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Zusammenfassung

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Zusammenfassung

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in naïve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Einleitung

Toxoplasma gondii (T. gondii) ist ein obligat intrazelluläre, Protozoen-Erreger. Es ist der Erreger der Toxoplasmose, ein Gesundheitsrisiko bei immungeschwächten Individuen. Es ist auch das Modellsystem für andere apicomplexan Krankheitserreger, die Menschen, einschließlich Cryptosporidium und Cyclospora infizieren. Toxoplasmose ist am häufigsten durch den Verzehr von Nahrung oder Wasser mit dem bradyzoite oder Oozysten Stadium des Parasiten verunreinigt erworben. Nach der Einnahme konvertieren diese Stufen auf die Tachyzoiten Stadium des Parasiten, die in Wirtszellen repliziert und verbreitet systemisch. T-Zellen, IFN-γ und, in geringerem Maße, Stickstoffmonoxid 1-4, sind wichtig für die Kontrolle der Infektion jedoch nicht zur Eliminierung der Erkrankung, als Anteil der Tachyzoiten umwandeln zum bradyzoite Stufe, die innerhalb Gewebezysten geschützt was zu einem langlebigen chronischen Infektion. In der Tat gibt es keine wirksame Therapie gegen die chronische Zyste sTage der Erkrankung. Schwere Toxoplasmose ist meist durch die Reaktivierung der persistierenden Infektion mit dem bradyzoite Stadium des Parasiten Konvertierung zurück in die schnell zu replizieren Tachyzoiten Phase charakteristisch für primäre und akute Infektion.

Frühe Überleben angesichts der angeborenen Immunantwort ist wichtig, damit der Parasit, genügend Parasitenzahlen zu erreichen, sowie distalen Stellen zu erreichen, für die Niederlassung einer chronischen Infektion zu ermöglichen. T. gondii hat Strategien zur Wirtsabwehrmechanismen, die wahrscheinlich ihre Fähigkeit zu replizieren und Verbreitung der Infektion früh beitragen entgegenzuwirken entwickelt. Zuerst T. gondii bildet eine einzigartige PV bei Parasitenbefall weitgehend getrennt von den endozytischen und Exozytose-Prozesse der Wirtszelle im Vergleich zu anderen intrazellulären Pathogenen 5-9 ist. Auch, wie alle erfolgreichen intrazelluläre Erreger T. gondii modifiziert seine Wirtszelle, um einen permissiven Umgebung f erstellenoder Wachstum. Dies beinhaltet eine Anpassung Wirtszelle Genexpression durch Veränderung Wirtszelle Transkriptionsfaktoren einschließlich der wichtig für die Regulierung Zellaktivierung 10-15. ROP16 16-19 GRA15 20. GRA16 21 und GRA24 22 erwiesen sich alle als bei der Regulierung der Transkriptionsreaktion und Zellsignalkaskaden von Wirtszellen mit T. infiziert wichtig gondii. Jüngste Studien mit genetischen Kreuzungen zwischen Parasitenstämme mit unterschiedlichen Phänotypen sehr produktiv bei der Identifizierung von Genen, die Parasiten Parasiten Genotyp-abhängigen Eigenschaften einschließlich Umgehung der Immunität GTPasen (IRGs) 16,19,23-26 zugrunde liegen gewesen. In Mäusen sind Immunität GTPasen (IRGs) kritisch für die Steuerung der Typ II und III Genotypen des Parasiten während der sehr virulenten Typ I Genotypen Mechanismen entwickelt, um die murinen IRGs entziehen. Es ist aber auch klar, dass der Parasit hat Mechanismen entwickelt, um antimikrobielle Medien umgehenren neben den IRGs und dass einige dieser Mechanismen können für Parasiten Genotypen 27,28 konserviert werden. Zudem ist sehr wenig über den kritischen Mediatoren der Zell autonome Immunität gegen T. bekannt gondii während menschliche Toxoplasmose. Parasite Gene wichtig für die Resistenz gegen Vermittler von Zell autonome Immunität kann auch überlebenswichtig sein, während Tachyzoiten Umwandlung, die auch von Wirtsimmunreaktionen ausgelöst werden können, um bradyzoite. So kann beispielsweise Stickstoffmonoxid auf hohem Niveau Parasitenreplikation in infizierten Makrophagen unterdrücken, aber es kann auch dazu anregen Tachyzoiten zu Umrechnung in Zyste Produktion 30-32 bradyzoite.

ToxoDB ist eine funktionelle Genomdatenbank für T. gondii, der als wichtige Ressource für das Feld in Bezug auf die Bereitstellung Sequenzinformation für die Parasitengenom und den Zugang zu veröffentlichten und nicht veröffentlichten genomischen Maßstab Daten einschließlich Community Anmerkungen Gen exp ression und Proteomik-Daten 33. Ähnlich wie bei vielen Protozoen- Pathogene, der Großteil des Genoms besteht aus hypothetischen Gene ohne von Informationen aus Genhomologie Einblick in ihre möglichen Funktionen bereitzustellen. So ist nach vorn Genetik ein leistungsfähiges Werkzeug, um neue Parasiten Gene wichtig für Immunevasion, Zyste Umwandlung und andere Funktionen entscheidend für Parasiten Pathogenese als auch für die Konvertierung zwischen verschiedenen Entwicklungsstadien zu identifizieren. Eine weitere Stärke der Vorwärtsgenetik ist, dass es als ein relativ nicht-vorgespannten Ansatz verwendet, um den Parasit zu den Genen, die für spezifische Aufgaben in Pathogenese, einschließlich Immunumgehung und Zystenbildung sind abzufragen. Die jüngsten Verbesserungen in Next Generation Sequencing für Mutationsprofiling haben sie eine Methode der Wahl für die Identifizierung der verantwortlichen Parasiten Gene von vorn Genetik Studien unter Verwendung von chemischen und Insertionsmutagenese 34-37 hergestellt.

ntent "> Es ist wichtig, um Schwachstellen in T. gondii, die ausgenutzt werden, um die Wirksamkeit der Zell autonomen Immunmechanismen gegen den Parasiten insbesondere solche, die auch gegen die resistenten Zyste Bühne aktiv sein können. Um dieses Ziel zu, ein in vitro-Mäuse zu verbessern identifizieren Makrophageninfektion und Aktivierungsmodell wurde entwickelt, um Mutationen in die Parasiten, insbesondere T. gondii Fitness nach Aktivierung der infizierten Makrophagen, aber nicht in naiven Makrophagen limitieren. Dieses Makrophagen Bildschirm verwendet, um eine Bibliothek von T. gondii Insertionsmutanten um abzufragen letztendlich identifizieren T. gondii wichtige Gene für die Resistenz gegen Stickoxid 27,28. Die Isolierung von einem Panel von T. gondii-Mutanten mit verminderter Widerstandsfähigkeit gegenüber der Aktivierung der infizierten Makrophagen, insbesondere eine ausgeprägte Empfindlichkeit gegenüber Stickstoffmonoxid, erwies sich die Nützlichkeit des Screening zur Identifizierung Parasiten Gene wichtig für WiderstandMediatoren der Zell autonome Immunität mit Ausnahme der für die murine IRGs 28 beschriebenen Resistenzmechanismen. Insertionsmutagenese hat Vorteile gegenüber chemischen Mutagenese im Hinblick auf die Erzeugung einer begrenzten Anzahl von zufälligen Mutationen in jeder Parasit Klons und theoretisch eine leichtere Identifizierung der Mutationsstelle. Die Identifizierung der Genom-Stelle des Plasmids Insertion in T. gondii Insertionsmutanten in der Praxis hat sich überraschend schwierig, in vielen Fällen 37. Einführen eines Plasmids in einem Gen ist auch geeignet, die Funktion eines Gens, das im Gegensatz zur chemischen Mutagenese, die typischerweise zu einzelnen Nucleotidänderungen stören. Die chemische Mutagenese mit entweder N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff (ENU) oder Ethylmethansulfonat (EMS) zu einer erhöhten Fähigkeit, einen größeren Teil des Parasitengenoms zu analysieren bieten, im Vergleich zu Insertionsmutagenese, da sie mehrfache Punktmutationen erzeugt ( geschätzt bei 10 -100) pro Mutante 34, 38. Außerdem jüngsten Fortschritte in der gesamten Genoms Profilierung hat es möglich gemacht, um der nächsten Generation Sequenzierung verwenden, um die wahrscheinlichsten Kandidaten-Gene für die identifizierte Phänotyp eines mutierten Parasiten 34,38 verantwortlich sind. Unabhängig von der Mutagenese-Ansatz, Bestätigung der Rolle von dem Parasiten Gen der Resistenz gegen Makrophagenaktivierung erfordert letztendlich Gendeletion und Komplementation zu molekularer Koch-Postulate zu erfüllen.

Die Fähigkeit, die Funktion eines Gens durch genetische Manipulation sowohl des Parasiten und dem Makrophagen zergliedern ist wichtig, da viele der über Vorwärts Genetik in T. identifizierten Gene gondii, wie auch andere Krankheitserreger, werden noch als hypothetische Gene mit wenig bis keine Sequenzhomologie zu anderen Proteinen mit bekannter Funktion aufweist. Die aktuelle Papier einen allgemeinen Ansatz, der verwendet werden kann, um zu ermitteln, ob die unterbrochene Gen in einer Mutante ist wichtig für den Widerstand gegen eine bekannte oder umreißtunbekannt Vermittler von Zell autonome Immunität. Die erste Analyse der Host antimikrobielle Faktoren wird durch die Auswertung der Überlebensrate von Wildtyp und Mutante Parasiten in Makrophagen, die von Wildtyp-Mäusen im Vergleich zu denen mit spezifischen Gendeletionen in induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), gp-91 phox (NADPH-Oxidase) durchgeführt wird, und spezifische Immunität GTPasen (IRGs). Damit wird festgelegt, ob die identifizierten Parasiten Gene sind wichtig für die Resistenz gegen Stickstoffmonoxid, reaktive Sauerstoffzwischenprodukte oder Immunität GTPasen bzw. 28 oder wenn ein unbekannter Immunsystems beteiligt ist. Aktivierung der infizierten Makrophagen sowohl IFN-γ und LPS in der aktuellen Protokoll beschrieben, resultiert in erster Linie bei der Isolierung von Parasitengene wichtig für die Resistenz gegen Stickstoffoxid 28. Die Verwendung von pharmakologischen Mitteln, die Stickstoffmonoxid in Abwesenheit von Makrophagen-Aktivierung zu induzieren (Stickoxiddonoren) bestätigte, dass die Mehrheit der identifizierten Gene, die für Wieder warenWiderstand gegen Stickstoffmonoxid anstatt Stickoxid zusammen mit weiteren Mediatoren mit Makrophagenaktivierung 28 verbunden.

Schritt eins und zwei beschreiben eine Vorwärtsgenetik Bildschirm entworfen, um Parasiten Mutanten mit einem Fitness-Defekt nach der Aktivierung von infizierten Knochenmark-Makrophagen in vitro zu isolieren. Schritt eins beschreibt eine Dosistitration Analyse empirisch bestimmen eine Dosis von IFN-γ und LPS für Makrophagenaktivierung, die Parasiten Replikation reduziert, aber nicht vollständig hemmen die Replikation von Wildtyp T. verwenden gondii Elternstamm, die für die Erstellung der Bibliothek des Parasiten Mutanten verwendet wird. Schritt zwei wird die Vorwärts genetischen Screening der Mutanten-Klone in Makrophagen in 96-Well-Platten. Schritt drei beschreibt einen Ansatz, um den Phänotyp jeder Mutante in dem Bildschirm der 96-Well-Platten identifiziert und zu bewerten, ob der Fehler in jeder Mutante wirkt das Überleben der Parasiten, die Replikation zu bestätigen,oder Zysten Produktion als Antwort auf die Makrophagenaktivierung. Schritt vier wird die Verwendung von Knochenmark-Makrophagen von Mäusen mit Deletionen in spezifischen antimikrobiellen Wege um die Immunmediatoren, auf die der Parasit Mutante spezifisch empfindlich identifizieren. Schritt fünf beschreibt einen Ansatz, um zu bestimmen, ob ein Parasit Mutante ist auch für in vivo Pathogenese beeinträchtigt, wie durch Zystenproduktion in den Gehirnen von infizierten Mäusen ausgewertet.

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Protokoll

HINWEIS: Alle Protokolle, die die Verwendung von Tieren beteiligt wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der New York Medical College der Animal Care und Verwenden Ausschuss durchgeführt.
HINWEIS: Detaillierte Protokolle für die chemische Mutagenese 38, Isolierung von Parasiten durch Grenzverdünnung 38, Isolierung von murinen Knochenmark-Makrophagen 39, das Wachstum von T. gondii in humanen Vorhaut-Fibroblasten (HFF) Zellen und Zysten in Makrophagen und grundlegende Immunfluoreszenzanalyse (IFA) 32 verwiesen. Führen Sie alle Zellkultur bei 37 ° C in 5% CO 2 in D10 Medien (Dulbecco modifiziertem Hoch Glucose Eagle-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin) . Bewahren Sie alle Reagenzien im gesamten Zellisolierungen und Zellkultur steril.

1. Dosistitration von IFN-γ und LPS die Konzentr Bestimmentionen zu verwenden, um infizierten Makrophagen für die Zukunfts Genetics Bildschirm aktivieren

  1. Kultur murinen Knochenmark-abgeleitete Makrophagen O / N in acht Kammerobjektträgern mit einer Konzentration von 3 × 10 5 Zellen / ml in 250 & mgr; l D10 Medium pro Kammer. Verwenden Makrophagen 1-2-Wochen nach der Isolierung aus dem Knochenmark.
    HINWEIS: Kammerobjektträger gekauft, die eine wachstumsfördernde RS waschen müssen.
  2. Verwenden Sie ein Hämozytometer zum Wildtyp-Parasiten von humanen Vorhaut-Fibroblasten (HFF) Zellen in einer T25-Zellkulturflasche gewachsen geerntet zählen. Resuspendieren Parasiten in einer Konzentration von 5 × 10 5 Wildtyp-Parasiten pro ml in D10 Medien. Diese Konzentration wird in einer Infektionsmultiplizität von etwa 1: 1 ergeben, wie die Makrophagen werden O / N vermehrt haben. Verwenden Sie Polystyrol oder PET Rohre für alle Manipulationen mit Parasiten, wie die Parasiten klebt an Polypropylen.
  3. Nehmen Sie die D10 Medien in den Kammer-Objektträgern und ersetzen mit 250 ul derAussetzung der Wildtyp-Parasiten. Fügen Sie vorsichtig die Parasitensuspension in jede Kammer des Schiebers, indem man es fließen die Innenfläche der jeweiligen Kammer. Erlauben keine Makrophagen an irgendeinem Punkt während der Protokoll austrocknen.
  4. Abdeckung Kammer-Objektträgern mit Parasiten mit der Kammer Schiebeabdeckung und bei 37 ° C für 4 h infiziert in einem Inkubator in 5% CO 2, um Zeit für die Parasiten, um einzudringen und stellen Sie eine PV ermöglichen.
  5. Die Verdünnungen von LPS und IFN-γ in 1 ml D10 Medium in sterilen Röhrchen für die Dosisanpassung. Für die eine Dosisanpassung zu halten entweder LPS oder IFN-Konzentration konstant und variiert die anderen Stimulus 40.
    1. Zum Beispiel halten LPS konstant bei 10 ng LPS pro ml und variiert die Konzentration von IFN-γ (0, 1 Einheit / ml, 10 Einheiten / ml, 100 Einheiten / ml, 1.000 Einheiten / ml). Halten IFN γ bei 100 Einheiten / ml konstant und variiert die Konzentration von LPS (0, 0,1 ng / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml). Kurz beschallen LPS Lager für 2 Minuten ohneHeizung in einem Ultraschallbad (nicht mit einer Spitze Ultraschallgerät) vor der Verdünnung.
      HINWEIS: Die Ultraschallbehandlung wird empfohlen, Micellaggregate von LPS zu binden, die nicht korrekt an Wirtszellen gebildet stören.
  6. 4 Stunden nach Beginn der Ko-Kultur zwischen den Parasiten und adhärenten Makrophagen in der Kammer Rutsche, entsorgen Sie die D10 Medien in jeder Kammer und ersetzen Sie es mit 300 ul der geeigneten Verdünnungen von IFN-γ und LPS in D10 Medien. Umfassen eine Steuerung mit nur D10 Medien Parasiten Replikation in Abwesenheit von Makrophagen-Aktivierung zu bewerten.
  7. Re-Abdeckkammer gleitet mit der Kammer Gleitabdeckung und in einen Inkubator bei 37 ° C in 5% CO 2 für 24 bis 30 weitere Stunden.
    Hinweis: Die Inkubationszeit hängt von der Verdopplungszeit des Wildtyp-Parasit-Stamm, der 6 bis 12 h in Abhängigkeit von der Parasitenstamm reichen kann. Ein Zeitpunkt wird so gewählt, vor der Lyse von naiven Makrophagen parasite aber lang genug, um mindestens 3-4 Dou Freigabebling Zeiten.
  8. Einen 2,5% igen Formaldehydlösung in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Entsorgen Sie die Medien in der Kammer Rutsche und ersetzen mit 300 ul 2,5% Formaldehyd-Lösung. Fix für 20 min bei RT.
  9. Rinse Schieber (n) zweimal mit je 300 ul PBS pro Kammer. Für jeden Spül-, entsorgen Sie die PBS in der Folie und neue PBS sanft die Innenseite jeder Folie Kammer, um eine Störung der Makrophagen auf den Objektträger geklebt. Fügen Sie 300 ul PBS pro Kammer und Ort Abdeckung auf Kammer Folie, um Folien aus vor dem Austrocknen zu verhindern Färbung.
    HINWEIS: Folien können bei 4 ° C für bis zu 3 Tage an dieser Stelle vor der Färbung platziert werden.
  10. Färbeprotokoll für T. gondii Erkennung durch Immunfluoreszenz (IFA).
    1. Machen Sie eine 0,2% Triton X-100-Lösung in PBS (Permeabilisierung Puffer). Platzieren der Lösung in einem Rohr in einem 37 ° C Wasserbad und Vortexen, um sicherzustellen, das Triton X-100 in Lösung geht. Entsorgen Sie diePBS in den Kammer-Objektträgern und ersetzen mit 300 ul der Permeabilisierung Puffer. Verlassen bei RT für 30 min.
    2. Einen Lösung von 10% Ziegenserum in PBS (Blocklösung). Entsorgen Sie die Permeabilisierung Puffer in der Folie und ersetzen mit 300 ul Blockierungslösung pro Kammer. Verlassen bei RT für 30 min.
      HINWEIS: Fetales Kälberserum für Ziegenserum in allen Färbeprotokollen ersetzt werden.
    3. Für eine noch einen Schritt IFA Färbeprotokoll, machen Sie eine 1: 1000 Verdünnung eines Fluoreszenz-konjugierte Antikörper gegen T. gondii in Blockierungslösung. Entfernen Blockierungslösung von Folie und fügen Sie 150 ul Antikörperlösung pro Kammer. Bringen Sie die Abdeckung gleiten auf Kammer Folie, um Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern. Inkubieren für 1 h bei RT.
      HINWEIS: Antikörper-Konzentration muß empirisch je nach der Quelle bestimmt werden. Antikörper erworben wird direkt an ein Fluorochrom konjugiert sind oder an ein Fluorochrom vom Benutzer konjugiert.
      1. Für einen zweistufigen IFA FärbungProtokoll mit einem unkonjugierten Antikörper gegen T. gondii und eine fluoreszenz konjugierten Sekundärantikörper, Fleckenträger mit 150 ul unkonjugierten primären Antikörper gegen T. gondii in Blockierungspuffer für 1 Stunde bei RT. Spülen Sie 3x mit 300 ul PBS plus 1% Ziegenserum (Waschpuffer).
      2. Jeweils 150 ul fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörper, der spezifisch für die Ursprungsspezies für den primären Antikörper. Bringen Sie die Abdeckung gleiten auf Kammer Folie, um Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern. Inkubieren für 1 h bei RT.
    4. Rinse Folien 3x mit PBS plus 1% Ziegenserum (Waschpuffer). Für jede Spülen, entfernen Sie die Lösung in den Kammer-Objektträgern durch das Einbringen ihrer Inhalte und ersetzen mit 300 ul Waschpuffer.
    5. Rinse gleitet 2x mit 300 ul PBS.
    6. Entfernen Sie die Kammer aus der Kammer Folie als den Anweisungen des Herstellers.
    7. Berg rutscht mit Montage Medien mit DAPI (4'6-Diamidino-2-Phenyl-Indol, dilactate) und einem 22 mm x 50 mm Deckglas.
  11. Untersuchen Sie Folien mit Phasenkontrast und Fluoreszenz-Mikroskopie. Bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl der Parasiten pro Vakuole durch die Untersuchung von mindestens 100 PV pro Kammer gut. Die gewählte Dosis von IFN-γ und LPS für den Bildschirm muss ausreichen, um zu unterdrücken, aber nicht verhindern, dass die Replikation von Wildtyp-Parasiten (siehe Abbildung 1).

2. Isolierung von Parasite Mutanten mit Fitness Defect Nach Aktivierung von infizierten Makrophagen

HINWEIS: Eine Bibliothek von Zufalls T. gondii Mutanten wird für die Vorwärtsgenetik Bildschirm erforderlich. Zufallsmutagenese T. gondii kann durch chemische (DEU / EMS) oder Insertionsmutagenese 27,28,38 durchgeführt werden. Nach der Mutagenese Klon Parasiten durch Grenzverdünnung und wachsen einzelnen Klonen in 96-Well-Platten, die anhaftende HFF-Zellen in einem Volumen von 200 ul der Medien D10 32,38.Entscheidend ist, dass Platten mit 96 Vertiefungen für ein Screening von Parasiten in den Makrophagen durch Mikroskopie weisen optische Sumpf mikroskopische Screening zu ermöglichen. Phasenkontrast und Fluoreszenzmikroskopie zum Screening gefärbten 96-Well-Platten erfordert ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop mit Phasenkontrast-4, 10, 20 oder 40-fach Objektiv für große Arbeitsabstände ausgestattet. Eine 4X Ziel ist nützlich, wenn Sie die gesamte gut, aber eine bessere Auflösung der Parasiten mit dem 20X Ziel erreicht.

  1. Dann werden 50 & mgr; l in konfluenten HFF-Zellen in zwei gewachsen in 96-Well-Gewebekulturplatten Tachyzoiten Mutanten replizieren 96-Well-Platten, die Maus-Knochenmark stammenden Makrophagen (1-2 Wochen nach der Trennung) in 100 & mgr; l D10 Medien.
    HINWEIS: Führen Sie das Einstiegsbild in 96-Well-Platten des Parasiten auf das Volumen der Parasit Kultur zu vermeiden, dass die Anzahl der Parasiten pro jeweils übertragen und zu zählen. So wird die Mikroskopie Analyse in 2,6 qualitativ auf der Basis whether Parasiten im Allgemeinen repliziert oder nicht repliziert. Schritt 3 beschreibt die Vorgehensweise, um den Phänotyp der Mutanten in Kammer-Objektträgern bestätigen Sie mit einer gleichen Anzahl von Wildtyp oder Mutante Parasiten, die Makrophagen zu infizieren.
    1. Direkt Parasiten auf die D10 Medien hinzufügen, die bereits in jedem Well. Infect zwei Brunnen mit Wildtyp-Tachyzoiten als positive Kontrolle für Parasiten-Replikation.
  2. Platzieren Sie die infizierten Zellen in einen Inkubator (37 ° C und 5% CO 2) für 4 h auf Parasiten erlauben Zeit, um die Zellen eindringen und erzeugen ihre PV.
  3. Entfernen Sie das Medium von einer Platte durch das Einbringen der Inhalt der Platte. Verwenden Sie eine einzige Wink mit dem Handgelenk, um die Medien in der Platte in eine Ablagebecken, das eine Reinigungs abtötende für die Parasiten zu entleeren.
    1. 100 l "Makrophagenaktivierung Medien" mit einem sterilen Becken für die Medien und einer Mehrkanalpipette. Verwenden Sie die optimale Konzentration von LPS und IFN-γ aus Schritt 1 für den mac bestimmtrophage Aktivierung Medien. Ebenso entfernen Medien aus der doppelten Steuerplatte und ersetzen mit 100 ul D10 Medien.
  4. Platzieren Sie die infizierten Zellen in einen Inkubator (37 ° C und 5% CO 2) für eine weitere 24-30 Std.
  5. Färbeprotokoll für 96-Well-Platten für die IFA.
    1. Entsorgen Sie die Medien in der Platte und ersetzen mit 100 ul 2,5% Formaldehyd in PBS. Inkubieren für 20 min bei RT. Verwenden Sie eine sterile Becken für die Formaldehyd und einer Mehrkanalpipette.
    2. Entsorgen Sie die Formaldehyd-Lösung in der Platte und fügen Sie 100 ul PBS, das Formaldehyd aus dem Teller zu spülen.
    3. Entsorgen Sie die Lösung in der Platte und fügen Sie 100 ul der Permeabilisierung Puffer (PBS mit 0,2% Triton X-100) in jede Kavität. Inkubieren für 30 min bei RT.
    4. Entsorgen Sie die Lösung in der Platte und fügen Sie 100 ul Blockierungslösung (PBS mit 10% Ziegenserum) in jede Kavität. Inkubieren für 30 min bei RT.
    5. Entsorgen Sie die Lösung in der pspät. Dann werden 50 ul / Vertiefung einer fluoreszenz konjugierten Anti- T. gondii Antikörper verdünnt 1: 1000 in PBS plus 1% Ziegenserum. Inkubieren für 1 h bei RT mit der Blechabdeckung auf und auf einer Wippe.
      1. Alternativ verwenden Sie eine nicht konjugierte primäre Antikörper gegen T. gondii, gefolgt durch Färbung mit einem fluoreszent-konjugiertem sekundärem Antikörper wie in 1.10.3.1 beschrieben.
    6. Entsorgen Sie die Antikörperlösung in der Platte und ersetzen mit 100 ul / Vertiefung PBS plus 1% Ziegenserum. Führen Sie diese Spülung 3x gefolgt von 2 zusätzlichen Spülungen mit PBS alleine. Lassen Sie 200 ul PBS in jede Vertiefung und setzen Sie die Abdeckung auf der Platte mit 96 Vertiefungen, um die Wells nicht austrocknen.
      HINWEIS: Die Platte mit der Abdeckung kann in Parafilm eingewickelt und bei 4 ° C für bis zu 3 Tage vor der Analyse durch Mikroskopie platziert werden.
  6. Untersuchen Zellen unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines 20-40X Ziel. Wählen Sie die Mutanten, die in den na und replizieren# 239; ve Makrophagen Platte aber überwiegend nicht in "aktivierte Makrophagen", über ein Parasit / Vakuole zu replizieren oder die amorphe oder in "aktivierte Makrophagen" abgebaut angezeigt.
    HINWEIS: Die Anzahl der Wildtyp-Parasiten pro Vakuole werden von der Dosis von IFN-γ und LPS abhängen, sondern im Idealfall etwa 4 Parasiten pro Vakuole; eine Zahl, die Unterdrückung des Wachstums, aber nicht vollständige Hemmung der Replikation von dem Aktivierungsstimulus widerspiegelt.

3. Werten Sie die Mutanten zu ermitteln, wenn der Mangel auf der Ebene der das Überleben der Parasiten oder Replication Nach Aktivierung von infizierten Makrophagen

  1. Selektierte Parasiten Mutanten von 96-Well-Platten (Inhalt der gesamten gut) bis T25s, die HFF-Zellen und ermöglicht die Replikation.
  2. Kultur Knochenmarkmakrophagen O / N bei 8 Kammerobjektträgern mit einer Konzentration von 3 × 10 5 Zellen / ml in 250 & mgr; l D10 Medien. Vorbereiten einer Folie zur pa vergleichenrasite Replikation in naiv Makrophagen und eine zusätzliche Folie, um Parasiten Replikation nach der Aktivierung von infizierten Makrophagen zu vergleichen.
  3. Ernte Tachyzoiten Parasiten und zählen in einem Hämocytometer. Fügen Sie 5 x 10 4 T. gondii Parasiten zu einer Kammer, die auch Makrophagen in D10 Medien und Kultur 4 Stunden. Fügen Sie einen gut mit Wildtyp-Eltern Parasiten als Kontrolle. Impfen Sie eine identische Replikation Schlitten mit der gleichen Parasiten Klon, der nicht Aktivierung Medien, um die Replikation des Parasiten in Makrophagen naiv überwachen erhalten soll.
  4. Entsorgen D10 Medien aus 1 der Wiederholungskammer gleitet und ersetzen mit 250 ul "Aktivierungsmittel". Entsorgen D10 Medien von der anderen Wiederholungskammer Rutsche und ersetzen mit 250 ul D10 Medien. Inkubieren sowohl die "aktivierte" oder "naiven" Makrophagen-Schlitten mit der Kammer Schieber auf bei 37 ° C und 5% CO 2 für eine zusätzonal 24-30 h.
  5. Fix, permeabilisiert, und Block Folien für IFA Färbung und Analyse von Parasiten, wie in Schritt 1 beschrieben, durchführen IFA Färbung mit den Kammern intakt.
    1. Co-Fleck-Zellen mit einem Antikörper gegen Membran-assoziierten 1 (LAMP1) oder Lysotracker und Antikörper gegen T. lysosomalen gondii zu beurteilen, ob die Aktivierung von infizierten Makrophagen auslöst Fusion der Mutante PVs mit Lysosomen (Abbildung 4).
    2. Verwenden Antikörper gegen spezifische Fächer / Organellen innerhalb der Parasit / PV für die Färbung von IFA Änderungen, die dem Parasiten Mutante, die offensichtlich sind früh nach Makrophagenaktivierung 28 zu identifizieren.
      HINWEIS: Solche Veränderungen können Einblick in den Mechanismus, der die Fehlüberlebens / Replikation der mutierten folgenden Makrophagenaktivierung zugrunde bereitzustellen.
  6. Untersuchen Sie Dias mit einem 100X Phasen Öl-Objektiv und Fluoreszenzmikroskopie.
    1. Bewerten Parasiten Replikation durch die Bestimmung derAnzahl der Parasiten pro PV in 100 zufällig Vakuolen. Führen Sie mindestens 2 Grafen von 100 Vakuolen jeweils für die statistische Analyse.
    2. Bewerten allgemeinen Parasiten Morphologie unter Verwendung von sowohl Fluoreszenzanalyse sowie Phasenkontrastmikroskopie. Ansicht Parasiten unter Phasen 100x Objektiv. Gesunde Parasiten Parasiten fest in einem eng anliegenden parasitophoren Vakuole bei. Parasiten, die amorphe Phase mit großen Vakuolen dichten Felgen oder amorphe Parasiten schlagen Parasiten Tod und nicht nur einen Fehler bei der Replikation (Abbildungen 1 und 3).

4. Evaluieren, ob die Anfälligkeit von Mutant Parasiten zu Aktivierung von infizierten Makrophagen wird mit bekannten Antimikrobielle Mediators Assoziierte

  1. Isolieren Knochenmark-Makrophagen aus Wildtyp-C57 / BL6-Mäusen, iNOS - / -, gp91-phox - / - oder Irgm1 / Irgm3 - / - Mäuse 32.
  2. Kultur jeweiligen Knochenmark stamm macrophages O / N bei 8 Kammerobjektträgern mit einer Konzentration von 3 × 10 5 Zellen / ml in 250 & mgr; l D10 Medien.
  3. Fahren Sie mit dem Parasiten Herausforderung, IFA-Färbung und Analyse wie in Schritt 3 beschrieben.
  4. Bestimmen, ob die Fähigkeit der Mutante Parasiten zu überleben und zu replizieren nach Aktivierung der infizierten Makrophagen in Abwesenheit von reaktiven Sauerstoff oder Stickstoffspezies oder spezifische Immunität GTPasen 28 wiederhergestellt.
  5. Verwenden pharmakologischen Mitteln, wie beispielsweise Stickstoffmonoxid-Donatoren, um auszuwerten, ob spezifische antimikrobielle Mediatoren sind ausreichend, um sich um mutierte Parasiten in HFF-Zellen oder Makrophagen naiven beeinträchtigen oder wenn sie in einem Strang nur mit anderen Mediatoren aus Makrophagen-Aktivierung 28.

5. Beurteilen, ob der Defekt in der Mutant Parasite Kompromisse Chronic Infection

  1. Isolieren Tachyzoiten von Wildtyp, Mutante oder gezielte Gen gelöscht Parasiten in T25s Zusammenarbeit gewachsenntaining HFF-Zellen. Parasiten sind frisch aus HFF Kulturen lysiert werden.
  2. Graf Parasiten mit einer Zählkammer. Resuspendieren Parasiten in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) bei einer Konzentration pro ml geeignet für eine subletale Dosis des Parasiten in 200 ul durch intraperitoneale (IP) Injektion verabreicht.
  3. Verwenden einer 1 ml Tuberkulin-Spritze und 25 G Nadel Parasiten mit einem 200 ul Volumen intraperitoneal (IP) injiziert. Die Dosierung hängt von der Wildtyp-Stamm des Parasiten und der Maus-Genotyp.
    HINWEIS: Typ I-Genotypen des Parasiten tödlich an Mäuse während der akuten Phase der Infektion unabhängig von Parasiten Dosis und sind nicht geeignet für die Untersuchung der chronischen Infektion in Abwesenheit von Chemotherapie T. gondii zu Parasiten Replikation unterdrücken.
  4. Dreißig Tage nach Parasiten Herausforderung, opfern Mäuse durch Inhalation von CO 2 aus einem Druckbehälter in einem menschenleeren Kammer (eine Standard-Größe Maus Käfig kann nicht mehr als 5 m enthaltenEis) durch Genickbruch folgte.
  5. Trennen Sie das Gehirn von der Maus mittels der üblichen Verfahren 41-43.
    1. Legen Sie die Maus auf seiner Vorderseite. Sprühen Sie den Kopf mit 70% Ethanol, um den Bereich zu sterilisieren.
    2. Verwenden Sie eine scharfe Schere, um durch den Hirnstamm geschnitten. Verwenden Dissektionsscheren einen flachen Schnitt seitlich um den rechten und dann der linken Seite des Schädels hend von der Basis des Stammhirns zu machen. Verwenden einer Pinzette vorsichtig schälen die Schädel, um das Gehirn aus.
    3. Gently heben Sie die Gehirn und Ort Schere zwischen dem Gehirn und Schädelbasis, um den Riechnerv abgeschnitten, um das Gehirn zu befreien. Heben Sie das Gehirn mit einer sterilen Pinzette oder einem Spatel und in eine bakteriologische Petrischale mit 10 ml sterilem PBS.
  6. Schneiden des Gehirns in der Mitte mit einem sterilen Skalpell durch den Mittelpunkt zwischen der rechten und der linken Hemisphäre.
  7. Die Hälfte des Gehirns zu einem kleinen Mörser mit 1 ml PBS. Verwenden Sie den Mörser und Stößel zueinen feinen Gewebesuspension des Gehirns, die durch eine große Bohrung 20-200 ul Pipettenspitze passieren können.
    HINWEIS: Die andere Hälfte des Gehirns sollte in 2,5% Formaldehyd für 1 Stunde fixiert, wenn Gewebeschnitte für die Histopathologie benötigt.
  8. Zeigen 100 ul des Gehirns Lysat in einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml 2,5% Formaldehyd in PBS in die Röhre, die das Gehirn-Lysat, um die Gehirnsuspension zur Färbung fixieren. Inkubiere bei Raumtemperatur für 30 min.
  9. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 8.000 xg für 5 min in einer Mikro und vorsichtig den Überstand verwerfen.
  10. 1 ml der Permeabilisierung / Blockierungspuffer zu dem Lysat (10% Ziegenserum, 0,2% Triton X-100 in PBS). Inkubiere bei Raumtemperatur für 30 min.
  11. Centrifuge Lysat bei 8.000 xg für 5 min und entfernen Überstand.
  12. Fügen Sie 200 ul FITC-konjugiertem dolichos biflorus agglutin (DBA). Verwenden Sie eine 1: 100 Verdünnung des Lektins in PBS plus 10% Ziegenserum. Resuspendieren Sie vorsichtig das Lysat durch Pipettieren. Bebrütenfür 1 h bei RT.
    HINWEIS: DBA ist ein Ligand, der an CST1 auf den Parasiten Zystenwand bindet.
  13. Zentrifuge Lysat bei 8000 × g für 5 min und Überstand verwerfen. 1 ml PBS zu dem Pellet. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min. Wiederholen Sie PBS-Wasch 3x. Entfernen Sie den Überstand nach dem letzten Waschen mit einer Pipette.
  14. Verwenden Sie eine breite Bohrung 20-200 ul Pipettenspitze auf einen Objektträger erarbeiten 5 ul des gefärbten Hirn Lysat und Ort. Montieren Sie die Objektträger mit einem 25 x 25 mm Deckglas, um eine Nasspräparat des Gehirns Lysat erstellen. Stellen Sie 3 Wiederholungs Folien mit 5 ul der Gehirn Lysat jeder.
  15. Die Anzahl der Zysten pro jeweils 5 ul Aliquot durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines 10X-Objektivs (Abbildung 6).
    HINWEIS: Einige Zysten sind groß (8 oder mehr Parasiten ungefähr), während einige sind sehr klein (1-2 Parasiten pro Zyste). Count Anzahl der Zysten pro jeder Folie, aber die Nummer des Dokuments gegenüber großen Anzahl von kleinen Zysten.
  16. Fügen Sie die Anzahl der Zysten detreflektierten in den drei unterschiedlichen 5 ul Aliquots und multiplizieren mit der Gesamtverdünnungsfaktor x 2 (nur die Hälfte des Gehirns wurde in einem Lysat hergestellt), um die Gesamtzahl der Zysten pro Gehirn abzuschätzen.

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Ergebnisse

Toxoplasma gondii repliziert frei in naiven Makrophagen und weist eine Verdopplungszeit von 6-12 h in Abhängigkeit von der Belastung des Parasiten. Abbildung 1 zeigt repräsentative Parasiten in naiven Vergleich aktiviert Knochenmark stammenden Makrophagen. Abbildung 2 zeigt die allgemeine Morphologie des Parasiten in HFF Wirtszellen, die nach 2, 4, 8, 16 und 32 Parasiten / PV. In der gegenwärtigen Protokoll wird der Parasit darf naiv Makrophagen eindringen und stellen Sie ei...

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Diskussion

Die beschriebenen Protokoll stellt eine nicht voreingenommen Ansatz, der die Aktivierung von Maus-Knochenmark stammenden Makrophagen und zukunfts Genetik T. isolieren verwendet gondii-Mutanten mit Defekt in der Fähigkeit, die Aktivierung von infizierten Makrophagen zu überleben. Der Phänotyp der Mutanten nach Makrophagenaktivierung fällt in der Regel in eine von zwei Kategorien: 1) Die Parasiten scheinen intakt, aber nicht über den 1. Parasiten pro PV replizieren; 2) Die Parasiten erscheinen abgeb...

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Offenlegungen

The authors have no competing financial interests.

Danksagungen

Special thanks to Dr. Peter Bradley for the antibody to detect the T. gondii mitochondria. The work was supported by National Institute of Health Grants AI072028 and AI107431 to D.G.M and a generous donation to New York Medical College for the study of tropical medicine.

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