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요약

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

초록

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in naïve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

서문

톡소 포자충 (T. 포자충)는 의무적 인 세포, 원 충성 병원체이다. 이 톡소 플라즈마 증의 원인균, 면역 개인의 건강 위험이 있습니다. 또한 포자충과 원 포자충 속을 포함하여 인간을 감염 다른 apicomplexan 병원균의 모델 시스템입니다. 톡소 플라즈마 증은 가장 일반적으로 기생충의 bradyzoite 또는 oocyst 단계에 오염 된 음식이나 물을 섭취을 통해 획득된다. 섭취시,이 단계는 숙주 세포 내에서 복제하고 체계적으로 유포 기생충의 tachyzoite 단계로 변환합니다. T 세포, IFN-γ와, 낮은 정도, 산화 질소 1-4, 감염의 조절에 중요하지만 tachyzoites의 비율로, 병을 제거 할 수없는 조직 포낭 내에서 보호된다 bradyzoite 스테이지로 변환 수명이 긴 만성 감염의 결과. 사실, 어떤 치료제는 만성 낭종의에 효과가없는질병의 다케. 심한 톡소 플라즈마 증은 기본 및 급성 감염의 신속 복제 tachyzoite 단계 특성으로 다시 변환 기생충의 bradyzoite 단계로 인해 지속적인 감염의 재 활성화에 가장 많다.

선천성 면역 반응의면에서 이른 생존 기생충 충분한 기생충 번호에 도달 할뿐만 아니라 만성 감염의 확립을 가능하게하기 위해, 말초 부위에 도달 할 수 있도록하는 것이 중요하다. T. 포자충 가능성 복제 및 감염의 조기 보급 할 수있는 능력에 기여하는 숙주 방어 메커니즘을 방해하는 전략을 진화했다. 첫째, T. 포자충 다른 세포 내 병원체에 비해 5-9 숙주 세포 내 이입 및 exocytic 프로세스와 크게 편석 기생충 침윤 동안 고유 PV를 형성한다. 또한, 모든 성공적인 세포 내 병원균의 T. 같은 포자충은 f를 허용 환경을 조성하기 위해 숙주 세포를 수정또는 성장. 이것은 세포 활성화 10-15 조절에 중요 포함한 숙주 세포 전사 인자를 변경하여 재 프로그래밍 숙주 세포의 유전자 발현을 포함한다. ROP16 16-19 GRA15 20 GRA16 21, 22는 모두 GRA24 T. 감염된 숙주 세포를 전사 캐스케이드 반응을 조절하고 세포 시그널링에 중요한 것으로 밝혀졌다 포자충. 별개의 표현형과 기생충 변종 사이의 유전 십자가를 사용하여 최근의 연구는 면역 관련 GTP 아제 (IRGs) 16,19,23-26의 회피를 포함하여 기생충 유전자형에 의존하는 특성을 기초 기생충 유전자를 식별하는 매우 생산되고있다. 매우 독성이 강한 유형 I 유전자형이 쥐 IRGs을 회피 메커니즘을 진화하는 동안 마우스에 면역 관련 GTP 아제 (IRGs)는 유형 II의 제어 및 기생충의 III 유전자형을 위해 중요하다. 그러나, 기생충 항균 미디어를 회피하는 메커니즘을 진화 한 것이 분명하다이러한 메커니즘의 일부 IRGs과 그 외에 TORS는 기생충 유전자형 (27, 28)에 걸쳐 보존 할 수있다. 또한, 약간은 T.에 대한 세포 자율 면역의 중요한 매개체에 대해 알려진 인간의 톡소 플라즈마 증 동안 포자충. tachyzoite 또한 호스트 면역 반응에 의해 유발 될 수있는 변환을 bradyzoite하는 동안 셀 자율 면역 매개 물질에 대한 저항성에 중요한 기생충 유전자는 생존을 위해 중요 할 수있다. 예를 들어, 높은 수준의 질소 산화물이 감염된 대 식세포 기생충 복제를 억제 할뿐만 아니라 생산 낭종 30-32 변환을 초래하는 bradyzoite tachyzoite을 자극 할 수있다.

ToxoDB는 T.위한 기능 게놈 데이터베이스입니다 포자충 그 지역 사회 주석을 포함한 출판되지 않은 게놈 규모의 데이터 시퀀스 기생충 게놈에 대한 정보와 액세스를 제공하는 측면에서 필드의 중요한 자원으로 기능, 유전자 특급 ression 및 단백체 데이터 (33). 많은 충성 병원체와 마찬가지로, 게놈의 대부분이 잠재적 인 기능에 대한 통찰력을 제공하기 위해 유전자 상 동성을 기반으로 사용할 수없는 정보와 가상의 유전자로 구성되어 있습니다. 따라서, 앞으로 유전자는 면역 회피, 낭종 변환 및 기생충 병인뿐만 아니라 별개의 발달 단계 사이의 변환을위한 중요한 다른 기능에 중요한 새로운 기생충 유전자를 식별 할 수있는 강력한 도구입니다. 순방향 유전학의 추가적인 장점은 면역 회피 및 포낭 형성 포함한 병인 특정 작업에 중요한 유전자로 기생충 심문 비교적 비 편향된 방식으로 사용될 수 있다는 점이다. 돌연변이 프로파일 링을위한 차세대 시퀀싱 최근 개선은 화학에서 삽입 모두 돌연변이 유발 34 ~ 37를 사용하여 앞으로 유전학 연구의 책임 기생충 유전자를 식별하기위한 선택의 방법을 만들었습니다.

ntent은 "> 그것은 특히 또한 저항 낭종 단계에 활성화 될 수 것들.이 목표를 향해, 시험관 쥐의 기생충에 대한 세포 자율 면역 메커니즘의 효율성을 향상시키기 위해 이용 될 수있다 T. 포자충의 취약점을 파악하는 것이 중요하다 대 식세포 감염 및 활성화 모델을 구체적으로 순진한 대 식세포에 감염된 대 식세포의 활성화가 아닌 다음 T.의 포자충 체력을 손상 기생충 돌연변이를 확인하기 위해 개발되었다.이 대 식세포 화면에 순서대로 T. 포자충에서 삽입 돌연변이 체의 라이브러리를 심문하기 위해 사용되었다 궁극적으로 산화 질소 (27, 28)에 대한 내성을 위해 중요 T. 포자충 유전자를 확인한다. 감염된 대 식세포 산화 질소 특히 현저한 감도의 활성화에 장애가 저항 T. 포자충 돌연변이 패널의 분리를 식별하기 위해 화면의 유용성을 입증 저항에 대한 중요한 기생충 유전자뮤린 IRGs 28에 기재된 저항기구 이외 셀 자율 면역 매개체이다. 삽입 성 돌연변이 유발 이론 랜덤 기생충 각 클론의 돌연변이 및 돌연변이의 위치의 식별을 용이하게 제한된 수를 생성하는 관점에서 화학적 돌연변이 유발에 비해 많은 장점을 갖는다. 그러나, T.에서 플라스미드 삽입의 게놈 사이트를 식별합니다 포자충 삽입 성 변이체는, 실제로는, 많은 경우에 37 의외로 어려웠다. 유전자 내로 플라스미드의 삽입은 일반적으로 단일 염기 변화를 초래 화학적 돌연변이 대조적으로 유전자의 기능을 방해하기 쉽다. 그것은 다수의 단일 염기 다형성을 생성하지만, 화학적 돌연변이 유발 N 에틸 -N- 니트로 소 우레아 (ENU) 또는 ethylmethane 설포 네이트 (EMS) 중 하나와 (삽입 성 돌연변이 유발에 비해 기생충 게놈의 큰 부분을 분석 할 수있는 증가 된 능력을 제공 할 수있다 돌연변이 (34) 당 10 -100)로 추정38. 또한, 전체 게놈 프로파일 최근 발전은 가능한 돌연변이 기생충 34,38의 표현형에 책임 식별 가능성의 후보 유전자를 동정하는 차세대 시퀀싱을 사용하도록했다. 상관없이 돌연변이 유발 접근법 식세포 활성화에 저항 기생충 유전자의 역할을 확인 궁극적 분자 코흐의 공리를 충족 유전자 결실 및 보완이 필요하다.

기생충 및 대식구 모두의 유전자 조작에 의한 유전자의 기능을 절개하는 능력은 T. 앞으로 유전학 통해 식별 된 유전자의 많은만큼 중요 포자충,뿐만 아니라 다른 병원체는 아직 공지 기능없이 다른 단백질 서열 상 동성이 거의 가설 유전자로 특징 지어진다. 현재 용지는 돌연변이 유전자의 파괴는 공지 또는 내성에 중요한 것인지 식별​​ 할 수있는 일반적인 방법을 설명셀 자율 면역 알 수없는 중재자. 숙주 미생물 인자 초기 분석은 야생형 및 유도 성 산화 질소 합성 효소 (iNOS의) GP-91 phox (NADPH 옥시 다제)에서 특정 유전자의 결실로 그 대 야생형 마우스에서 대 식세포의 돌연변이 기생충의 생존을 평가함으로써 수행되고 특정 면역 관련 GTP 아제 (IRGs). 확인 된 기생충 유전자가 산화 질소, 활성 산소 중간체 또는 면역 관련 GTP 아제 (28)을 각각 또는 알 수없는 면역 메커니즘이 관련된 경우에 대한 저항성에 중요한 경우를 결정합니다. 현재의 프로토콜에 기재된 IFN-γ와 LPS 모두 감염된 대 식세포의 활성화는, 주로 일산화 질소 (28)의 저항에 중요한 기생충 유전자의 분리 결과. 마크로파지 활성화의 부재 하에서 산화 질소 유도되는 약물의 사용은 (산화 질소 공여체) 식별 유전자의 대부분이 재 중요한 것이 확인산화 질소보다는 대 식세포 활성화 (28)와 관련된 추가 매개과 콘서트에서 산화 질소에 sistance.

하나, 둘, 시험관에 감염된 골수 유래 대 식세포의 활성화를 다음과 피트니스 결함과 기생충 돌연변이를 분리하기위한 앞으로 유전학 화면을 설명하는 단계. 하나 기생충 복제를 감소 시키지만, 완전 야생형 T.의 복제를 저해하지 않는 대 식세포 활성화를 위해 사용 된 실험적 IFN- γ와 LPS의 투여 량을 결정하기 위해 용량 적정 분석을 설명 스텝 기생충 돌연변이 라이브러리의 제작에 사용되는 모 균주 포자충. 두 번째 단계는 96 웰 플레이트에서 대 식세포의 돌연변이 클론의 앞으로 유전 화면을 설명합니다. 세 번째 단계는 각 돌연변이에 결함이 기생충의 생존에 영향을 미치는지, 복제를 평가하고 96 웰 플레이트의 화면에서 식별 된 각 돌연변이의 표현형을 확인하는 방법을 설명,대 식세포의 활성화에 응답 또는 낭종 생산. 네 단계는 돌연변이 기생충은 특히 민감되는 면역 매개체를 식별하기 위해 특정 항균 통로에 결실 된 마우스 골수 유래 대 식세포를 사용하는 방법을 설명한다. 5 단계는 감염된 쥐의 뇌에 낭종 생산에 의해 평가 등의 기생충 돌연변이는 또한 생체 기전에 대한 손상 여부를 확인하는 방법을 설명합니다.

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프로토콜

참고 : 동물의 사용을 포함 모든 프로토콜 뉴욕 의과 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
참고 : 희석 (38), 쥐의 골수 유래 대 식세포 (39)의 분리, T.의 성장을 제한함으로써 화학 돌연변이 (38), 기생충의 분리를위한 상세한 프로토콜 인간의 포피 섬유 아세포에서 포자충 (HFF) 대 식세포의 세포와 낭종 생산 및 기본 면역 형광 분석 (IFA) (32) 참조. (10 % 소 태아 혈청 및 2 mM L- 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변성 내 포도당 이글 중간) D10 배지에서 5 % CO 2에서 37 ° C의 모든 세포 배양을 수행 . 세포 절연 부 및 세포 배양에 걸쳐 살균 모든 시약을 보관하십시오.

IFN-γ와 CONCENTR을 확인하는 LPS의 1 용량 적정관리 포인트는 앞으로 유전학 화면에 대한 감염된 대 식세포를 활성화하기 위해 사용하는

  1. 문화 뮤린 골수 유래 대 식세포 O / N 챔버 당 D10 매체의 250 μL에 3 × 105 세포 / ml의 농도로 여덟 챔버 유리 슬라이드에. 골수에서 분리 한 후 대 식세포에게 두 주에 하나를 사용하십시오.
    참고 : 상공 회의소 슬라이드 향상 RS 세척 성장이 그 구입.
  2. T25 조직 배양 플라스크에서 자란 인간의 포피 섬유 아세포 (HFF) 세포에서 수확 야생 형 기생충을 계산하는 혈구를 사용합니다. D10 매체에 1 ㎖ 당 5 × 105 야생형 기생충의 농도로 재현 탁 기생충. 대 식세포는 O / N을 증식 한 바와 같이 1 :이 농도는 약 1 감염의 다양성 발생합니다. 폴리 프로필렌의 기생충 스틱과 같은 기생충 모든 조작 폴리스티렌 또는 PET 튜브를 사용합니다.
  3. 챔버 슬라이드에 D10 미디어를 제거하고 250 μL로 교체야생 형 기생충 정지. 가볍게 각 챔버의 내면 아래로 흐르게하여 각 슬라이드 챔버 기생충 현탁액을 추가한다. 대 식세포는 프로토콜 중 어느 시점에서 건조하는 것을 허용하지 마십시오.
  4. 4 시간 동안 5 % CO 2에서 37 ℃ 배양기에서 챔버 슬라이드 덮개 및 장소 기생충 감염 챔버 커버 슬라이드는 침입 PV를 확립 기생충 시간을 허용한다.
  5. 용량 적정 멸균 튜브 D10 매체의 1 ml의 LPS 및 IFN-γ의 희석을 확인합니다. 용량은 적정는 LPS 또는 IFN-γ 농도 상수를 유지하고 다른 자극 (40)에 따라 다릅니다.
    1. 예를 들어, 1 ㎖ 당 10 ng를 LPS에 LPS를 일정하게 유지하고 IFN- γ를 (0, 1 단위 / ㎖, 10 단위 / ㎖, 100 단위 / ㎖, 1,000 개 / ㎖)의 농도가 변화한다. IFN- ml를 100 단위 /에서 상수 γ와 LPS (0, 인 0.1ng / ㎖, 1 NG / ㎖, 10 ng를 / ㎖, 100 ng의 / ㎖)의 농도를 변화 유지. 2 분없이위한 간단히 초음파 처리 LPS 재고희석하기 전에 목욕 초음파기 (안와 팁 초음파기)에서 가열.
      참고 : 초음파 처리가 숙주 세포에 제대로 결합하지 않을 수 있습니다 LPS에 의해 형성된 미셀 집계를 중단하는 것이 좋습니다.
  6. 4 시간 챔버 슬라이드의 기생충 및 대 식세포 사이의 공동 문화의 개시 후, 각 실에 D10 매체를 폐기하고 D10 미디어에서 IFN-γ의 γ와 LPS의 적절한 희석액 300 μL로 교체합니다. 대 식세포 활성화의 부재에 기생충 복제를 평가하는 유일한 D10 미디어와 컨트롤을 포함합니다.
  7. 24-30 추가 시간 5 % CO 2에서 37 ° C에서 인큐베이터에있는 챔버 슬라이드 커버와 장소를 다시 커버 챔버 슬라이드.
    참고 : 배양 시간은 기생충의 변형에 따라 6 ~ 12 시간까지 다양 야생 형 기생충 변형의 배가 시간에 따라 달라집니다. 시점은 순진 대 식세포의 용해 기생충 이전에 선택되어 있지만 충분히 적어도 3-4 앉아야 수 있도록블링 시간.
  8. 둘 베코 인산염 완충 식염수 (PBS)에 2.5 %의 포름 알데히드 용액을 제조. 챔버 슬라이드에 미디어를 취소하고 2.5 %의 포름 알데히드 용액 300 μL로 교체합니다. 실온에서 20 분 동안 수정.
  9. 두 번 챔버 당 PBS 300 μL와 린스 슬라이드 (들). 각 린스, 슬라이드를 버리고 PBS 슬라이드에 부착 된 대 식세포를 방해하지 않도록하기 위해 각 슬라이드 챔버의 내면을 통해서 조용히 새로운 PBS를 추가한다. 염색하기 전에 마르지 슬라이드를 방지하기 위해 챔버 슬라이드 챔버와 장소 커버 당 PBS의 300 μl를 추가합니다.
    참고 : 슬라이드 전에 염색이 시점에서 최대 3 일 동안 4 C에 배치 할 수 있습니다.
  10. T.에 대한 염색 프로토콜 면역 형광 현미경 (IFA)에 의해 포자충 검출.
    1. PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100 용액 (투과성으로 버퍼)를 만든다. 트리톤 X-100 용액로 전환하기 위해 37 ° C의 물을 욕조 짧게 소용돌이 안에 관에서 솔루션을 놓습니다. 폐기PBS 챔버 슬라이드와 투과성으로 버퍼 300 μL로 교체합니다. 실온에서 30 분 동안 둡니다.
    2. PBS (차단 솔루션) 10 % 염소 혈청의 솔루션을합니다. 슬라이드의 투과성으로 버퍼를 취소하고 실 당 차단 솔루션의 300 μL로 교체합니다. 실온에서 30 분 동안 둡니다.
      주 : 소 태아 혈청 모든 염색 프로토콜에서 염소 혈청으로 대체 될 수있다.
    3. T.에 형광 접합 된 항체의 1,000 희석 : 한 단계 IFA 염색 프로토콜의 경우, 1 - 1 차단 솔루션에 포자충. 슬라이드에서 차단 솔루션을 제거하고 챔버 당 항체 용액 150 μl를 추가합니다. 건조로부터 세포를 방지하기 위해 챔버 슬라이드 커버 슬라이드를 교체합니다. 실온에서 1 시간 동안 품어.
      주 : 항체 농도는 실험적으로 소스에 따라 결정되어야한다. 항체를 형광 직접 접합 또는 사용자를 형광 접합 구입.
      1. 두 단계 IFA 염색 용T.에 접합 된 항체 프로토콜 포자충과 형광 접합 된 이차 항체, T.에 대한 접합 차 항체 150 μL와 얼룩 슬라이드 RT에서 1 시간 동안 블로킹 완충액에서 포자충. 300 PBS의 μL 플러스 1 % 염소 혈청 (세척 버퍼)로 3 배를 씻어.
      2. 차 항체에 대한 기원의 종에 대한 특정 형광 접합 된 이차 항체의 150 μl를 추가합니다. 건조로부터 세포를 방지하기 위해 챔버 슬라이드 커버 슬라이드를 교체합니다. 실온에서 1 시간 동안 품어.
    4. 린스 슬라이드는 PBS 플러스 1 % 염소 혈청 (세척 완충액)으로 3 배. 각 린스를 들어, 그 내용을 덤프하여 챔버 슬라이드에서 솔루션을 제거하고 세척 완충액 300 μL로 교체합니다.
    5. 린스 슬라이드는 PBS의 300 μL와 배.
    6. 제조업체의 지침에 따라 챔버 슬라이드에서 챔버를 제거합니다.
    7. 마운트 DAPI를 포함하는 미디어를 장착 (4'6-diamidino -2- 페닐와 슬라이드인돌, dilactate)와 22mm X 50mm coverslip에.
  11. 위상 콘트라스트와 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 검사합니다. 잘 챔버 당 100 PV를 최소 검사하여 공포 당 기생충의 평균 수를 결정합니다. 화면의 IFN- γ와 LPS의 투여 량은 선택 야생형 기생충 (도 1 참조)의 복제를 억제하기에 충분해야하지만, 금지하지.

감염된 대 식세포의 피트니스 결함에 따라 정품 인증 기생충 돌연변이 2. 분리

주 : 랜덤 (T)의 도서관 포자충 돌연변이는 앞으로 유전학 화면이 필요합니다. T.의 무작위 돌연변이 유발 포자충은 화학 물질 (ENU / EMS) 또는에서 삽입 돌연변이 유발 27,28,38 수행 할 수 있습니다. 제한 희석 및 D10 매체 32,38 200 μL의 부피 HFF 부착 세포를 함유하는 96- 웰 플레이트에서 각각의 클론을 성장하여 돌연변이 클론 기생충 이어.그것은 현미경에 의한 대 식세포에서 기생충 검사 96 웰 플레이트는 현미경 검사를 가능하게하는 광학 바닥을하는 것이 중요합니다. 스크리닝 위상차 현미경 및 형광 96- 웰 플레이트를 위상 콘트라스트 4, 10, 20 또는 긴 작동 거리에 대한 장착 40X 목적으로 반전 형광 현미경을 필요로 염색. 4X 목적은 전체를 잘 볼 수 있지만, 기생충의 더 나은 해상도가 20 배 목표 달성된다 유용합니다.

  1. 두개로 96- 웰 조직 배양 플레이트에서 합류 HFF 세포에서 성장 tachyzoite 돌연변이의 전사 50 μl의 D10 매체 100 ㎕에 소요되었으며 (1-2 주 차단 후) 뮤린 골수 유래 대 식세포를 함유하는 96 웰 플레이트를 복제.
    주 : 각 웰 당 전송 기생충의 수를 계산하는 것을 피하기 위해 기생충 배양 부피를 기준 기생충의 96 웰 플레이트에서 수행 초기 화면. 따라서, 2.6 현미경 분석 wheth에 성적을 기반으로어 기생충은 일반적으로 복제 복제 또는하지 않았습니다. 3 단계는 대 식세포를 감염 야생형 또는 돌연변이 기생충 같은 수를 사용하여 챔버 슬라이드에서 돌연변이의 표현형을 확인하는 방법을 설명합니다.
    1. 직접 각 웰에 이미 D10 미디어에 기생충을 추가합니다. 기생충 복제에 대한 양성 대조군으로 야생형 tachyzoites 두 개의 우물을 감염.
  2. 기생충에게 세포에 침입 및 PV를 만들 수있는 시간을 허용하기 위해 4 시간 동안 인큐베이터 (37 ° C 5 % CO 2)에 감염된 세포를 놓습니다.
  3. 판의 내용을 덤핑 한 판에서 미디어를 꺼내십시오. 기생충에 대한 세제 cidal를 포함하는 폐기 유역에 접시에 미디어를 덤프 손목의 하나의 플립을 사용합니다.
    1. 미디어 및 멀티 채널 피펫에 대한 멸균 분지를 사용하여 "대 식세포 활성화 미디어"의 100 μl를 추가합니다. 맥에 대한 1 단계에서 결정된 최적의 LPS의 농도와 IFN-γ를 사용하여rophage 활성화 미디어. 유사 중복 제어 판에서 미디어를 제거하고 D10 미디어 100 ㎕로 교체합니다.
  4. 추가로 24 ~ 30 시간 동안 인큐베이터 (2 37 ° C, 5 % CO)에 감염된 세포를 놓습니다.
  5. IFA 96 웰 플레이트 염색 프로토콜입니다.
    1. 접시에 미디어를 버리고 PBS 2.5 % 포름 알데히드 100 ㎕로 교체합니다. 실온에서 20 분 동안 품어. 포름 알데히드와 멀티 채널 피펫의 멸균 분지를 사용합니다.
    2. 접시에 포름 알데히드 용액을 버리고 판에서 포름 알데히드를 씻어 100 μl의 PBS를 추가합니다.
    3. 접시에 솔루션을 버리고 각 웰 (0.2 % 트리톤 X-100과 PBS) 투과성으로 버퍼의 100 μl를 추가합니다. RT에서 30 분 동안 인큐베이션.
    4. 접시에 솔루션을 버리고 각 웰 (10 % 염소 혈청 PBS)을 차단 솔루션의 100 μl를 추가합니다. RT에서 30 분 동안 인큐베이션.
    5. 페이지에서 솔루션을 폐기후반. 추가 / 잘 형광 - 복합 안티 T. 50 μL 포자충 항체는 1 희석 : PBS 1000 플러스 1 % 염소 혈청을. 에와 로커에 플레이트 커버 실온에서 1 시간 동안 품어.
      1. 또한 T.에 대한 접합 차 항체를 사용 포자충은 1.10.3.1에 기재된 형광 접합 이차 항체로 염색 하였다.
    6. 접시에 항체 솔루션을 취소하고 100 μL / 잘 PBS 플러스 1 % 염소 혈청으로 교체합니다. 혼자 PBS와 2 개의 추가 헹굼 다음이 린스 배를 수행합니다. 각 웰에 PBS 200 μl를두고 건조에서 우물을 방지하기 위해 96 웰 플레이트에 덮개를 교체합니다.
      참고 : 파라 필름에 싸여 현미경으로 분석 전에 최대 3 일 동안 4 ° C에 배치 할 수 있습니다에 커버 플레이트.
  6. 20-40X 목표를 사용하여 거꾸로 형광 현미경으로 세포를 검사합니다. NA &에 복제를 선택 돌연변이# 239; 식세포 판 적이 있지만, 주로 "활성화 된 대 식세포"하나의 기생충 / 공포를 넘어 복제하는 데 실패하거나 그 비정질 또는 "활성화 된 대 식세포"에서 분해 나타납니다.
    참고 : 공포 당 야생형 기생충의 수는 이상적으로 IFN-γ 및 사용 LPS의 용량에 따라 달라집니다하지만 것은 공포 당 약 4 기생충이다 성장 억제가 아닌 활성화 자극에 의​​한 복제의 완전한 억제를 반영하는 숫자.

결함이 감염된 대 식세포의 활성화에 따라 기생충 생존의 수준 또는 복제에있는 경우 3. 결정하기 위해 돌연변이를 평가

  1. 전송 HFF 세포를 포함하는 T25s 96 웰 플레이트 (전체 잘의 내용)에서 기생충 돌연변이를 선택하고 복제 할 수 있습니다.
  2. 배양 골수 유래 대 식세포 O / N D10 매체의 250 μL 3 × 105 세포 / ml의 농도로 챔버 8 유리 슬라이드에. PA를 비교하는 하나의 슬라이드를 준비합니다순진 대 식세포에서 rasite 복제 및 추가 슬라이드 감염된 대 식세포의 활성화를 다음과 같은 기생충 복제를 비교합니다.
  3. 수확 tachyzoite 기생충 및 혈구로 계산합니다. 5 × 10 4 T. 추가 포자충 잘 4 시간 동안 D10 미디어와 문화에서 대 식세포를 포함하는 챔버에 기생충. 제어와 같은 야생 형 부모 기생충 잘 하나를 포함합니다. 순진 대 식세포에서 기생충의 복제를 모니터하기 위해 활성화 미디어를받을 수 없습니다 같은 기생충 복제와 동일한 복제 슬라이드를 접종한다.
  4. 복제 챔버 슬라이드 1 D10 미디어를 버리고 "활성화 매체"250 μL로 교체합니다. 다른 복제 챔버 슬라이드에서 D10 미디어를 버리고 D10 미디어의 250 μL로 교체합니다. 에 챔버 슬라이드 커버를 "활성화"와 "순진"식세포 슬라이드를 모두 품어 additi 37 ° C, 5 % CO 2에서도 그러 24-30 시간.
  5. 1 단계에 설명 된대로 그대로 챔버와 IFA 염색을 수행, 수정 Permeabilize 하시려면 및 IFA 염색 및 기생충의 분석을위한 블록 슬라이드.
    1. T.에 막 관련 1 (램프 1) 또는 Lysotracker 항체를 리소좀에 대한 항체와 공동 얼룩 세포 감염된 대 식세포의 활성화가 리소좀 (그림 4)와 돌연변이의 PVs의 융합을 유발 여부를 포자충 평가합니다.
    2. 초기 식세포 활성화 (28) 다음 분명하다 기생충 돌연변이 체의 변화를 식별하기 위해 IFA에 의해 염색에 대한 기생충 / PV의 특정 구획 / 세포 소기관에 대한 항체를 사용합니다.
      참고 : 이러한 변경이 대 식세포 활성화 다음 돌연변이의 결핍 생존 / 복제의 기초가되는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수있다.
  6. 100X 위상 오일 목적과 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 검사합니다.
    1. 를 결정하여 기생충 복제 평가100 임의의 공포에서 PV 당 기생충의 수입니다. 통계 분석 (100)의 각 액포 적어도 2 카운트를 수행한다.
    2. 일반적인 두 형광 분석을 이용하여 기생충 형태뿐만 아니라, 위상차 현미경을 평가한다. 단계 100 배 목표 아래보기 기생충. 건강한 기생충 기생충 단단히 몸에 꼭 맞는 parasitophorous 공포로 묶여있다. 상 조밀 한 바퀴 또는 비정질 기생충 비정질 넓은 공포가 기생충 기생충 죽음보다는 복제에 불과 결함 (그림 1 및 3) ​​제안한다.

4. 감염된 대 식세포의 활성화에 돌연변이 기생충의 감수성이 알려진 항균 조정자와 연관되어 있는지 여부를 평가

  1. - / -, gp91-phox을 -, 야생형 C57 / BL6 마우스에서 iNOS의를 골수 유래 대 식세포를 분리 / - 또는 Irgm1 / Irgm3 - / - 마우스 (32).
  2. 문화 각각의 골수 유래 맥rophages O / D10 매체의 250 μL에 3 × 105 세포 / ml의 농도로 챔버 8 유리 슬라이드에 N.
  3. 3 단계에 설명 된대로 기생충 도전, IFA 염색 및 분석을 진행합니다.
  4. 생존하고 감염된 대 식세포의 활성화를 다음 복제 돌연변이 기생충의 능력이 GTP 아제 (28)와 관련된 활성 산소 또는 질소 종 또는 특정 면역이없는 경우 복원 여부를 결정합니다.
  5. 특정 항균 매개체들이는 대 식세포의 활성화 (28)의 다른 매개체와 협력하여 행동한다면 HFF 세포 또는 순진 대 식세포에서 돌연변이 기생충을 방해하거나 그 자체로 충분한 여부를 평가하기 위해, 이러한 산화 질소 공여체로되는 약물을 사용합니다.

5. 평가 돌연변이 기생충 타협 만성 감염의 결함 여부를

  1. T25s 공동 성장 야생 유형, 돌연변이 또는 표적 유전자 삭제 기생충 tachyzoites를 분리HFF 세포 ntaining. 기생충 갓 HFF 문화에서 용해되어야한다.
  2. 혈구를 사용하여 기생충을 계산합니다. 복강 내 (IP) 주사에 의해 200 μL 전해 기생충 서브 치사량 용 ㎖의 적절한 당 농도 행크스 평형 염 용액 (HBSS)에 재현 탁 기생충.
  3. 200 μL 볼륨 복강 (IP)와 기생충을 주입하는 1 ML의 투베르쿨린 주사기 25 G 바늘을 사용합니다. 투여 량은 기생충의 야생형 마우스 유전자형에 따라 달라집니다.
    참고 : 기생충의 종류 I 유전자형에 관계없이 기생충 용량의 감염의 급성 단계에서 쥐에게는 치명적이며, T.에 대한 화학 요법의 부재에 만성 감염의 연구에 적합하지 않다 포자충은 기생충 복제를 억제합니다.
  4. 30 일 기생충 공격 후, 표준 크기의 마우스 케이지는 더 이상 5m를 포함 할 수있다 (솟아 실에서 가압 탱크에서 CO 2의 흡입 쥐를 희생얼음은 자궁 경부 전위 다음).
  5. 설립 절차 41-43를 사용하여 마우스에서 뇌를 분리합니다.
    1. 그 전면에 마우스를 놓습니다. 살균 영역을 70 % 에탄올로 스프레이 헤드.
    2. 뇌 줄기를 잘라 날카로운 가위를 사용합니다. 다음 얕은 오른쪽 주위에 옆으로 잘라 내기 및 뇌간의 기본에서 시작하여 두개골의 왼쪽을 만들기 위해 해부 가위를 사용합니다. 부드럽게 뇌를 노출 두개골을 벗겨 집게를 사용합니다.
    3. 부드럽게 뇌를 무료로 후각 신경을 잘라 두개골의 뇌와베이스 사이의 두뇌와 장소 가위를 들어 올립니다. 멸균 집게 또는 멸균 PBS 10 ㎖를 포함하는 세균 배양 접시에 주걱과 장소 뇌를 들어 올립니다.
  6. 오른쪽과 왼쪽 반구 사이의 센터를 통해 멸균 메스 반으로 뇌를 잘라.
  7. PBS 1 ㎖를 함유하는 모르타르 작은 뇌의 절반을 추가한다. 에 박격포와 유 봉을 사용하여넓은 구멍 20 ~ 200 μL 피펫 팁을 통과 할 수있는 뇌의 미세 조직 서스펜션을합니다.
    주 : 조직 섹션은 조직 병리학 필요한 경우 뇌의 나머지 절반을 1 시간 동안 2.5 % 포름 알데히드로 고정되어야한다.
  8. 1.7 ml의 microcentrifuge 관에서 뇌 해물을 100 ㎕를 놓습니다. 염색의 뇌 서스펜션을 해결하기 위해 뇌 해물이 들어있는 튜브에 PBS 2.5 % 포름 알데히드의 1 ML을 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션.
  9. 마이크로 원심에서 5 분 동안 8,000 XG에 해물을 원심 분리기 조심스럽게 상층 액을 버린다.
  10. 해물 (10 % 염소 혈청, PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100)에 투과성으로 / 차단 버퍼의 1 ML을 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션.
  11. 원심 분리기 5 분 8,000 XG에 해물과 상층 액을 제거합니다.
  12. FITC - 복합 dolichos biflorus agglutin (DBA)의 200 μl를 추가합니다. PBS에서 렉틴 플러스 10 % 염소 혈청 100 희석 : 1을 사용합니다. 조심스럽게 피펫으로 해물을 재현 탁. 품다실온에서 1 시간 동안.
    참고 : DBA가 기생충 낭종 벽에 (Cst1)와 결합하는 리간드이다.
  13. 원심 분리기 5 분 8,000 XG에 해물과 상층 액을 제거한다. 펠릿에 1 ㎖의 PBS를 추가합니다. 5 분 동안 RT에서 배양한다. PBS 세척 배를 반복합니다. 피펫을 사용하여 최종 세척 다음 상층 액을 제거합니다.
  14. 현미경 슬라이드에 스테인드 뇌 해물과 장소의 5 μl를 그려의 넓은 구멍 20 ~ 200 μL 피펫 팁을 사용합니다. 뇌 해물 젖은 마운트를 만들기 위해 25 X 25mm 커버 슬립 슬라이드를 탑재합니다. 뇌의 5 μL가 각각 해물을 사용하여 3 복제 슬라이드를 확인합니다.
  15. 10 배 목표 (그림 6)를 사용하여 형광 현미경으로 각 5 μL 나누어지는 당 낭종의 수를 계산합니다.
    참고 : 일부 낭종은 일부 (낭종 당 1-2 기생충) 매우 작은 반면 대형 (8 개 이상의 기생충 약)입니다. 작은 낭종의 수에 비해 대형의 각 슬라이드하지만 문서 번호 당 낭종의 수를 계산합니다.
  16. 낭종의 DET의 수를 추가반사 된 (뇌 만 절반 분해물로 만들어진) 총 희석 계수 X (2)에 의한 세 개의 다른 5 μL 분취하고 번성 뇌 당 총 낭종 수를 추정한다.

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결과

톡소 포자충은 순진 대 식세포에서 자유롭게 복제하고 6 ~ 12 시간이 기생충의 변형에 따라 사이에 두 배의 시간이 있습니다. (1)가 활성화 된 골수 유래 대 식세포 대 순진한 대표 기생충을 보여줍니다. 그림 2 HFF에서 기생충의 일반적인 형태를 보여줍니다 2, 4, 8, 16, 32 기생충 / PV에서 숙주 세포. 현재 프로토콜에서 기생충은 순진 대 식세포 침입 감염된 대 식세포에 ...

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토론

설명 된 프로토콜은 뮤린 골수 유래 대 식세포를 분리 T. 순방향 유전학의 활성화를 사용하여 비 편파 접근법을 제공 자신의 능력에 결함이와 포자충 돌연변이 감염된 대 식세포의 활성화를 생존. 돌연변이 다음 식세포 활성화의 표현형은 일반적으로 두 가지 범주 중 하나에 해당 : 1) 기생충은 그대로 나타나지만 PV 당 1 기생을 넘어 복제하는 데 실패; 2) 기생충이 저하 될 넓고...

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공개

The authors have no competing financial interests.

감사의 말

Special thanks to Dr. Peter Bradley for the antibody to detect the T. gondii mitochondria. The work was supported by National Institute of Health Grants AI072028 and AI107431 to D.G.M and a generous donation to New York Medical College for the study of tropical medicine.

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자료

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