500 מ"מ ו -15 מ"מ, בהתאמה.
  2. להקים תגובת מינון.
    1. פנק את תאי MMT עם שלושה סוכנים אנטי-השגשוג טיפוליים (טמוקסיפן, כורכום ומטפורמין) ותרופה אופציונאלי (אספירין) בריכוזים שונים עבור 96 שעות כדי ליצור עקומת תגובת מינון. בתחילה לנהל את כל התרופות בטווח של ריכוזים המבוססים על דיווחים שפורסמו 1,11-16 ולאחר מכן בריכוזים גדולים יותר או קטנים יותר מאלה שפורסמו.
      הערה: תגובת מינון קובעת את הריכוז המינימאלי של תרופה נחוצה כדי להפיק את התוצאות הרצויות. הנה התוצאה הרצויה היא הפחתה בהתפשטות תאים בהשוואה לשליטה.
      1. לטמוקסיפן וכורכום, להשתמש ריכוזים (וכרכים מקביל) של 0.054 מ"מ (μl 1), .108 מ"מ (2 μl), 0.162 מ"מ (3 μl) ו.216 מ"מ (4 μl).
      2. למטפורמין, להשתמש ריכוזים (וכרכים מקביל) של 2 מ"מ (2 μl), 4 מ"מ (4 μl), 6 מ"מ (6 μl), 8 מ"מ (8 μl) ו -10 מ"מ (10 μl).
      3. לאספירין, להשתמש ריכוזים (וכרכים מקביל) של 0.030 מ"מ (μl 1), 0.060 מ"מ (2 μl), 0.099 מ"מ (3.3 μl), 0.150 מ"מ (5 μl), ו.216 מ"מ (6.7 μl).
    2. פיצול תאי MMT מצלחת 10 סנטימטרים על צלחת גם 24 בריכוז של 3.6 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר. לקבוע ריכוז תא ראשוני על ידי שני שיטות התא-הספירה (שלב 2). התקשר צלחת זה חדש 24 גם של תאים "יום פיצול".
    3. 24 שעות לאחר ציפוי תא, טיפול בתאים MMT עם כל אחד מהסוכנים טיפוליים אנטי-שגשוג, טמוקסיפן, הכורכום, מטפורמין והאספירין, בריכוזים שתוארו בשלב 3.2.1. מתייחס לזה כמו "יום 0".
      1. כמו כל גם יכול להחזיק מקסימום של 500 μl של תקשורת, micropipettes שימוש עם טיפים micropipette סטרילי וקצה חדש בכל פעם הוא טיפל גם חדש, כדי למנוע CRזיהום OSS. השתמש בשתי בארות כפקדים: תאים שגודלו בהיעדר טיפול תרופתי (שליטה שלילית) ותאים שגודל באתנול נוכחות 100% (שליטת ממס).
    4. לגדל תאים מחדש לנהל תרופות בריכוזים המתוארים כאשר התאים ניזונים בכל יום אחר (ראה שלב 1.2) עבור 96 שעות (עד ליום 4) בימי 1 -. 4 של טיפול, להתבונן התאים מתחת למיקרוסקופ ולספור באמצעות השיטה בשלב 2.2 (ראה איור 4).
    5. חזור על הניסוי לפחות שלוש פעמים.
    6. לקבוע את הריכוז אופטימלי של כל תרופה על ידי גרפים היחסים בין כדאיות תא ומינון תרופה על פני האורך של הניסוי (ראה איור 5).
  3. להקים כמובן זמן.
    1. פנק את תאי MMT עם שלושה סוכנים אנטי-השגשוג טיפולי (טמוקסיפן, כורכום ומטפורמין) בריכוז קבוע לתקופות שונות בזמן. השתמש בidentif הריכוז האופטימלימטען באמצעות ניסויי תגובת מינון (ראה שלב 3.2).
      1. השתמש בריכוזים הבאים: .216 מ"מ טמוקסיפן, .216 כורכומין מ"מ ו -10 מ"מ מטפורמין.
        הערה: כמובן זמן קובע את משך זמן דרוש לתרופה כדי לייצר התוצאה הרצויה האופטימלית שלה. הנה, את התוצאה הרצויה היא הפחתה בהתפשטות תאים בהשוואה לשליטה.
    2. פיצול תאי MMT מצלחת 10 סנטימטרים על צלחת גם 24 בריכוז של 3.6 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר. לקבוע ריכוז תא ראשוני על ידי שני שיטות התא-הספירה (שלב 2). התקשר צלחת זה חדש 24 גם של תאים "יום פיצול".
    3. 24 שעות לאחר ציפוי תא, טיפול בתאים MMT עם כל אחד מהסוכנים טיפוליים אנטי-שגשוג, טמוקסיפן, הכורכום, מטפורמין והאספירין, בריכוזים אופטימליים שזוהו בשלב 3.2. מתייחס לזה כמו "יום 0".
      1. כמו כל גם יכול להחזיק מקסימום של 500 μl של תקשורת,micropipettes דואר עם טיפים micropipette סטרילי וקצה חדש בכל פעם הוא טיפל גם חדש, כדי למנוע זיהום צולב.
      2. השתמש בשתי בארות כפקדים: תאים שגודלו בהיעדר טיפול תרופתי (שליטה שלילית) ותאים שגודל באתנול נוכחות 100% (שליטת ממס).
  4. לגדל תאים מחדש לנהל תרופות בריכוז שנבחר כאשר התאים ניזונים בכל יום אחר (ראה שלב 1.2) עבור 96 שעות (עד ליום 4). בימי 1 - 4 מתוך טיפול, להתבונן התאים מתחת למיקרוסקופ ולספור בשיטה בשלב 2.2 (ראה איור 4).
  5. חזור על הניסוי לפחות שלוש פעמים.
  6. לקבוע זמן חשיפה אופטימלי של תאי MMT לכל תרופה על ידי גרפים היחסים בין כדאיות תא ואורך (זמן) של טיפול תרופתי בריכוז שנבחר (ראה איור 6).

4. המעבדה מודול

הערה: להלן 5 ימיםמעבדה לוח זמנים למעבדה מודול. איור 7 הוא תרשים זרימה של מה לוח הזמנים יהיו כרוכים בתוך 5 הימים. עבור פעילות זו להסתיים בחמישה ימים או כמובן זמן או עקומת תגובת מינון נוצרה. אין מספיק זמן כדי ליצור שני העקומות. ניסוי תגובת מינון מתואר להלן. יכול להיות להחלפה בקלות ניסוי כמובן זמן

  1. לפצל את הכיתה לקבוצות: קבוצה אחת יש להקים תגובת מינון וכמובן זמן האחר בוחרים ריכוז באמצע ריכוזי תגובת מינון המוצע.
    1. לשמור על תרבויות מספיק ומניות תרופות בריכוזים מתאימים. אלא אם צוין אחרת, לבצע את כל העבודה תחת BSC.
  2. יום 1
    1. סטודנטים ישירים לעשות תקשורת ולגדל תאים (כמו בשלב 1).
    2. בשעה שהתלמידים לקבל מניות של תאי MMT על צלחת 10 סנטימטרים, לכוון את התלמידים להכין תרבית תאי תקשורת ולתת הדרכה בשימוש בhemocytometer, מיקרוסקופיה הדיגיטלית ותוכנת מיקרוסקופ המצלמה הדיגיטלית (כמו בשלב 2).
    3. כייל את התוכנה למטרות שימוש במיקרוסקופ (למשל, 4X, 10X, 20X) כיום באמצעות הפרוטוקול של היצרן.
  3. יום 2
    1. תלמידים לאשר את מספר תא כולל וכדאיויות תא (כמו בשלב 2).
    2. תלמידים לספור תאים על צלחת 100 מ"מ בשתי תוכנות מיקרוסקופיה ושיטות hemocytometer, כדי לאשר את תוצאות דומות מתקבלות.
    3. סטודנטים ישירים להשיג 24 תאי צלחת ופיצול גם מצלחת 100 מ"מ ל24 צלחות גם לצפיפות הרצויה ציפוי התא מתחילה (כמו בשלב 1). זה נחשב יום פיצול. מניחים את הצלחת גם 24 בתרבית תאי חממה למשך 24 שעות.
  4. יום 3
    1. לגדל תאי MMT במשך 24 שעות על צלחת גם 24. תלמידים להתבונן תאים תחת מיקרוסקופ ולספור באמצעות תוכנת מיקרוסקופיה (כמו בשלב 2).
    2. תן הסטודנט / teאני דגימות של מניות תרופות לטיפול בסרטן. יש להם להכין ולדלל את פתרון המניות המקורי (כמו בשלב 3). הוסף את הריכוזים השונים של התרופות לתאיהם להקים עקומת תגובת מינון. זה נקרא יום 0.
    3. דגירה תאים (שלב 1.2) עם התרופות למקסימום של 48 שעות.
  5. יום 4
    1. תלמידים להתבונן תאים שטופלו לאחר 24 שעות. זה יום 1.
    2. לספור כל תוכנת מיקרוסקופ באמצעות היטב. שיא תמונות של כל כך טוב בספירה שיכולות להתנהל מחוץ למעבדה (כמו בשלב 2).
    3. דגירה תאים (שלב 1.2) עם התרופות לעוד 24 שעות.
      הערה: מדריך מספק הדרכות וביקורות של ניתוח נתונים והצגה גרפית נוספות. תלמידים לומדים ליצור דמויות, עלילות, וניתוח סטטיסטי ליום של איסוף הנתונים הבא.
  6. יום 5
    1. האם תלמידים שטופלו בתאים לאחר 48 שעות, יום 2.
    2. לספור כלגם שימוש בתוכנת מיקרוסקופ. שיא תמונות של כל כך טוב בספירה שיכולות להתנהל מחוץ למעבדה (כמו בשלב 2).
    3. קציר ולאסוף תאים לספירה על ידי שיטת hemocytometer המסורתית כאמצעי לאימות יכולת תלמיד להשתמש בשיטת תוכנת מיקרוסקופיה ביעילות (כמו בשלב 2).
      הערה: איסוף נתונים ולהסיק מסקנות או לתקן השערות, בהתאם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

גידול תאי MMT והשוואת שיטות ספירה.

תאי גידול החלב עכבר גדלו בהצלחה ומאופיינת (איור 1) ושיטת ספירת תאים חדשנית שפותחה באמצעות MOTIC תוכנה, הקשורים מצלמה דיגיטלי תוכנה למיקרוסקופ. שיטת ספירת תאים חדשה זו בהשוואה לשיטת ספי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מודול מעבדה מוצג שמטרתו ללמד מגוון של נושאים בביולוגיה של תא בטכניקות המתקדמות של תרבית תאים של בעלי החיים. מודול משיג זאת על ידי ניתוח ההשפעות של מספר הכימיקלים אנטי-שגשוג על השכפול של תאים שמודל סרטן השד אנושי. Assay העיקרי מסתמך על הטכניקה הבסיסית של ספירת תאים ומציג...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים לא קיבלו תמיכה כספית או דומה מMOTIC.

Acknowledgements

This work is supported by the Joseph Alexander Foundation, the ASBMB Undergraduate Research Award, 2013-2014, and a Science Award Grant, Marymount Manhattan College, 2012-2013.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue Culture HoodESCO Labculture ReliantClass II Type A2 Biological Safety Cabinet
Waterjactor CO2 IncubatorCEDCOModel 1510
Bright-line HemocytometerAmerican Opticalwith two separate grids
Motic Images PlusMac OSX Verison 2.0 or higher
Gilson PipetmanRainin instrument co. incP-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Culture MicroscopeOlympus4 objective inverted light microscope with camera
200 μl Pipet tipsMidSci40200C
1,000 μl Pipet tipsMidSciAVR4
10 ml Seriological PipetsTPPTP94010
24 well platesCoStar- Tissue Culture Cluster352424 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized
Trypan Blue Solution 0.4%SigmaT8154100 ml, cell culture tested non-haz
Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-hazSigmaZ375357
Mouse Mammary Tumor(MMT) cellsATCCCCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM)ATCC30-2003500 ml
Fetal Bovine SerumSigmaF0926500 ml
Metformin HydrochlorideSigmaPHR1084500 mg
TamoxifenSigmaT5648white or white-yellow powder
CurmuminSigmaC1386yellow-orange powder
AspirinSigmaA2093meets USP testing specifications

References

  1. Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
  2. Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
  3. Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
  4. Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
  5. Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
  6. Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
  7. Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. usanD. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
  8. Anderson, L. W., et al. A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom's Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , Longman, London, England. (2001).
  9. Centers for Disease Contol and Prevention. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
  10. Davis, J. M. Basic Cell Culture: A Practical Approach. , 2nd edn, Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  11. Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
  12. Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an 'old-age' disease with an 'age-old' solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
  13. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180(2011).
  14. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
  15. Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865(2012).
  16. Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
  17. Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
  18. Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
  19. Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
  20. Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
  21. Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician--the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

100MMT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved