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要約

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

要約

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in naïve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

概要

トキソプラズマトキソプラズマ（トキソプラズマ）は偏性細胞内、原生動物病原体である。それは、トキソプラズマ症の原因物質、免疫無防備状態の個体における健康被害である。また、 クリプトスポリジウム及びシクロスポラ含むヒトに感染する他のアピコンプレクサの病原体についてのモデル系である。トキソプラズマ症は、最も一般的に寄生虫ブラディゾイトまたはオーシスト段階で汚染された食物または水の摂取を介して取得される。摂取時には、これらのステージは、宿主細胞内で複製し、全身に広める寄生虫のタキゾイトステージに変換する。 T細胞は、IFN-γ、および、より少ない程度に、窒素酸化物1-4は 、感染症の制御に重要であるが、タキゾイトの割合が組織嚢内で保護されブラディゾイト期に変換するように、疾患を排除することができない長命の慢性感染症になる。実際には、全く治療薬は慢性シストSに対して効果はありません病気の田下。重度のトキソプラズマ症は、プライマリおよび急性感染の急速複製タキゾイト段階特性に戻って変換する寄生虫のブラディゾイト期で、起因する持続感染の再活性化に最も頻繁にある。

先天性免疫応答の面で初期の生存は、寄生虫が十分な寄生虫数に到達するため、ならびに慢性感染症の確立を可能にするために、遠位部位に到達させることが重要である。T.トキソプラズマは、おそらく複製し、感染の早期普及する能力に貢献する宿主防御機構に対抗するための戦略を発展させてきました。まず、T。トキソプラズマは、他の細胞内病原体5-9と比べて、宿主細胞のエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスのプロセスから大幅に偏析する寄生虫の侵入時にユニークなPVを形成している。また、成功したすべての細胞内病原体のようなT.トキソプラズマは、許容される環境fを作成するために、その宿主細胞を修飾するまたは成長。これは、細胞活性化10-15を調節するための重要なものを含む宿主細胞の転写因子を変更することによって再プログラミング宿主細胞遺伝子発現を含む。 ROP16 16-19は 、GRA15 20、GRA16 21とGRA24 22はすべてT.感染した宿主細胞のシグナル伝達カスケード転写応答及び細胞の調節に重要であることが示されているトキソプラズマ 。明確な表現型を有する寄生虫株の間遺伝的交雑を用いた最近の研究では、免疫関連GTPアーゼ（IRGs）16,19,23-26の回避などの寄生虫の遺伝子型に依存する特性の基礎となる寄生虫の遺伝子の同定に生産性の高いされている。非常に毒性の強いタイプIの遺伝子型は、マウスIRGsを回避する機構を進化させてきたが、マウスでは、免疫関連GTPアーゼ（IRGs）は、寄生虫のタイプIIおよびIIIの遺伝子型の制御のために重要である。しかし、寄生虫抗菌メディアを回避する機構を進化させていることも明らかであるIRGsに加えて、これらのメカニズムのいくつかは、寄生虫の遺伝子型27,28を越えて保存されるよう役。また、非常に少ないが、Tに対する細胞自律的な免疫の重要なメディエーターについてはほとんど知られていない人間のトキソプラズマ症の間にトキソプラズマ 。細胞自律的な免疫のメディエーターへの抵抗のために重要な寄生虫の遺伝子はまた、宿主の免疫応答によってトリガすることが可能な変換をブラディゾイトするタキゾイト中に生存のために重要であるかもしれない。例えば、高いレベルでの一酸化窒素は、感染したマクロファージにおける寄生虫の複製を抑制することができるが、それはまた、嚢胞の生産30-32、結果の変換をブラディゾイトするタキゾイトを刺 ​​激することができる。

ToxoDBはT.のための機能的なゲノムデータベースですトキソプラズマ 、そのコミュニティの注釈を含む公開され、未発表のゲノムスケールのデータにシーケンス寄生虫ゲノムの情報およびアクセスを提供するという点でフィールドの重要なリソースとして機能し、遺伝子EXP ressionとプロテオミクスデータ33。多くの原生動物の病原体と同様に、ゲノムの大半は彼らのポテンシャル関数への洞察を提供するために、遺伝子の相同性に基づいて、利用可能な情報がないとの仮定の遺伝子からなる。このように、フォワード遺伝学は免疫回避、嚢胞変換や寄生虫病因に重要な他の機能のためだけでなく、個別の発達段階との間の変換のための重要な新規寄生虫遺伝子を同定するための強力なツールです。フォワード遺伝学のさらなる長所は、免疫回避及び嚢胞形成を含む病因における特定のタスクのために重要な遺伝子のような寄生虫を調べるために、比較的偏りのないアプローチとして使用することができることである。突然変異プロファイリングのための次世代の配列決定における最近の改善は、化学的および挿入突然変異34-37の両方を用いた順遺伝学研究から責任寄生虫遺伝子を同定するための選択方法で行った。

ntent ">それは、寄生虫に対する細胞自律的な免疫機構にも耐性の嚢胞段階に対して活性であり得ることを特にの実効性を高めるために活用することができトキソプラズマの脆弱性を特定することが重要である。この目的に向けて、in vitroでネズミマクロファージ感染と活性化モデルは、具体的にナイーブマクロファージ内で感染したマクロファージの活性化に続いてではなく、 トキソプラズマの適応度を損なう寄生虫に変異を同定するために開発されました。このマクロファージ画面は、最終的にするために、 トキソプラズマ挿入変異体のライブラリーを調べるために使用された一酸化窒素27,28への抵抗のための重要なトキソプラズマ遺伝子を同定する。感染したマクロファージの活性化に損なわれた抵抗性を有するトキソプラズマ変異体のパネルの単離、一酸化窒素に特に顕著な感度は、識別するために、画面の有用性を証明した抵抗のための重要な寄生虫の遺伝子ネズミIRGs 28について記載した耐性機構以外の細胞自律的な免疫のメディエーターに。挿入変異誘発は、制限されたそれぞれの寄生虫クローンにおけるランダム変異の数と、理論的には、突然変異の部位をより容易に識別を生成するという点で化学的突然変異誘発を超える利点を有している。しかし、Tのプラスミド挿入のゲノム部位を特定するトキソプラズマ挿入変異体は、実際には、多くの場合、37で、驚くべきことには困難であった。遺伝子へのプラスミドの挿入は、典型的には、単一のヌクレオチド変化をもたらす化学的突然変異誘発とは対照的に、遺伝子の機能を破壊する可能性がある。それは、複数の一塩基多型を作成しかし、化学的突然変異誘発は、N-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）、またはエチルメタンスルホン酸（EMS）のいずれかで（、挿入突然変異と比較して、寄生虫のゲノムの大部分を分析する能力の増加を提供することができる突然変異体34あたり10 -100）と見積もら、38。また、全ゲノムプロファイリングの最近の進歩により、変異した寄生虫34,38の識別された表現型に関与する可能性が最も高い候補遺伝子を同定するために、次世代シークエンシングを使用するようになった。かかわらず、変異誘発アプローチの、マクロファージ活性化に抵抗の寄生虫遺伝子の役割の確認は最終的に、分子コッホの仮説を満たすために遺伝子欠失および相補性を必要とします。

寄生虫とマクロファージの両方の遺伝子操作によって遺伝子の機能を分析する能力は、Tに前進遺伝学を経由して同定された遺伝子の多くが同様に重要であるトキソプラズマ原虫、ならびに他の病原体は、まだ既知の機能を有する他のタンパク質と全く配列相同性をほとんどと仮定的遺伝子として特徴づけられる。現在の紙は、変異体において破壊された遺伝子は、既知のまたはそれに抵抗するために重要であるかどうかを識別するために使用できる一般的なアプローチを概説細胞自律的な免疫の未知の仲介者。ホスト抗菌因子の初期分析は、野生型および誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）のgp-91 phoxの（NADPHオキシダーゼ）における特定の遺伝子欠失を有するものに対して、野生型マウス由来のマクロファージにおける変異寄生虫の生存を評価することによって行われ、特異免疫関連分子量GTPase（IRGs）。識別された寄生虫の遺伝子は、一酸化窒素、反応性酸素中間体または免疫関連分子量GTPase 28それぞれまたは未知の免疫機構が関与している場合への抵抗のために重要である場合、これが決定されます。現在のプロトコルに記載されてIFN-γ及びLPSの両方に感染したマクロファージの活性化は、主に一酸化窒素28への抵抗のために重要な寄生虫遺伝子の単離をもたらす。マクロファージ活性化の非存在下で一酸化窒素を誘導する薬理学的薬剤の使用は、（一酸化窒素供与体）が同定された遺伝子の大部分は再ために重要であることが確認されたマクロファージ活性化28に関連する追加メディエーターと協調して一酸化窒素のではなく、一酸化窒素にsistance。

ステップ1と2は、in vitroで感染した骨髄由来マクロファージの活性化に続いてフィットネスの欠陥とは寄生虫の変異体を分離するために設計されたフォワード遺伝学の画面について説明します。第一段階は、寄生虫複製を減少させるが、完全に野生型Tの複製を阻害しないマクロファージの活性化のために使用することが経験的にIFN-γの用量を決定するために、用量滴定分析を説明し、LPS寄生虫の変異体のライブラリーを作成するために使用されるトキソプラズマ親株。ステップ2は、96ウェルプレート中のマクロファージにおける変異クローンのフォワード遺伝子スクリーニングを説明しています。ステップ3は、96ウェルプレートのスクリーニングで同定された各変異体の表現型を確認し、各変異体に欠陥が寄生虫の生存に影響を及ぼすかどうかを評価するために、複製アプローチを概説マクロファージ活性化に応答して、または嚢胞製造。ステップ4つの寄生虫変異体が特に影響を受けやすいれる免疫メディエーターを同定するための特定の抗菌経路の欠失を有するマウスからの骨髄由来マクロファージの使用を記載している。ステップ5は、感染したマウスの脳内シスト生産によって評価される寄生虫の変異体はまた、インビボ病因のために危険にさらされているかどうかを判断するためのアプローチの概要を説明します。

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プロトコル

注：動物の使用を含むすべてのプロトコルは、ニューヨーク医科大学の動物実験委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。
NOTE：38希釈、マウス骨髄由来マクロファージ39の単離、T.の成長を制限することにより、化学的突然変異誘発38、寄生虫の単離のための詳細なプロトコール線維芽細胞ヒト包皮におけるトキソプラズマ （HFF）細胞および嚢胞生産マクロファージにおける基本的な免疫蛍光分析（IFA）32が参照される。 （10％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法高グルコースイーグル培地）をD10培地中で、5％CO 2中37℃ですべての細胞培養を行う。細胞単離および細胞培養を通して無菌の全ての試薬を保管してください。

Concentrを決定するために、IFN-γおよびLPSの1用量滴定フォワード遺伝学の画面用に感染マクロファージを活性化するために使用する管理ポイント

  1. 培養マウス骨髄由来マクロファージO / N室あたりD10培地250μlの中で3×10 5細胞/ mlの濃度で8チャンバースライドガラスにおいて。骨髄から分離した後、二週間後にマクロファージのいずれかを使用します。
    注：チャンバースライドは、RSの洗浄を強化成長を持っていることが購入されています。
  2. T25組織培養フラスコ中で増殖させたヒト包皮線維芽細胞（HFF）細胞から採取した野生型寄生虫をカウントする血球計数器を使用してください。 D10培地1ml当たり5×10 5野生型寄生虫の濃度で寄生虫を再懸濁する。マクロファージは、O / Nを増殖しているでしょうとして1：この濃度は、約1の感染多重度になります。ポリプロピレンへの寄生虫スティックなどの寄生虫を持つすべての操作のためにポリスチレンやPETチューブを使用してください。
  3. チャンバースライドにD10メディアを取り出して、250μlのと交換してください野生型寄生虫のサスペンション。静かに、各チャンバの内面を流下させることにより、スライドの各チャンバへ寄生虫懸濁液を加える。マクロファージは、プロトコル中の任意の時点で乾燥させないでください。
  4. 4時間、5％CO 2で37℃のインキュベーターにチャンバースライドカバーと場所との寄生虫に感染したカバーチャンバースライドに侵入し、PVを確立する寄生虫のための時間を可能にする。
  5. 用量滴定のための滅菌チューブでD10培地1ミリリットル中のLPSおよびIFN-γの希釈液を作る。用量について滴定はLPSまたはIFN-集中定数のいずれかを保持し、他の40の刺激変わる。
    1. 例えば、1ml当たり10 ngのLPSでLPSを一定に維持し、IFN-γ（0、1単位/ ml、10単位/ ml、100単位/ mlの1000単位/ ml）の濃度を変化させる。 IFN-mlの100単位/時定数γ及びLPS（0、0.1 ng / mlで、1 / mlの、10 ng / mlで、100ng / mlの）の濃度を変化させる保つ。 2分間簡単に言うと超音波処理LPS在庫なし希釈前の風呂超音波処理（しないと先端超音波処理）で加熱。
      注：超音波処理して細胞をホストするために適切に結合しないことが、LPSによって形成されたミセル凝集体を崩壊させることをお勧めします。
  6. チャンバースライド内寄生虫と接着性のマクロファージの間の共培養開始後4時間、各チャンバー内D10メディアを破棄し、IFN-γとD10メディアにおけるLPSの適切な希釈液300μlのと交換してください。マクロファージ活性化の非存在下で寄生虫の複製を評価するための唯一のD10メディアとの制御を含む。
  7. 24~30追加の時間、5％CO 2、37℃でインキュベーター中にチャンバースライドカバーと場所での再カバーチャンバースライド。
    注：インキュベーション時間は、寄生虫株に応じて6~12時間の範囲であることができる野生型寄生虫株の倍加時間に依存する。時点は、ナイーブマクロファージの溶解を寄生虫の前に、少なくとも3~4堂を可能にするのに十分な長さに選択されるブリンブリン回。
  8. ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の2.5％ホルムアルデヒド溶液を作る。チャンバースライドでメディアを破棄し、2.5％ホルムアルデヒド溶液300μlで交換してください。室温で20分間固定してください。
  9. 室あたりPBS300μlのリンススライド（S）を2回。各すすぎのために、スライドにPBSを破棄して、スライドに付着したマクロファージの中断を避けるために、各スライドチャンバーの内面まで優しく新しいPBSを追加。染色前に乾燥からスライドを防止するために、チャンバースライド上室と場所カバーあたり300μlのPBSを追加します。
    注：スライドを染色前に、この時点で3日間まで4℃に置くことができる。
  10. T.ための染色プロトコル免疫蛍光顕微鏡（IFA）によるトキソプラズマ検出。
    1. PBS中0.2％トリトンX-100溶液（透過化緩衝液）を行う。トリトンX-100溶液になることを確認するために37℃の水槽と簡単にボルテックスその中にチューブ内の溶液を配置します。捨てるチャンバースライドでPBSおよび透過化バッファー300μlで交換してください。室温で30分間のままにしておきます。
    2. （ブロッキング溶液）PBS中10％ヤギ血清の溶液を作る。スライドで透過化バッファを破棄し、室あたりのブロッキング溶液300μlで交換してください。室温で30分間のままにしておきます。
      NOTE：ウシ胎児血清は、全ての染色プロトコルでヤギ血清の代わりに使用することができる。
    3. Tに、蛍光標識抗体の千希釈：1ステップIFA染色プロトコルの場合、1を作るブロッキング溶液中でトキソプラズマ 。スライドからブロッキング溶液を除去し、室あたりの抗体溶液150μlを添加する。乾燥から細胞を防ぐために、チャンバースライド上のカバースライドを取り付けます。室温で1時間インキュベートする。
      （注）抗体濃度は経験的にソースに応じて決定されなければならない。抗体は、直接蛍光色素にコンジュゲートし、ユーザが蛍光色素にコンジュゲート購入される。
      1. 二段階IFA染色用Tにコンジュゲートしていない抗体を用いたプロトコルT.に対する非標識一次抗体を150μlとトキソプラズマと、蛍光結合二次抗体、染色スライドRTで1時間ブロッキング緩衝液でトキソプラズマ 。 300のPBSμlの+ 1％ヤギ​​血清（洗浄バッファー）で3回洗浄します。
      2. 一次抗体のための起源の種に特異的な蛍光結合二次抗体を150μlを追加します。乾燥から細胞を防ぐために、チャンバースライド上のカバースライドを取り付けます。室温で1時間インキュベートする。
    4. リンススライドをPBS + 1％ヤギ​​血清（洗浄バッファー）で3倍。各すすぎのために、その内容をダンプすることでチャンバースライド内の溶液を除去し、洗浄バッファーを300μlと交換してください。
    5. リンススライドをPBS300μlの2倍。
    6. 製造元の指示に従ってチャンバースライドからチャンバを削除します。
    7. マウントは、DAPIを含むメディアをマウント（4'6ジアミジノ-2-フェニルと摺動インドール、ジラクテート）と22ミリメートル×50 mmのカバースリップ。
  11. 位相コントラストおよび蛍光顕微鏡を用いてスライドを調べます。ウェルチャンバー100のPVの最小値を調べることにより、空胞あたりの寄生虫の平均数を決定します。スクリーンのためのIFN-γ及びLPSの選択された投与量は、野生型原虫（ 図1参照）の複製を抑制するのに十分である必要があるが、防止できない。

感染マクロファージのフィットネス欠陥に続いて活性化にパラサイト変異体の2の分離

注：ランダムT.のライブラリトキソプラズマ変異体はフォワード遺伝学の画面に必要です。 Tのランダム突然変異誘発トキソプラズマは、化学（JPN / EMS）または挿入突然変異27,28,38により行うことができる。限界希釈法による変異導入、クローン寄生虫に従い、D10培地32,38の200μlの容量で付着HFF細胞を含む96ウェルプレートの個々のクローンを成長させる。これは、顕微鏡によるマクロファージにおける寄生虫のスクリーニングのための96ウェルプレートは、微細なスクリーニングを可能にする光学底部を有していることが重要である。スクリーニングのための位相コントラストおよび蛍光顕微鏡は、96ウェルプレートを染色し、長い作動距離を備えた位相コントラスト4、10、20または40倍対物レンズを有する倒立蛍光顕微鏡を必要とする。 4Xの目的は、全体をよく見てするのに便利ですが、寄生虫の優れた分解能は20倍の対物レンズを用いて達成される。

  1. 転送は、二つに96ウェル組織培養プレート中コンフルエントHFF細胞中で増殖させタキゾイト変異体の50μlをD10培地100μl中のマウス骨髄由来マクロファージ（単離後1~2週間）を含む96ウェルプレートを複製。
    注：各ウェルごとに転送寄生虫の数をカウントすることを避けるために寄生虫の培養物の容量に基​​づいて、寄生虫の96ウェルプレートで初期画面を行います。したがって、2.6で顕微鏡分析はwhethに定性的基づいていますER寄生虫は一般に複製または複製されていません。ステップ3は、マクロファージを感染させるために、野生型または変異寄生虫の等しい番号を使用してチャンバースライド内の変異体の表現型を確認するためのアプローチについて説明します。
    1. 直接各ウェルにすでにD10メディアに寄生虫を追加します。寄生虫複製のための陽性対照として、野生型タキゾイトとの2つのウェルに感染する。
  2. 寄生虫の細胞に侵入し、そのPVを作成するための時間を可能にするために4時間、インキュベーター（37℃、5％CO 2）に感染した細胞を置く。
  3. プレートの内容をダンプすることで1プレートからメディアを取り出します。寄生虫のための殺洗剤を含んだ廃棄盆地にプレート内のメディアをダンプする手首のシングルフリップを使用してください。
    1. メディアのための滅菌流域およびマルチチャンネルピペットを使用して「マクロファージ活性化媒体」100μlのを追加。 Mac用のステップ1から決定された最適LPSの濃度及びIFN-γを使用してくださいrophage活性化媒体。同様に、重複した制御板からメディアを削除し、D10メディア100μlで交換してください。
  4. 追加の24〜30時間のためのインキュベーター（37℃、5％CO 2）に感染した細胞を置きます。
  5. IFAのために96ウェルプレート用の染色プロトコル。
    1. プレート内のメディアを破棄し、PBS中の2.5％ホルムアルデヒド100μlで交換してください。室温で20分間インキュベートする。ホルムアルデヒドとマルチチャンネルピペット用の無菌の流域を使用してください。
    2. プレート内のホルムアルデヒド溶液を捨て、プレートからのホルムアルデヒドをすすぐために100μlのPBSを追加します。
    3. プレート内の溶液を捨て、各ウェルに（0.2％トリトンX-100を含むPBS）透過化緩衝液100μlを追加します。 RTで30分間インキュベートする。
    4. プレート中の溶液を捨て、各ウェルにブロッキング溶液を100μl（10％ヤギ血清を含むPBS）を追加します。 RTで30分間インキュベートする。
    5. P内の溶液を捨て、後半。 50μl/ウェルの蛍光結合抗Tを追加トキソプラズマ抗体が1に希釈：PBS中千+ 1％ヤギ血清。上のロッカー上のプレートカバーで室温で1時間インキュベートする。
      1. 代わりにT.に対する非標識一次抗体を使用する1.10.3.1で説明したように、蛍光標識二次抗体で染色したトキソプラズマ 。
    6. プレート内の抗体溶液を捨て、100μl/ウェルのPBS + 1％ヤギ​​血清と交換します。単独のPBSで2追加のリンスに続いてこのすすぎ3回実行します。各ウェルに200μlのPBSのままにして、乾燥から井戸を防ぐために、96ウェルプレートにカバーを交換。
      注：パラフィルムで包み、前顕微鏡による分析まで4℃で3日間置くことができる上にカバープレート。
  6. 20-40X対物レンズを用いて、倒立蛍光顕微鏡下で細胞を調べます。 ＆NA中で複製変異体を選択＃239;マクロファージプレートVEのが、主に「活性化マクロファージ」の1寄生虫/液胞を超えて複製したり、それが「活性化マクロファージ」のアモルファスまたは劣化表示されない。
    注：空胞あたりの野生型寄生虫の数は理想的にIFN-γおよび使用LPSの投与量に依存するが、ウィルは液胞あたり約4寄生虫です。成長抑制ではなく、活性化の刺激による複製の完全な阻害を反映している数。

欠陥が感染マクロファージの活性化に続いてパラサイト生存または複製のレベルにあるかを判別するために3変異体を評価

  1. 転送は、HFF細胞を含む96ウェルプレート（ウェル全体の内容）からT25sの寄生虫の変異体を選択し、複製を可能にする。
  2. 培養骨髄由来マクロファージO / N D10培地250μlの中で3×10 5細胞/ mlの濃度の8チャンバースライドガラスにおいて。 PAを比較するために1スライドを準備ナイーブマクロファージおよび感染したマクロファージの活性化以下の寄生虫の複製を比較するための追加のスライドでrasite複製。
  3. 収穫タキゾイト寄生虫と血球計数器でカウントされます。 5×10 4 Tを追加よく4時間D10メディアと文化のマクロファージを含むチャンバに寄生虫をトキソプラズマ 。対照として、野生型親の寄生虫を持つつのウェルを含めます。ナイーブマクロファージにおける寄生虫の複製を監視するために、活性化メディアを受信しません同じ寄生虫クローンと同一の複製スライドを接種する。
  4. 複製チャンバースライドの1からD10メディアを破棄し、「活性化メディア」を250μlと交換してください。他の複製室スライドからD10メディアを破棄し、D10メディア250μlのと交換してください。上のチャンバースライドカバーを「活性化」と「ナイーブ」マクロファージスライドの両方をインキュベートadditi 37℃、5％CO 2で角項24〜30時間。
  5. ステップ1で説明したように、完全な室でIFA染色を実行し、修正透過性、およびIFA染色および寄生虫の分析のためのブロックをスライド。
    1. Tに膜結合1（LAMP1）またはリソトラッカーと抗体をリソソームする抗体との共染色細胞感染したマクロファージの活性化はリソソーム（図4）との突然変異体のPVの融合を引き起こしているかどうかを評価するためのトキソプラズマ 。
    2. 初期のマクロファージ活性化28以下明らかである寄生虫の変異体の変化を識別するために、IFAによる染色のための寄生虫/ PV内の特定の区画/オルガネラに対する抗体を使用してください。
      注：このような変化は、マクロファージ活性化に続いて、変異体の欠損生存/複製の根底にあるメカニズムへの洞察を提供することができる。
  6. 100X相油目的と蛍光顕微鏡を用いてスライドを調べます。
    1. 決定することにより、寄生虫の複製を評価100ランダム液胞におけるPVあたりの寄生虫の数。統計分析のために100液胞それぞれの少なくとも2カウントを実行します。
    2. 蛍光分析ならびに位相差顕微鏡の両方を用いた一般的な寄生虫の形態を評価する。相100X客観下に表示寄生虫。健康的な寄生虫は寄生虫がしっかりとぴったり寄生虫液胞内に封入されています。相密なリムやアモルファス寄生虫を有するアモルファス広々とした空胞を持っている寄生虫は寄生虫の死ではなく、複製中だけの欠陥（図1、図3）を提案する。

4.感染マクロファージの活性化に変異寄生虫の感受性が公知の抗微生物メディエーターに関連付けられているかどうかを評価

  1. 野生型C57 / BL6マウスからの骨髄由来マクロファージを分離し、iNOSの- / - 、gp91-phoxの- / -またはIrgm1 / Irgm3 - / -マウス32。
  2. 文化それぞれの骨髄由来のMACrophages O / D10培地250μlの中で3×10 5細胞/ mlの濃度の8チャンバースライドガラスにおいてN。
  3. ステップ3で説明したように寄生虫のチャレンジ、IFA染色、および分析を進めてください。
  4. 生き残るためには、感染したマクロファージの活性化を下記複製する突然変異体の寄生虫の能力はGTPアーゼ28関連活性酸素や窒素種または特異的免疫のない状態で復元されたかどうかを確認します。
  5. 特定の抗菌性メディエーターは、彼らが唯一のマクロファージの活性化28の他のメディエーターと協調して行動した場合HFF細胞またはナイーブマクロファージにおける変異体の寄生虫を損なうかに自分自身では十分であるかどうかを評価するために、そのような酸化窒素供与体としての薬理学的薬剤を使用します。

5.ミュータントパラサイト妥協慢性感染症の欠陥かどうかを評価します

  1. T25s共同で成長させた野生型、変異体または標的遺伝子削除された寄生虫からタキゾイトを隔離HFF細胞をntaining。寄生虫は、新たにHFF培養物から溶解しなければならない。
  2. 血球計数器を用いて寄生虫を数える。腹腔内（IP）注射により200μlの配信寄生虫のサブ致死量mlの適切なあたり濃度のハンクス平衡塩溶液（HBSS）に再懸濁寄生虫。
  3. 200μlのボリュームを腹腔内（IP）との寄生虫を注入する1ミリリットルのツベルクリン注射器と25 G針を使用してください。投与量は、寄生虫の野生型株およびマウスの遺伝子型に依存します。
    注：寄生虫のタイプIの遺伝子型に関係なく、寄生虫線量の感染の急性期の間、マウスに致死的であるとT.のための化学療法の非存在下での慢性感染症の研究のために適切ではありませんトキソプラズマは、寄生虫の複製を抑制することができる。
  4. 三十日寄生虫チャレンジ後、標準サイズのマウスケージは超えない5メートルを含むことができる（混雑していないチャンバー内で加圧タンクからのCO 2の吸入によりマウスを犠牲に氷）頸椎脱臼が続く。
  5. 確立された手順41-43を用いてマウスから脳を分離します。
    1. その前面側にマウスを置きます。領域を滅菌するために70％エタノールでスプレーヘッド。
    2. 脳幹を切断するために、鋭いハサミを使用してください。その後浅い右の周りに横方向にカットし、脳幹のベースから始まる頭蓋骨の左側を作るために解剖ハサミを使用してください。優しく脳を露出するために頭蓋骨をバック剥離する鉗子を使用してください。
    3. 静かに脳を解放するために嗅覚神経を切断するために頭蓋骨の脳とベースとの間脳と場所ハサミを持ち上げる。滅菌ピンセットまたは滅菌PBSの10ミリリットルを含む細菌学ペトリプレートのヘラと場所との脳を持ち上げます。
  6. 右と左半球間の中心を通って滅菌メスで半分に脳をカット。
  7. 1mlのPBSを含む小さな乳鉢に脳の半分を追加します。に乳鉢と乳棒を使用してください広い口径20〜200μlのピペットチップを通過することができる脳の細かい組織懸濁液を作る。
    注：組織切片を組織病理のために必要とされる場合、脳の他の半分は、1時間、2.5％ホルムアルデヒドで固定しなければならない。
  8. 1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブに脳溶解物の100μlのを置きます。染色のために、脳のサスペンションを修正するための脳溶解物を含むチューブにPBS中の2.5％ホルムアルデヒドの1ミリリットルを追加します。室温で30分間インキュベートする。
  9. マイクロ遠心中で5分間8000×gで、溶解物を遠心し、慎重に上清を捨てる。
  10. 溶解液（10％ヤギ血清、PBS中の0.2％トリトンX-100）に透過化/ブロッキング緩衝液の1ミリリットルを追加。室温で30分間インキュベートする。
  11. 5分間8000×gで遠心し溶解物および上清を除去。
  12. FITC結合ドリコスbiflorus agglutin（DBA）の200μlのを追加します。 PBS中レクチン+ 10％ヤギ血清の1：100希釈を使用してください。静かにピペッティングにより溶解液を懸濁します。インキュベートRTで1時間。
    注：DBAは寄生虫の嚢胞壁にCST1に結合するリガンドである。
  13. 5分間8000×gで遠心し溶解物および上清を捨てる。ペレットに1mlのPBSを追加します。室温で5分間インキュベートする。 PBS洗浄3回繰り返します。ピペットを用いて最終洗浄後の上清を取り除きます。
  14. 顕微鏡スライド上に染色された脳の溶解物および場所の5μLを策定する広い口径20〜200μlのピペットチップを使用してください。脳溶解物の湿ったマウントを作成するために25×25mmのカバースリップでスライドをマウントします。脳溶解物5μlの各々を用いて3複製スライドを作成します。
  15. 10倍の対物レンズ（図6）を使用して、蛍光顕微鏡で各5μlのアリコート当たり嚢胞の数を数えます。
    注：いくつかは（嚢胞あたり1-2寄生虫）非常に小さいながら、いくつかの嚢胞は（8個以上の寄生虫約）大きい。小嚢胞の数に対する大の各スライドが、文書番号あたりの嚢胞の合計数をカウントします。
  16. 嚢胞DETの数を追加します。脳あたりの総嚢胞の数を推定するために（脳の半分のみが溶解液にした）三つの異なる5μlのアリコートで精製カートリッジ及びx 2、総希釈率を掛けます。

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結果

トキソプラズマはナイーブマクロファージ内で自由に複製し、寄生虫の株に依存6-12時間の間の倍加時間を持っています。 図1活性化した骨髄由来マクロファージに対してナイーブで代表的な寄生虫を示している。 図2は、HFFで寄生虫の一般的な形態を示す/ PV 2、4、8、16、32寄生虫で宿主細胞。現在のプロトコルでは、寄生虫はナイーブマクロファージに侵入し...

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ディスカッション

記載されたプロトコルは、Tを分離するために、マウス骨髄由来マクロファージおよびフォワード遺伝学の活性化を使用して偏りのないアプローチを提供彼らの能力の欠陥とトキソプラズマ変異体は、感染したマクロファージの活性化を生き残るために。マクロファージ活性化に続いて突然変異体の表現型は、一般的に2つのカテゴリのいずれかに分類されます。1）寄生虫はその?...

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開示事項

The authors have no competing financial interests.

謝辞

Special thanks to Dr. Peter Bradley for the antibody to detect the T. gondii mitochondria. The work was supported by National Institute of Health Grants AI072028 and AI107431 to D.G.M and a generous donation to New York Medical College for the study of tropical medicine.

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