JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Abstract

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in naïve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Introduction

الغوندية التوكسوبلازما (T. الغوندية) هو داخل الخلايا تلزم، الممرض طفيلي. هذا هو العامل المسبب لداء المقوسات، يشكل خطرا على الصحة في الأفراد المناعة. بل هو أيضا في النظام النموذجي لمسببات الأمراض apicomplexan الأخرى التي تصيب البشر بما في ذلك الكريبتوسبوريديوم وCyclospora. ويكتسب داء المقوسات الأكثر شيوعا من خلال تناول طعام أو ماء ملوث المتباطئة أو البيوض المتكيسة مرحلة من مراحل الطفيلي. على ابتلاع، هذه المراحل تحويل إلى مرحلة tachyzoite للطفيل أن يعيد داخل الخلايا المضيفة وتنشر بشكل منتظم. خلايا T، IFN-γ، وإلى حد أقل، وأكسيد النيتريك 1-4، تعتبر مهمة للسيطرة على العدوى ولكنها ليست قادرة على القضاء على المرض، كنسبة من tachyzoites تحويل إلى مرحلة المتباطئة التي يتم حمايتها ضمن الخراجات الأنسجة مما أدى إلى عدوى مزمنة عمرا طويلا. في الواقع، لا توجد علاجات فعالة ضد الكيس الصورة المزمنالمئوية للمرض. داء المقوسات الحاد هو في معظم الأحيان بسبب إعادة تنشيط العدوى المستمرة، مع المرحلة المتباطئة للطفيل تحويل الى تكرار بسرعة tachyzoite مرحلة مميزة من العدوى الأولية والحاد.

البقاء على قيد الحياة في وقت مبكر في مواجهة الاستجابة المناعية الفطرية مهم للسماح الطفيلي للوصول إلى أعداد الطفيل كافية، وكذلك للوصول إلى المواقع البعيدة، لتمكين المؤسسة من عدوى مزمنة. T. وقد تطورت الغوندية استراتيجيات لمواجهة آليات دفاع المضيف التي تساهم المرجح أن قدرته على تكرار ونشر في وقت مبكر من العدوى. أولا، T. الغوندية يشكل PV فريدة من نوعها خلال الغزو الطفيلي الذي هو الفصل بين الجنسين إلى حد كبير من عمليات التقامي وexocytic من الخلية المضيفة مقارنة لمسببات الأمراض داخل الخلايا الأخرى 5-9. أيضا، مثل كل ناجح داخل الخلايا مسببات الأمراض T. الغوندية يعدل الخلية المضيفة لخلق بيئة متساهلة وأو النمو. ويشمل هذا المضيف إعادة برمجة الخلايا التعبير الجيني عن طريق تغيير عوامل النسخ الخلية المضيفة بما في ذلك تلك الأهمية لتنظيم تنشيط الخلايا 10-15. ROP16 16-19، GRA15 20، GRA16 21 و 22 GRA24 كلها قد ثبت أن تكون مهمة في تنظيم استجابة النسخي وخلية يشير شلالات من الخلايا المضيفة المصابين T. الغوندية. وكانت الدراسات التي أجريت مؤخرا باستخدام الصلبان الوراثية بين سلالات طفيلي مع الظواهر متميزة مثمرة للغاية في تحديد الجينات الطفيليات التي تكمن وراء الصفات التي تعتمد على التركيب الوراثي الطفيليات بما في ذلك التهرب من GTPases الحصانة ذات الصلة (IRGs) 16،19،23-26. في الفئران، GTPases الحصانة ذات الصلة (IRGs) هي الحاسمة من أجل السيطرة على النوع الثاني والثالث التراكيب الوراثية للطفيل في حين تطورت خبيث جدا من النوع الأول المورثات آليات للتهرب من IRGs الفئران. ومع ذلك، فمن الواضح أيضا أن الطفيليات قد تطورت آليات للتهرب من وسائل الإعلام المضادة للجراثيميمكن الحفاظ الاختصاصات بالإضافة إلى IRGs وأن بعض هذه الآليات عبر المورثات الطفيلي 27،28. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القليل جدا هو المعروف عن الوسطاء الحرجة من خلايا مناعة ذاتية الحكم ضد T. الغوندية خلال داء المقوسات البشري. الجينات الطفيليات مهمة لمقاومة وسطاء من خلية مناعة ذاتية الحكم قد يكون من المهم أيضا للبقاء على قيد الحياة خلال tachyzoite إلى المتباطئة التحويل والتي يمكن أيضا أن يكون سببها المضيف الاستجابات المناعية. على سبيل المثال، يمكن أن أكسيد النيتريك عند مستويات مرتفعة قمع تكرار الطفيلي في الضامة المصابة ولكن يمكن أيضا تحفيز tachyzoite لتحويل المتباطئة مما أدى إلى إنتاج الكيس 30-32.

ToxoDB هي قاعدة بيانات الجينوم وظيفية للT. الغوندية الذي يعمل كمورد حاسم للحقل من حيث توفير المعلومات عن تسلسل جينوم طفيلي والوصول إلى المنشورة وغير المنشورة البيانات على نطاق والجيني بما في ذلك الشروح المجتمع، إكسب الجين ression والبروتيوميات البيانات 33. وعلى غرار العديد من مسببات الأمراض الطفيلية، والغالبية العظمى من الجينوم يتكون من جينات افتراضية مع أية معلومات متاحة على أساس التماثل الجيني لتوفير نظرة ثاقبة وظائفها المحتملة. وهكذا، وعلم الوراثة إلى الأمام هو أداة قوية لتحديد الجينات الطفيليات جديدة مهمة للتهرب من المناعة، وتحويل الكيس وغيرها من المهام الحرجة للطفيلي المرضية فضلا عن التحويل بين مراحل نمو متميزة. وقوة إضافية من علم الوراثة إلى الأمام هو أنه يمكن استخدامها كنهج نسبيا غير منحازة لاستجواب الطفيلي لالجينات التي تعتبر مهمة لأداء مهام محددة في المرضية، بما في ذلك التهرب المناعة، وتشكيل الكيس. جعلت من طريقة الاختيار لتحديد الجينات المسؤولة عن الطفيليات علم الوراثة الدراسات إلى الأمام باستخدام الطفرات سواء الكيميائية وإقحامي 34-37 التحسينات الأخيرة في الجيل القادم التسلسل لالتنميط التحولي.

ntent "> ومن المهم تحديد نقاط الضعف في T. الغوندية التي يمكن استغلالها لتعزيز فعالية الخلايا آليات مناعية ذاتية الحكم ضد الطفيليات وخاصة تلك التي قد تكون أيضا فعال ضد مرحلة الكيس مقاومة. وتحقيقا لهذا الهدف، وهو في المختبر الفئران وقد وضعت العدوى البلاعم ونموذج التشغيل لتحديد الطفرات في الطفيليات التي تضر تحديدا T. الغوندية اللياقة البدنية بعد تفعيل الضامة المصابة ولكن ليس في الضامة ساذجة. تم استخدام هذه الشاشة البلاعم لاستجواب مكتبة من T. الغوندية المسوخ إقحامي من أجل نهاية المطاف تحديد الجينات T. الغوندية مهمة لمقاومة أكسيد النيتريك 27،28. وعزلة لجنة من المسوخ T. الغوندية مع المقاومة ضعف لتفعيل الضامة المصابة، وخاصة حساسية ملحوظة إلى أكسيد النيتريك، وثبت فائدة الشاشة لتحديد الجينات الطفيليات هامة للمقاومةالى وسطاء من خلية مناعة ذاتية الحكم أخرى من آليات المقاومة وصفه لIRGs الفئران 28. الطفرات إقحامي لها مزايا أكثر من الطفرات الكيميائية من حيث توليد عدد محدود من الطفرات العشوائية في كل استنساخ طفيلي و، من الناحية النظرية، وتحديد أسهل للموقع من الطفرة. ومع ذلك، وتحديد الموقع الجيني البلازميد الإدراج في T. المسوخ إقحامي الغوندية، في الممارسة العملية، كان من الصعب المستغرب في كثير من الحالات 37. إدخال البلازميد إلى الجين ربما سيؤدي الى تعطيل وظيفة الجين على النقيض من الطفرات الكيميائية التي تنتج عادة في التغيرات النوكليوتيدات واحدة أيضا. ومع ذلك، الطفرات الكيميائية إما N-إيثيل-N-نتروزويوريا (ENU) أو سلفونات ethylmethane (EMS) قد تقدم زيادة القدرة على تحليل جزء أكبر من الجينوم طفيلي، بالمقارنة مع الطفرات إقحامي، كما أنه يخلق متعددة الأشكال النوكليوتيدات واحدة ( تقدر 10 -100) في متحولة 34(38 عاما). وعلاوة على ذلك، جعلت التطورات الحديثة في التنميط الجينوم كله من الممكن استخدام الجيل القادم التسلسل للتعرف على الجينات المرشحة الأكثر احتمالا المسؤولة عن النمط الظاهري المحددة للطفيلي تحور 34،38. بغض النظر عن النهج الطفرات، تأكيدا لدور هذا الجين الطفيلي في المقاومة لتفعيل بلعم يتطلب في نهاية المطاف حذف الجينات وتكامل للوفاء المسلمات الجزيئي كوخ.

القدرة على تشريح وظيفة الجين عن طريق التلاعب الجيني لكل من الطفيليات والبلاعم لا يقل أهمية عن العديد من الجينات التي تم تحديدها عن طريق الوراثة قدما في T. الغوندية، فضلا عن مسببات الأمراض الأخرى، لا يزال يوصف الجينات افتراضية مع قليل من دون التماثل تسلسل لبروتينات أخرى ذات وظائف معروفة. وتحدد الورقة الحالية نهجا عاما يمكن استخدامه لتحديد ما إذا كانت الجينات تعطلت في متحولة مهم لمقاومة معروفة أووسيط غير معروف من خلية المناعة الذاتية الحكم. أجريت التحاليل الأولي من المضيف العوامل المضادة للجراثيم من خلال تقييم بقاء النوع البري والطفيليات متحولة في الضامة من نوع الفئران البرية مقابل تلك مع الحذف الجينات المحددة في محرض أكسيد النيتريك سينسيز (iNOS)، GP-91 phox (NADPH أوكسيديز)، و GTPases الحصانة المرتبطة محددة (IRGs). وهذا تحديد ما إذا كانت الجينات الطفيليات التي تم تحديدها هي مهمة لمقاومة أكسيد النيتريك، وسيطة الاكسجين التفاعلية أو حصانة المتعلقة GTPases 28 على التوالي أو إذا آلية مناعية غير معروفة هي المعنية. تفعيل الضامة المصابة مع كل من IFN-γ وLPS، وصفت في البروتوكول الحالي، النتائج في المقام الأول في عزل جينات الطفيلي مهمة لمقاومة أكسيد النيتريك 28. استخدام وكلاء الدوائية التي تحفز على أكسيد النيتريك في غياب تفعيل البلاعم (المانحين أكسيد النيتريك) وأكد أن غالبية الجينات التي جرى تحديدها هامة لإعادةاملساعدات إلى أكسيد النيتريك بدلا من أكسيد النيتريك في الحفل مع وسطاء الإضافية المرتبطة تنشيط البلاعم 28.

خطوة واحدة واثنين من وصف شاشة الوراثة إلى الأمام تهدف إلى عزل المسوخ طفيلي مع وجود خلل اللياقة البدنية بعد تفعيل الضامة المشتقة من نخاع العظم المصاب في المختبر. خطوة واحدة تصف تحليل جرعة المعايرة لتحديد تجريبيا جرعة من γ IFN- وLPS لاستخدامها لتنشيط البلاعم التي تقلل من تكرار الطفيلي ولكن لا تمنع تماما تكرار نوع T. البرية سلالة الأبوية الغوندية التي يتم استخدامها لإنشاء مكتبة من المسوخ طفيلي. تصف الخطوة الثانية الشاشة الوراثية إلى الأمام من الحيوانات المستنسخة طافرة في الضامة في لوحات 96-جيدا. وتحدد الخطوة الثالثة نهجا لتأكيد النمط الظاهري من كل متحولة المحددة في الشاشة لوحات جيدا 96 وتقييم ما إذا كان الخلل في كل متحولة يؤثر بقاء الطفيلي، والنسخ،أو إنتاج الكيس ردا على تنشيط البلاعم. الخطوة الرابعة تصف استخدام الضامة المشتقة من نخاع العظام من الفئران مع الحذف في مسارات المضادة للميكروبات معينة للتعرف على وسطاء المناعية التي متحولة الطفيلي هو عرضة على وجه التحديد. وتحدد الخطوة الخامسة نهجا لتحديد ما إذا كان خطر المسخ الطفيلي أيضا لفي الجسم الحي المرضية حسب تقييم إنتاج الكيس في أدمغة الفئران المصابة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: تم تنفيذ جميع البروتوكولات التي تنطوي على استخدام الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها رعاية الحيوان في كلية الطب في نيويورك واللجنة الاستخدام.
ملاحظة: مفصلة بروتوكولات لالطفرات الكيميائية 38، والعزلة من الطفيليات عن طريق الحد من التخفيف 38، والعزلة من الفئران الضامة نخاع العظام المستمدة 39، ونمو T. الغوندية في الخلايا الليفية القلفة البشرية (HFF) الخلايا وإنتاج الكيس في الضامة والتحليل المناعي الأساسي يتم الرجوع إليها (IFA) 32. تنفيذ جميع زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في وسائل الإعلام D10 (Dulbecco لتعديل العليا الجلوكوز النسر المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين) . إبقاء كل الكواشف عقيمة طوال العزلة خلية والثقافة الخلية.

1. الجرعة المعايرة من IFN-γ وLPS لتحديد Concentrations لاستخدامها لتفعيل الضامة المصابة للشاشة إلى الأمام علم الوراثة

  1. ثقافة عظام الفئران المستمدة من نخاع الضامة O / N في ثمانية الشرائح الزجاجية الغرفة بتركيز 3 × 10 5 خلية / مل في 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام D10 في الغرفة. استخدام الضامة 1-2 أسابيع بعد عزلة من نخاع العظام.
    ويتم شراء الشرائح الدائرة أن يكون لديهم نمو تعزيز RS غسل: ملاحظة.
  2. استخدام عدادة الكريات لحساب الطفيليات نوع البرية تحصد من الخلايا الليفية القلفة البشرية (HFF) الخلايا المزروعة في الثقافة قارورة الأنسجة T25. و resuspend الطفيليات عند تركيز 5 × 10 5 الطفيليات نوع البرية لكل مل في وسائل الإعلام D10. وهذا التركيز يؤدي إلى تعدد إصابة ما يقرب من 1: 1 كما الضامة وتكاثرت O / N. استخدام البوليسترين أو PET أنابيب لجميع التلاعب مع الطفيليات مثل العصي الطفيلي لمادة البولي بروبيلين.
  3. إزالة وسائل الإعلام D10 في الشرائح غرفة واستبدالها مع 250 ميكرولتر منتعليق الطفيليات نوع البرية. بلطف إضافة تعليق الطفيلي لكل غرفة من الشريحة من خلال السماح لها بالتدفق أسفل الوجه الداخلي من كل غرفة. لا تسمح الضامة لتجف في أي وقت خلال البروتوكول.
  4. الشرائح غرفة تغطية المصابة بالطفيليات مع غطاء الشريحة غرفة ومكان في حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 4 ساعة لإتاحة الوقت لطفيل لغزو وإقامة PV.
  5. جعل التخفيفات من LPS وIFN-γ في 1 مل من وسائل الإعلام D10 في أنابيب معقمة للمعايرات الجرعة. لجرعة المعايرة تبقي إما LPS أو IFN- ثابتة التركيز وتختلف الحوافز الأخرى 40.
    1. على سبيل المثال، والحفاظ على LPS ثابتة عند 10 LPS نانوغرام لكل مليلتر وتختلف تركيز IFN- γ (0، 1 وحدة / مل، و 10 وحدة / مل، و 100 وحدة / مل، 1،000 وحدة / مل). الحفاظ IFN- γ ثابتة عند 100 وحدة / مل وتختلف تركيز LPS (0، 0.1 نانوغرام / مل، 1 نانوغرام / مل، 10 نانوغرام / مل، و 100 نانوغرام / مل). الأسهم LPS يصوتن لفترة وجيزة لمدة 2 دقيقة دونالتدفئة في sonicator حمام (وليس مع sonicator غيض) قبل التخفيف.
      ملاحظة: يوصى صوتنة لتعطيل المجاميع مذيلة التي شكلتها LPS التي قد لا تربط بشكل صحيح إلى الخلايا المضيفة.
  6. 4 ساعة بعد بدء شارك في الثقافة بين الطفيليات والضامة ملتصقة في الشريحة الغرفة، تجاهل وسائل الإعلام D10 في كل غرفة واستبدالها مع 300 ميكرولتر من التخفيفات المناسبة من γ IFN- وLPS في وسائل الإعلام D10. تشمل السيطرة مع وسائل الإعلام D10 الوحيد لتقييم تكرار الطفيلي في غياب تفعيل بلعم.
  7. إعادة غطاء الشرائح غرفة مع غطاء الشريحة غرفة ومكان في حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 ل24 إلي 30 ساعة إضافية.
    ملاحظة: دوام الحضانة يعتمد على الوقت مضاعفة من البرية نوع الطفيلي السلالة التي يمكن أن تتراوح 6-12 ساعة تبعا لسلالة الطفيل. يتم اختيار نقطة زمنية قبل طفيلي تحلل الضامة ساذجة لكنها طويلة بما يكفي لتمكين 3-4 على الأقل ضومرات بلينغ.
  8. جعل حل الفورمالديهايد 2.5٪ في الفوسفات المالحة Dulbecco ومخزنة (PBS). تجاهل وسائل الإعلام في الشريحة غرفة واستبدالها مع 300 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد 2.5٪. إصلاح لمدة 20 دقيقة في RT.
  9. الشريحة شطف (ق) مرتين مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في الغرفة. لكل شطف، تجاهل PBS في الشريحة وإضافة PBS جديد بلطف أسفل الوجه الداخلي من كل غرفة الشريحة لتجنب تعطيل الضامة انضمت إلى الشريحة. إضافة 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في غرفة وتغطية مكان على الشريحة غرفة لمنع الشرائح من الجفاف قبل تلطيخ.
    ملاحظة: يمكن وضع الشرائح في 4 مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام في هذه المرحلة قبل تلطيخ.
  10. بروتوكول تلطيخ لT. كشف الغوندية بواسطة المجهر المناعي (IFA).
    1. جعل 0.2٪ تريتون X-100 الحل في برنامج تلفزيوني (العازلة permeabilization). وضع الحل في أنبوب في 37 ° C حمام الماء لفترة وجيزة دوامة لضمان تريتون X-100 يذهب الى حل. تجاهلPBS في الشرائح غرفة واستبدالها مع 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت permeabilization. ترك في RT لمدة 30 دقيقة.
    2. جعل حل 10٪ مصل الماعز في برنامج تلفزيوني (حل حجب). تجاهل المخزن المؤقت permeabilization في الشريحة واستبدالها مع 300 ميكرولتر من عرقلة الحل لكل غرفة. ترك في RT لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن أن تكون بديلا الجنين مصل العجل لمصل الماعز في جميع البروتوكولات تلطيخ.
    3. لخطوة واحدة بروتوكول IFA تلطيخ، وجعل 1: 1،000 التخفيف من الأجسام المضادة fluorescently مترافق إلى T. الغوندية في عرقلة الحل. إزالة حل عرقلة من الشرائح وإضافة 150 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة في الغرفة. استبدال غطاء الشريحة على الشريحة غرفة لمنع الخلايا من الجفاف. احتضان لمدة 1 ساعة على RT.
      ملاحظة: تركيز الأضداد يجب أن تحدد تجريبيا اعتمادا على المصدر. يتم شراء مترافق الأجسام المضادة مباشرة إلى تألقي أو مترافق إلى تألقي من قبل المستخدم.
      1. لمن خطوتين IFA تلطيخبروتوكول مع الأجسام المضادة اللامقترن لT. الغوندية والضد الثانوية مترافق fluorescently، والشرائح وصمة عار مع 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية اللامقترن ضد T. الغوندية في عرقلة العازلة لمدة 1 ساعة على RT. شطف 3X مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 1٪ مصل الماعز (غسل العازلة).
      2. إضافة 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية fluorescently مترافق محددة لأنواع المنشأ للالأجسام المضادة الأولية. استبدال غطاء الشريحة على الشريحة غرفة لمنع الخلايا من الجفاف. احتضان لمدة 1 ساعة على RT.
    4. الشرائح شطف 3X مع برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 1٪ مصل الماعز (غسل العازلة). لكل شطف، وإزالة الحل في الشرائح غرفة عن طريق الإغراق من محتوياته واستبدالها مع 300 ميكرولتر من غسل العازلة.
    5. الشرائح شطف 2X مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    6. إزالة غرفة من الشريحة الغرفة حسب تعليمات الشركة الصانعة.
    7. جبل الشرائح مع تصاعد وسائل الإعلام التي تحتوي على دابي (4'6-diamidino-2-فينيلالإندول، dilactate) و22 مم × 50 مم ساترة.
  11. فحص الشرائح باستخدام النقيض من المرحلة ومضان المجهري. تحديد متوسط ​​عدد الطفيليات في فجوة من خلال دراسة ما لا يقل عن 100 المحاضر الحرفية في الغرفة أيضا. الجرعة المختار γ IFN- وLPS للعرض على الشاشة يجب أن تكون كافية لقمع، ولكن لا تمنع، وتكرار الطفيليات نوع البرية (انظر الشكل 1).

2. عزل الطفيلي المسوخ مع التنشيط بعد للياقة عيب من الضامة المصابة

ملاحظة: مكتبة T. عشوائي مطلوب المسوخ الغوندية للشاشة الوراثة إلى الأمام. الطفرات العشوائية من T. الغوندية يمكن أن يقوم بها الكيميائية (ENU / EMS) أو الطفرات إقحامي 27،28،38. وبعد الطفرات والطفيليات استنساخ عن طريق الحد من تخفيف وتنمو الحيوانات المستنسخة الفردية في لوحات 96-جيدا تحتوي على خلايا HFF ملتصقة في حجم 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام D10 32،38.ومن الأهمية بمكان أن لوحات 96-جيدا لفحص الطفيليات في الضامة بواسطة المجهر لها قيعان البصرية لتمكين الفحص المجهري. على النقيض المرحلة ومضان المجهر لفحص الملون لوحات 96-جيدا يتطلب المجهر مضان مقلوب مع النقيض من المرحلة 4، 10، 20 أو الهدف 40X مجهزة لمسافات العمل الطويلة. والهدف 4X هو مفيد لرؤية البئر كامل ولكن يتم تحقيق أفضل قرار من الطفيليات مع الهدف 20X.

  1. نقل 50 ميكرولتر من المسوخ tachyzoite تزرع في متموجة خلايا HFF في 96-جيدا لوحات زراعة الأنسجة إلى قسمين تكرار لوحات 96-جيدا تحتوي على الضامة المشتقة من نخاع عظام الفئران (بعد 1-2 أسابيع العزلة) في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام D10.
    ملاحظة: إجراء الشاشة الأولي في لوحات 96-جيدا للطفيل على أساس حجم الثقافة الطفيلي لتجنب الاضطرار لحساب عدد من الطفيليات المنقولة في كل بئر. وهكذا، ويستند التحليل المجهري في 2.6 نوعيا على whethإيه والطفيليات تكرار عموما أو منسوخة لا. تصف الخطوة 3 النهج لتأكيد النمط الظاهري من المسوخ في الشرائح الغرفة باستخدام أعداد متساوية من النوع البري أو طفيليات متحولة لتصيب الضامة.
    1. إضافة الطفيليات مباشرة إلى وسائل الإعلام D10 بالفعل في كل بئر. إصابة اثنين من الآبار مع tachyzoites نوع البرية كعنصر تحكم إيجابية للنسخ المتماثل الطفيلي.
  2. وضع الخلايا المصابة في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لمدة 4 ساعة للسماح الطفيليات وقت لغزو الخلايا وخلق PV بهم.
  3. إزالة وسائل الاعلام من لوحة واحدة عن طريق الإغراق محتويات اللوحة. استخدام الوجه واحد من المعصم لتفريغ وسائل الإعلام في لوحة في حوض تجاهل تحتوي على cidal المنظفات للطفيليات.
    1. إضافة 100 ميكرولتر من "وسائل الاعلام تنشيط البلاعم" باستخدام حوض معقم لوسائل الإعلام وماصة الأقنية. استخدام الأمثل للتركيز LPS وIFN-γ تحدد من الخطوة (1) لجنة الهدنة العسكريةوسائل الإعلام تفعيل rophage. وبالمثل إزالة وسائل الاعلام من لوحة تحكم المكررة واستبدالها مع 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام D10.
  4. وضع الخلايا المصابة في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) ل24-30 ساعة إضافية.
  5. بروتوكول تلطيخ لوحات 96-جيدا لIFA.
    1. تجاهل وسائل الإعلام في لوحة واستبدالها مع 100 ميكرولتر من 2.5٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 20 دقيقة في RT. استخدام حوض معقم لالفورمالديهايد وماصة الأقنية.
    2. تجاهل الحل الفورمالديهايد في لوحة وإضافة 100 ميكرولتر PBS لشطف الفورمالديهايد من لوحة.
    3. تجاهل الحل في لوحة وإضافة 100 ميكرولتر من العازلة permeabilization (PBS مع 0.2٪ تريتون X-100) إلى كل بئر. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
    4. تجاهل الحل في لوحة وإضافة 100 ميكرولتر من عرقلة الحل (PBS مع 10٪ مصل الماعز) إلى كل بئر. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
    5. تجاهل الحل في صفي وقت متأخر. إضافة 50 ميكرولتر / جيد لمكافحة T. fluorescently مترافق الغوندية الأجسام المضادة المخفف 1: 1،000 في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 1٪ مصل الماعز. احتضان لمدة 1 ساعة على RT مع غطاء لوحة على وعلى الكرسي الهزاز.
      1. وبدلا من استخدام الأجسام المضادة الأولية اللامقترن ضد T. يتبع الغوندية بواسطة تلطيخ مع الضد الثانوية fluorescently مترافق كما هو موضح في 1.10.3.1.
    6. تجاهل حل الأجسام المضادة في لوحة واستبدالها مع 100 ميكرولتر / جيد من برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 1٪ مصل الماعز. تنفيذ هذا 3X شطف تليها 2 يشطف إضافية مع برنامج تلفزيوني وحدها. ترك 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في كل بئر واستبدال الغطاء على لوحة جيدا 96 لمنع الآبار من التجفيف.
      ملاحظة: لوحة مع غطاء على ويمكن أن تكون ملفوفة في بارافيلم وضعت في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام قبل التحليل المجهري.
  6. فحص الخلايا تحت المجهر الفلورسنت المقلوب باستخدام الهدف 20-40X. اختر المسوخ التي تحاكي في غ &# 239؛ هاء لوحة بلعم ولكن تفشل في الغالب لتكرار ما وراء طفيلي واحد / فجوة في "الضامة تنشيط" أو التي تظهر غير متبلور أو تدهور في "الضامة تفعيلها".
    ملاحظة: إن عدد الطفيليات نوع البرية في فجوة تعتمد على جرعة من IFN-γ وLPS استخدامها ولكن من الناحية المثالية حوالي 4 الطفيليات في فجوة. عدد تعكس قمع النمو ولكن ليس تثبيط كاملة من النسخ المتماثل التحفيز التنشيط.

3. تقييم المسوخ لتحديد ما إذا كان العيب هو في مستوى الطفيلي البقاء على قيد الحياة أو النسخ المتماثل بعد تفعيل الضامة المصابة

  1. نقل اختيار المسوخ طفيلي من لوحات 96-جيدا (محتويات كامل أيضا) إلى T25s تحتوي على خلايا HFF والسماح النسخ المتماثل.
  2. ثقافة نخاع العظم الضامة O / N في 8 الشرائح الزجاجية الغرفة بتركيز 3 × 10 5 خلية / مل في 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام D10 مشتقة. إعداد شريحة واحدة للمقارنة سنوياتكرار rasite في الضامة ساذجة وشريحة إضافية لمقارنة تكرار الطفيلي التالية تفعيل الضامة المصابة.
  3. حصاد الطفيليات tachyzoite والفرز في عدادة الكريات. إضافة 5 × 10 4 T. الغوندية الطفيليات إلى غرفة تحتوي أيضا الضامة في وسائل الإعلام D10 والثقافة لمدة 4 ساعة. تشمل بئر واحدة مع النوع البري الطفيليات الأبوية كمجموعة تحكم. تطعيم شريحة تكرار متطابقة مع نفس استنساخ الطفيليات التي لن تتلقى وسائل الإعلام تفعيل من أجل رصد تكرار الطفيليات في الضامة ساذجة.
  4. تجاهل وسائل الإعلام D10 من 1 الشرائح غرفة تكرار واستبدالها مع 250 ميكرولتر من "وسائل الاعلام تفعيل". تجاهل وسائل الإعلام D10 عن غيرها من الشريحة غرفة تكرار واستبدالها مع 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام D10. احتضان كل من "تنشيط" و "ساذجة" الشريحة بلعم مع غطاء الشريحة الغرفة على عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لadditiاونال 24-30 ساعة.
  5. إصلاح، وpermeabilize، والشرائح كتلة لIFA تلطيخ وتحليل طفيليات كما هو موضح في الخطوة 1. تنفيذ IFA تلطيخ مع الغرف سليمة.
    1. خلايا المشارك وصمة عار مع الأجسام المضادة لغشاء الليزوزومية 1 المرتبطة بها (LAMP1) أو Lysotracker والأجسام المضادة لT. الغوندية لتقييم ما إذا كان تفعيل الضامة المصابة الذي يسبب انصهار المحاضر الحرفية متحولة مع الجسيمات الحالة (الشكل 4).
    2. استخدام الأجسام المضادة للمقصورات محددة / عضيات داخل الطفيلي / PV لتلطيخ التي كتبها IFA لتحديد التعديلات في متحولة الطفيليات التي هي واضحة في وقت مبكر بعد تفعيل بلعم 28.
      ملاحظة: يمكن أن تنص هذه التعديلات التبصر في آلية الذي يكمن وراء نقص البقاء على قيد الحياة / تكرار متحولة التالية تفعيل بلعم.
  6. فحص الشرائح باستخدام 100X النفط المرحلة موضوعية ومضان المجهري.
    1. تقييم تكرار الطفيلي عن طريق تحديدعدد الطفيليات في PV في 100 فجوات عشوائية. أداء لا يقل عن 2 التهم من 100 فجوات في كل من التحليل الإحصائي.
    2. تقييم التشكل الطفيلي العام باستخدام كل من التحليل مضان وكذلك النقيض من المرحلة المجهري. مشاهدة الطفيليات في إطار المرحلة الهدف 100X. وقد الطفيليات المغلقة الطفيليات صحية بإحكام داخل فجوة parasitophorous على مقربة من المناسب. الطفيليات التي لديها فجوات واسعة غير متبلور مع الحافات كثيفة المرحلة أو الطفيليات غير متبلور تشير الموت الطفيلي بدلا من مجرد وجود خلل في النسخ المتماثل (الشكلان 1 و 3).

4. تقييم ما إذا كان يرتبط حساسية المسخ الطفيليات إلى تفعيل الضامة المصابة مع وسطاء المعروفة المضادة للميكروبات

  1. عزل الضامة المشتقة من نخاع العظام من النوع البري الفئران C57 / BL6، iNOS - / -، gp91-phox - / - أو Irgm1 / Irgm3 - / - الفئران 32.
  2. ماك ثقافة نخاع العظم منها مستمدrophages O / N في 8 الشرائح الزجاجية الغرفة بتركيز 3 × 10 5 خلية / مل في 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام D10.
  3. المضي قدما في التحدي الطفيلي، IFA تلطيخ، وتحليل كما هو موضح في الخطوة 3.
  4. تحديد ما إذا كان يتم استعادة قدرة الطفيليات متحولة إلى البقاء على قيد الحياة وتكرار التالية تفعيل الضامة المصابة في غياب الأكسجين التفاعلية أو الأنواع النيتروجين أو حصانة محددة GTPases 28 ذات الصلة.
  5. استخدام وكلاء الدوائية، مثل المانحين أكسيد النيتريك، لتقييم ما إذا كان الوسطاء المضادة للميكروبات معينة كافية في حد ذاتها لإضعاف الطفيليات متحولة في خلايا HFF أو الضامة ساذجة أو إذا كانت تعمل فقط بالتنسيق مع غيرها من الوسطاء الضامة تفعيل 28.

5. تقييم ما إذا كان العيب في العدوى المزمنة المسخ الطفيلي التسويات

  1. عزل tachyzoites من النوع البري، متحولة أو الجينات المستهدفة حذف الطفيليات نمت في T25s التعاونntaining خلايا HFF. الطفيليات يجب هي lysed حديثا من ثقافات HFF.
  2. عدد الطفيليات باستخدام عدادة الكريات. الطفيليات resuspend في هانكس محلول ملحي متوازن (HBSS) بتركيز لكل مل مناسبة لجرعة شبه قاتلة للطفيل تسليمها في 200 ميكرولتر من داخل الصفاق حقن (IP).
  3. استخدام 1 مل حقنة السلين و 25 G إبرة لحقن الطفيليات مع حجم 200 ميكرولتر داخل الصفاق (IP). الجرعة يعتمد على نوع السلالة البرية من الطفيليات وراثى الماوس.
    ملاحظة: النوع الأول التراكيب الوراثية للطفيل هي قاتلة للفئران أثناء المرحلة الحادة للعدوى بغض النظر عن الجرعة الطفيلي وغير مناسبة لدراسات عدوى مزمنة في غياب العلاج الكيميائي لT. الغوندية لقمع تكرار الطفيلي.
  4. بعد ثلاثين يوما التحدي الطفيلي، التضحية الفئران عن طريق استنشاق CO 2 من خزان الضغط في غرفة غير مزدحم (قد تحتوي على معيار قفص حجم الماوس لا يزيد عن 5 مالجليد) تليها خلع عنق الرحم.
  5. عزل الدماغ من الماوس باستخدام إجراءات تأسيس 41-43.
    1. وضع الماوس على جانبها الأمامي. رذاذ الرأس مع الايثانول 70٪ لتعقيم المنطقة.
    2. استخدام مقص حاد لقطع طريق جذع الدماغ. استخدام مقص تشريح لاجراء خفض الضحلة أفقيا حول الحق وثم الجانب الأيسر من الجمجمة بدءا من قاعدة جذع الدماغ. استخدام ملقط لقشر بلطف ذهابا الجمجمة لفضح الدماغ.
    3. رفع بلطف الدماغ ومكان مقص بين الدماغ وقاعدة الجمجمة إلى قطع العصب الشمي لتحرير الدماغ. اخراج الدماغ مع ملقط معقم أو ملعقة وضعها في لوحة بيتري الجرثومية التي تحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة.
  6. قطع المخ في نصف مع مشرط معقم من خلال مركز بين اليمين واليسار نصفي الكرة الأرضية.
  7. إضافة نصف من الدماغ إلى هاون صغيرة تحتوي على 1 مل من برنامج تلفزيوني. استخدام هاون ومدقة لجعل التعليق الأنسجة بشكل جيد للدماغ التي يمكن أن تمر من خلال واسعة تتحمل 20-200 ميكرولتر ماصة.
    ملاحظة: النصف الآخر من الدماغ ينبغي أن تكون ثابتة في 2.5٪ الفورمالديهايد لمدة 1 ساعة إذا كانت هناك حاجة أقسام الأنسجة لأمراض الأنسجة.
  8. وضع 100 ميكرولتر من المحللة الدماغ في أنبوب 1.7 مل ميكروسنتريفوج. إضافة 1 مل من 2.5٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني في أنبوب يحتوي على المحللة الدماغ لإصلاح تعليق الدماغ لتلطيخ. في احتضان RT لمدة 30 دقيقة.
  9. الطرد المركزي المحللة في 8،000 x ج لمدة 5 دقائق في microcentrifuge وتجاهل بعناية طاف.
  10. إضافة 1 مل من permeabilization / عازلة لمنع المحللة (10٪ مصل الماعز، 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني). في احتضان RT لمدة 30 دقيقة.
  11. المحللة أجهزة الطرد المركزي في 8،000 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة طاف.
  12. إضافة 200 ميكرولتر من FITC مترافق dolichos biflorus agglutin (DBA). استخدام 1: 100 التخفيف من كتين في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 10٪ مصل الماعز. resuspend بلطف المحللة من قبل pipetting. احتضانلمدة 1 ساعة على RT.
    ملاحظة: DBA هو يجند التي تربط لCST1 على الحائط الطفيلي الكيس.
  13. المحللة أجهزة الطرد المركزي في 8،000 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني لبيليه. في احتضان RT لمدة 5 دقائق. كرر PBS غسل 3X. إزالة طاف بعد غسل النهائي باستخدام ماصة.
  14. استخدام واسع تتحمل 20-200 ميكرولتر ماصة لوضع 5 ميكرولتر من المحللة الدماغ الملون ومكان على شريحة المجهر. جبل الشريحة مع 25 × 25 مم زلة تغطية لخلق جبل الرطب من المحللة الدماغ. تقديم 3 الشرائح تكرار استخدام 5 ميكرولتر من الدماغ المحللة لكل منهما.
  15. حساب عدد الأكياس في كل قسامة 5 ميكرولتر بواسطة المجهر مضان باستخدام الهدف 10X (الشكل 6).
    ملاحظة: بعض الخراجات الكبيرة (8 أو أكثر الطفيليات تقريبا)، في حين بعضها صغير جدا (1-2 الطفيليات في الكيس). عد عدد من الخراجات في كل شريحة ولكن وثيقة عدد كبير مقابل عدد من الأكياس الصغيرة.
  16. إضافة عدد من الخراجات ديتECTED في ثلاثة مختلفة مأخوذة 5 ميكرولتر وضرب من قبل عامل التخفيف الكلي × 2 (فقط وقدم نصف من الدماغ إلى المحللة) لتقدير عدد من إجمالي الخراجات في الدماغ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

التوكسوبلازما يعيد بحرية في الضامة ساذجة ولديه الوقت تضاعف بين 6-12 ساعة تبعا لسلالة من الطفيلي الشكل 1 يظهر الطفيليات تمثيلية في السذاجة مقابل تنشيط العظم الضامة المشتقة من نخاع الشكل 2 يوضح التشكل العام للطفيليات في HFF الخلايا المضيفة في 2 و 4 و ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وينص البروتوكول وصف نهج غير منحاز يستخدم تفعيل الضامة الفئران المستمدة من نخاع العظام وعلم الوراثة إلى الأمام لعزل T. المسوخ الغوندية مع وجود خلل في قدرتها على البقاء على قيد الحياة تفعيل الضامة المصابة. النمط الظاهري من المسوخ تنشيط البلاعم التالية وعادة ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have no competing financial interests.

Acknowledgements

Special thanks to Dr. Peter Bradley for the antibody to detect the T. gondii mitochondria. The work was supported by National Institute of Health Grants AI072028 and AI107431 to D.G.M and a generous donation to New York Medical College for the study of tropical medicine.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMHycloneSH3008101https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29101&productId=3255471&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone FBSThermoSH3091003https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=11737973&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone DPBSThermoSH3002802 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2434305&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone L-glutamineThermoSH3003401 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3311957&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone Pen strepThermoSV30010 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668
6&catalogId=29104&matchedCat
No=SV30010&fromSearch=1&
searchKey=SV30010&highlightPro
ductsItemsFlag=Y&endecaSearch
Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings= 0.0&xrefEvent=1407777949003_0
&searchType=PROD&hasPromo=0
Hyclone Hanks BSSThermoSH3003002https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3064595&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
LPSLIST biologicals201http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords
=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4
IFN-γPepro Tech Inc50-813-664https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652&
productId=2988494&catalogId=29
104&matchedCatNo=50813664&
fromSearch=1&searchKey=murine+ifn+pepro+tech&highlightProductsItemsFlag
=Y&endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778210608_
12&searchType=PROD&hasPromo
=0
Chamber slidesThermo177402https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2164545&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well optical platesThermo165306https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3010670&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well tissue culture platesFisher353072https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3158736&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Tissue culture flast T25Fisher156367https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039
67&catalogId=29104&matchedCat
No=12565351&fromSearch=1&
searchKey=156367&highlightProdu
ctsItemsFlag=Y&endecaSearchQu
ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778974800_
0&searchType=PROD&hasPromo
=0
Ted Pella EM grade formaldehydeTed Pella18505http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712
Triton X-100FisherBP151https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3425922&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Alexa 488 - protein conjugation kitLife TechnologiesA20181http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235
goat serumMP BiomedicalsICN19135680https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2133236&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&crossRefData
=ICN19135680=2&searchType
=PROD&hasPromo=0
Vectashield mounting mediaVector LabsH1200https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428
FITC-conjugated dolichosVector LabsFL-1031https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188
Antibody to LAMP1Developmental Studies Hybridoma Bankhttp://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1
LysoTrackerLife TechnologiesL-7526https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product
C57BL6 miceJackson Laboratories664http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html
gp91 phox knock out miceJackson Labaoratories2365http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html
iNOS knock out miceJackson Laboratories2609http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html
sodium nitroprussideACROS OrganicsAC21164-0250 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2627727&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
DETA NONOateACROS OrganicsAC32865-0250https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2252389&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii AbFitzgerald Industries International10T19Ahttp://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947

References

  1. Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185 (7), 1261-1273 (1997).
  2. Schluter, D., et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates chronic cerebral toxoplasmosis in Toxoplasma gondii-susceptible C57BL/6 mice but does not reactivate the latent disease in T. gondii-resistant BALB/c mice. J Immunol. 162 (6), 3512-3518 (1999).
  3. Khan, I. A., Matsuura, T., Fonseka, S., Kasper, L. H. Production of nitric oxide (NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1-/- mice. J Immunol. 156 (2), 636-643 (1996).
  4. Khan, I. A., Schwartzman, J. D., Matsuura, T., Kasper, L. H. A dichotomous role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13955-13960 (1997).
  5. Mordue, D. G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L. D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 190 (12), 1783-1792 (1999).
  6. Mordue, D. G., Sibley, L. D. Intracellular fate of vacuoles containing Toxoplasma gondii is determined at the time of formation and depends on the mechanism of entry. J Immunol. 159 (9), 4452-4459 (1997).
  7. Coppens, I., et al. Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell. 125 (2), 261-274 (2006).
  8. Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M., Kasper, L. H., Mellman, I. Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science. 249 (4969), 641-646 (1990).
  9. Dobrowolski, J. M., Sibley, L. D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell. 84 (6), 933-939 (1996).
  10. Kim, S. K., Fouts, A. E., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii dysregulates IFN-gamma-inducible gene expression in human fibroblasts: insights from a genome-wide transcriptional profiling. J Immunol. 178 (8), 5154-5165 (2007).
  11. Lang, C., et al. Impaired chromatin remodelling at STAT1-regulated promoters leads to global unresponsiveness of Toxoplasma gondii-Infected macrophages to IFN-gamma. PLoS Pathog. 8, e1002483(2012).
  12. Kim, L., Butcher, B. A., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii interferes with lipopolysaccharide-induced mitogen-activated protein kinase activation by mechanisms distinct from endotoxin tolerance. J Immunol. 172 (5), 3003-3010 (2004).
  13. Leng, J., Butcher, B. A., Egan, C. E., Abdallah, D. S., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii prevents chromatin remodeling initiated by TLR-triggered macrophage activation. J Immunol. 182 (1), 489-497 (2009).
  14. Leng, J., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii inhibits covalent modification of histone H3 at the IL-10 promoter in infected macrophages. PLoS One. 4, e7589(2009).
  15. Seabra, S. H., de Souza, W., DaMatta, R. A. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. 100 (1), 62-70 (2002).
  16. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS Pathog. , e1002236(2011).
  17. Ong, Y. C., Reese, M. L., Boothroyd, J. C. Toxoplasma rhoptry protein 16 (ROP16) subverts host function by direct tyrosine phosphorylation of STAT6. J Biol Chem. 285 (37), 28731-28740 (2010).
  18. Saeij, J. P., et al. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
  19. Jensen, K. D., et al. Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 9 (6), 472-483 (2011).
  20. Rosowski, E. E., et al. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
  21. Bougdour, A., et al. Host cell subversion by Toxoplasma GRA16, an exported dense granule protein that targets the host cell nucleus and alters gene expression. Cell Host Microbe. 13 (4), 489-500 (2013).
  22. Braun, L., et al. A Toxoplasma dense granule protein, GRA24, modulates the early immune response to infection by promoting a direct and sustained host p38 MAPK activation. J Exp Med. 210 (10), 2071-2086 (2013).
  23. El Hajj, H., et al. ROP18 is a rhoptry kinase controlling the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 3, e14(2007).
  24. Etheridge, R. D., et al. The Toxoplasma Pseudokinase ROP5 Forms Complexes with ROP18 and ROP17 Kinases that Synergize to Control Acute Virulence in Mice. Cell Host Microbe. 15 (5), 537-550 (2014).
  25. Niedelman, W., et al. The rhoptry proteins ROP18 and ROP5 mediate Toxoplasma gondii evasion of the murine, but not the human, interferon-gamma response. PLoS Pathog. 8, e1002784(2012).
  26. Zhao, Y., et al. Virulent Toxoplasma gondii evade immunity-related GTPase-mediated parasite vacuole disruption within primed macrophages. J Immunol. 182 (6), 3775-3781 (2009).
  27. Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
  28. Skariah, S., Bednarczyk, R. B., McIntyre, M. K., Taylor, G. A., Mordue, D. G. Discovery of a novel Toxoplasma gondii conoid-associated protein important for parasite resistance to reactive nitrogen intermediates. J Immunol. 188 (7), 3404-3415 (2012).
  29. Zhao, Z., et al. Autophagosome-independent essential function for the autophagy protein Atg5 in cellular immunity to intracellular pathogens. Cell Host Microbe. 4, 458-469 (2008).
  30. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infect Immun. 62 (5), 1761-1767 (1994).
  31. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of bradyzoite-specific Toxoplasma gondii antigens in gamma interferon-treated mouse macrophages. Infect Immun. 61 (3), 1141-1145 (1993).
  32. Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii cyst wall formation in activated bone marrow-derived macrophages and bradyzoite conditions. J Vis Exp. (42), 2091(2010).
  33. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36, D553-D556 (2008).
  34. Farrell, A., et al. Whole genome profiling of spontaneous and chemically induced mutations in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15, 354(2014).
  35. Farrell, A., et al. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
  36. Brown, K. M., et al. Forward genetic screening identifies a small molecule that blocks Toxoplasma gondii growth by inhibiting both host- and parasite-encoded kinases. PLoS Pathog. 10, e1004180(2014).
  37. Jammallo, L., et al. An insertional trap for conditional gene expression in Toxoplasma gondii: identification of TAF250 as an essential gene. Mol Biochem Parasitol. 175 (2), 133-143 (2011).
  38. Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), 3807(2012).
  39. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. J Vis Exp. (81), e50966(2013).
  40. Sibley, L. D., Adams, L. B., Fukutomi, Y., Krahenbuhl, J. L. Tumor necrosis factor-alpha triggers antitoxoplasmal activity of IFN-gamma primed macrophages. J Immunol. 147 (7), 2340-2345 (1991).
  41. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  42. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J Vis Exp. Feb. (48), 2348(2011).
  43. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225(2014).
  44. Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol Biochem Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
  45. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8 (6), 484-495 (2010).
  46. Fleckenstein, M. C., et al. A Toxoplasma gondii Pseudokinase Inhibits Host IRG Resistance Proteins. PLoS Biol. 10, e1001358(2012).
  47. Cirelli, K. M., et al. Inflammasome sensor NLRP1 controls rat macrophage susceptibility to Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 10, e1003927(2014).
  48. Ewald, S. E., Chavarria-Smith, J., Boothroyd, J. C. NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infect Immun. 82 (1), 460-468 (2014).
  49. Gorfu, G., et al. Dual role for inflammasome sensors NLRP1 and NLRP3 in murine resistance to Toxoplasma gondii. MBio. 5 (1), (2014).
  50. Lees, M. P., et al. P2X7 receptor-mediated killing of an intracellular parasite, Toxoplasma gondii, by human and murine macrophages. J Immunol. 184 (12), 7040-7046 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

97

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved