بقع الدم المجفف-إعداد وتجهيز لاستخدامها في تحديدكم والتقنيات الجزيئية

Summary

لا تزال ضعيفة هي موحدة بإعداد وتجهيز بقع الدم المجفف (DBS) لتحليلها النهائي لمعظم التطبيقات التشخيصية. للتغلب على هذا القصور، اقترح بروتوكول شامل خطوة بخطوة وتقييمها فيما بعد فيما يتعلق بفعالية للكشف عن علامات للعدوى الفيروسية.

Abstract

وفكرة جمع الدم على بطاقة ورقة، وفي وقت لاحق باستخدام بقع الدم المجفف (DBS) لأغراض التشخيص التي نشأت منذ قرن من الزمان. ومنذ ذلك الحين، اختبار DBS لعقود ظلت في الغالب تركز على تشخيص الأمراض المعدية وبخاصة في الأماكن المحدودة الموارد أو منهجية فحص المواليد الجدد للاضطرابات الأيضية الموروثة وإلا يكون مؤخرا مجموعة متنوعة من تطبيقات DBS مبتكرة وجديدة بدأت في الظهور. لسنوات عديدة، اعتبرت المتغيرات قبل التحليلية فقط غير لائق في ميدان اختبار DBS، وحتى اليوم، باستثناء الفحص، في المرحلة التحليلية قبل أسرة، الذي يشمل الإعداد وتجهيز DBS لحديثي الولادة على قد لا تم توحيد التحليل النهائي. في ضوء هذه الخلفية، بروتوكول شامل خطوة بخطوة، الذي يغطي ال مراحل أساسية، من المقترح، أي جمع الدم؛ إعداد بقع الدم؛ تجفيف بقع الدم؛ تخزين ونقل DBS؛ شطف DBS، وأخيراً تحليل DBS الواتيس. وكان تقييم فعالية هذا البروتوكول أولاً مع أزواج يزوج 1,762 المصل/DBS للكشف عن علامات لفيروس التهاب الكبد باء وفيروس التهاب الكبد الوبائي، وعدوى فيروس نقص المناعة البشرية على منصة التحليل الآلي. في خطوة ثانية، استخدم البروتوكول أثناء دراسة، التي أجريت على متعاطي المخدرات النشطة في المدن الألمانية في برلين واسن.

Introduction

أن فكرة استخدام الدم التي تم جمعها في بطاقة ورق مصنوع من السليولوز يعزى إلى إيفار المسيحية بانج (1869-1918)، الأب سليكية السريرية الحديثة^{1، 2}. في عام 1913، بانج القياسات النيتروجين الجلوكوز العزم من الواتس من الدم المجفف البقع (DBS)³ ، وفي وقت لاحق، يقوم أيضا باستخدام الأسلوب كيلدهل مع هذا الأسلوب تصفية ورقة². وفي وقت لاحق، أفادت العديد من المحققين على استخدام DBS للاختبارات المصلية لتشخيص مرض الزهري². كما مبكرا كما هو الحال في عام 1924، تشابمان تلخيص مزايا الاختبار DBS عندما شدد بخاصة البنود الأربعة، التي لا تزال صالحة اليوم: (1) فينيبونكتوري مقارنة بالتقليدية، أقل حجم الدم مطلوب وهذه الحقيقة الأكثر أهمية في طب الأطفال التشخيص؛ (2) جمع الدم بسيط وغير الغازية، وغير مكلفة؛ (3) أن خطر التلوث البكتيري أو انحلال الدم الحد الأدنى؛ ويمكن الحفاظ على DBS (4) لفترات طويلة مع تقريبا لا تدهور لتحليلها^{2، 4}. بالإضافة إلى استخدامه في اختبار للزهري، شملت كذلك من أوائل تطبيقات تقنية DBS، مثلاً، الكشف عن الأجسام المضادة ضد الحصبة والنكاف، وفيروس شلل الأطفال، والفيروسات باراينفلوينزا، والفيروس المخلوي التنفسي (RSV) في عام 1953²، تحديد دوسنتاريا في البراز المجفف على ورق الترشيح وشحنها بالبريد العادي من إندونيسيا ليدن في هولندا، فضلا عن الكشف عن الأجسام المضادة إلى بلهارسيه في DBS المتخذة في المناطق الموبوءة وتحليلها بعد أكثر من ثلاثة أشهر⁵ . في عام 1963، خمسون سنة بعد الانفجار في الأصل الاتصال^{2، 6}، وأخيراً غوثري نشر طريقته الشهيرة لتشخيص كيتون من DBS التي حصل عليها وخز كعب من حديثي الولادة^{7، 8}.

على الرغم من أن من ذلك الوقت فصاعدا، اعتبرت DBS أسلوب المطبقة عادة لجمع، تخزين، ونقل، وتحليل مجموعة متنوعة من سوائل الجسم البشري⁵، استخدامها في تشخيص لا تزال تركز أساسا على تشخيص التهابات خاصة في الأماكن المحدودة الموارد والفحص المنهجي للأطفال حديثي الولادة للاضطرابات الأيضية الموروثة لعقود^{9، 10}. منذ عام 2005، ومع ذلك، مجموعة متنوعة من التطبيقات الجديدة والمبتكرة DBS بدأت تظهر. وادي ذلك إلى زيادة عدد المنشورات العلمية الخاصة بكل منها على DBS من حوالي 50 إلى ما يقرب من 450 أسي تقريبا سنوياً في الوقت الحاضر. من بين التطبيقات المستجدة، مجالات متنوعة مثل توكسيكو-ودراسات الحرائك الدوائية التنميط الأيضية، ورصد العقاقير العلاجية، وعلم السموم الشرعي أو مراقبة التلوث البيئي^{10، 11}.

اختبار DBS، وهكذا، جعلت مسيرة النصر من خلال التشخيص المختبري السريري في الماضي 100 سنة². كما هو الحال في الكيمياء السريرية¹²، ومع ذلك، خلال هذه المسيرة المتغيرات قبل التحليلية لم على نحو كاف تعتبر لسنوات عديدة. وفي الواقع، حتى اليوم، بعد هذه الأنشطة البارزة لمركز السيطرة على الأمراض ورقة تصفية تقييم المشروع¹³ أو صياغة معيار وطني لجمع الدم على ورق الترشيح في الإطار الوليد فرز¹⁴، بالمرحلة التحليلية السابقة لا تزال إلى حد كبير مقومة في معظم ميادين أخرى، فيها اختبار DBS التطبيقية^{5، 10}.

في ضوء هذه الخلفية، يقترح بروتوكول خطوة بخطوة شامل^14-16 للاستخدام في تحديدكم والتقنيات الجزيئية، الذي يغطي كافة الخطوات الضرورية، لإعداد وتجهيز DBS في الرسالة التالية: (1) جمع الدم؛ (2) إعداد بقع الدم؛ (3) تجفيف بقع الدم؛ '4' تكاليف التخزين والنقل؛ (5) شطف DBS؛ وأخيراً (6) تحليل DBS الواتس. وكان تقييم فعالية البروتوكول أولاً مع أزواج يزوج 1,762 المصل/DBS للكشف عن التهاب الكبد الوبائي فيروس (HBV) للمستضد السطحي (HBsAg)، أجسام مضادة للأجسام المضادة لالتهاب للمستضد السطحي (مكافحة-HBs)، الحمض النووي HBV، HBV الأساسية مستضد (مكافحة-HBc)، الأجسام المضادة لفيروس التهاب الكبد الوبائي (سي) (مكافحة--سي)، اختبارات "سي الجيش الملكي النيبالي"، وفيروس نقص المناعة البشرية (فيروس الإيدز) 1-p24-مستضد/مكافحة-فيروس نقص المناعة البشرية 1/2 باستخدام منصة مؤتمتة بالكامل أو حساسية الحمض النووي النوعي. ¹⁷-في خطوة ثانية، واستخدم البروتوكول في الدراسة التجريبية "المخدرات والمعدية الأمراض المزمنة" ("دراسة دراك") الذي أجرى بمعهد روبرت كوخ-بالتعاون الوثيق مع "المركز الوطني للإشارة" لالتهاب الكبد الوبائي في نشطة متعاطي المخدرات في المدن الألمانية في برلين واسن¹⁸.

Protocol

منذ البروتوكول صمم للاستخدام في التشخيص الطبي، يجب أن تتبع تطبيق مبادئ "إعلان هلسنكي"¹⁹. في الجزء الأول من النتائج المعروضة في هذا البلاغ، كلا من اتفاق منفصل بالمرضى وموافقة لجنة أخلاقيات يبدو أن يمكن الاستغناء عنها لسببين: (1) "عند دخول" إلى مستشفى جامعة أسن، "يوفر كل مريض موافقة خطية لجميع التحقيقات اللازمة بالكيمياء الحيوية والبكتريولوجية والفيروسية. " ¹⁷ (2) "جميع العينات المستخدمة في تقييم الاختبار DBS أرسلت إلى معهد علم الفيروسات عملية التشخيص السريري الروتيني. وهكذا، أيا من العينات تم جمعها خصيصا لغرض الدراسة وأنجز لم فينيبونكتوري إضافية واحدة وأي من المواد التي تم اختبارها لأي معلمة غير تلك التي يطلبها الأطباء أثناء العادي عمل التشخيص إلى أعلى. " ¹⁷ تمت الموافقة على الدراسة "المخدرات والأمراض المزمنة المعدية" (دراسة دراك ")¹⁸، اختبار DBS أخيرا استخدمت فيها في المدن الألمانية في برلين واسن لتقييم الأشخاص الذين حقن المخدرات، بنشاط بالمفوض الاتحادي للبيانات حماية وحرية المعلومات (برلين، ألمانيا)، وكذلك كلجنة الأخلاقيات التابعة "مستشفى الشارتي الجامعة الطبية"، (برلين، ألمانيا).

1-جمع الدم

1. فينيبونكتوري^{14، 15، 20، 21}
   1. وضع قفازات مطاطية مطاط يمكن التخلص منها، وتنظيف منطقة الموقع المقصود ثقب (يفضل أن يكون ذلك متوسط المرفقي الوريد في الحفرة المرفقية) مع مطهر مناسب، مثلاً، وكحول الأيزوبروبيل 70%.
   2. تطبيق عاصبة من 4 – 6 بوصات فوق موقع ثقب المفترضة انتفخ الأوردة. توجيه الإبرة الوريد المريض، ومرة واحدة في المكان، بلطف ملء أنبوب الدم متصلاً، الذي يحتوي على يدتا تخثر الدم.
   3. بمجرد اكتمال فينيبونكتوري، الإفراج عن عاصبة وسحب الإبرة. ثم، اضغط وسادة شاش جافة على موقع الثقب، وبعد ذلك يمكن أن يعقد في المكان قبل ضمادة.
2. ثقب الجلد (الشكل 1A)^{13-15، 20، 22، 23}
   1. وضع على زوج من القفازات المطاطية مطاط يمكن التخلص منها.
   2. قبل ثقب الجلد، وينبغي أن الحارة المريض صفحته/صفحتها اليدين. الإصبع هو تدليك أنتيروجراديلي إثراء تدفق الدم نحو لموقع الثقب.
   3. تنظيف جلد الجانب المار من الأنصار القاصي طرف الإصبع الثالثة أو الرابعة من الجهة غير الكتابة بمطهر مناسب، مثلاً، وكحول الأيزوبروبيل 70%. ثقب الجلد بمجلة لانسيت سلامة تستخدم مرة واحدة. تعقد في مثل هذا موقف أن خطورة ويسهل جمع الدم في الإصبع الإصبع.
   4. عند الانتهاء من جمع الدم الشعرية بثقب الجلد، ضع ضمادة على طرف أصبعك.

2-إعداد بقع الدم

1. إعداد من الدم التي تجمعها فينيبونكتوري¹⁵
   1. بقعة الدم الوريدي كاملة مع (يدتا) تخثره مكافحة المجمعة على بطاقات تصفية أقرب. تعد بقع الدم المجفف أكثر من 24 ساعة بعد فينيبونكتوري.
   2. وضع كل المعلومات اللازمة للتعرف على المريض على بطاقة عامل التصفية. وينبغي أن رصدت بطاقة واحدة فقط مع دم شخص واحد.
   3. وضع قفازات مطاطية مطاط يمكن التخلص منها.
   4. برفق عكس أنابيب جمع الدم 2 – 4 مرات، وفي وقت لاحق فتح السدادة بعناية.
   5. نضح 50 ميليلتر من الدم الوريدي كله باستخدام ماصة مع تلميح المتاح. نقل الدم إلى مركز دائرة واحدة دون لمس الورقة عامل التصفية مباشرة مع تلميح الماصة. حاول أن تشبع تماما الدائرة.
   6. كرر هذا الإجراء لملء جميع الدوائر المطلوبة للبطاقة.
2. جمع إعداد من الدم بالجلد ثقب (الأرقام 1 باء و جيم 1)^{13-16، 23}
   1. تمحو أول قطره دم مع وسادة شاش لأنها قد تحتوي على سوائل الأنسجة الزائدة. تدليك الإصبع مرة أخرى لزيادة تدفق الدم في موقع الثقب. نقل القطرة التالية إلى إحدى دوائر بطاقة عامل التصفية دون ملامسة مباشرة مع الإصبع. السماح بالدم لتكون غارقة في نسيج التصفية قوات الشعرية فقط.
   2. واسمحوا الانخفاض الكبير القادم من شكل الدم الشعرية على طرف أصبعك وأنه جمع في الدائرة القادمة. متابعة هذا الإجراء حتى يتم ملء جميع الدوائر اللازمة أو توقف تدفق الدم.
   3. لا الضغط أو "الحليب" الإصبع مفرطة إذا كان تدفق الدم غير كافية لملء جميع دوائر بطاقة عامل التصفية المطلوب. إذا توقف تدفق الدم وضع ضمادة على طرف أصبعك. إجراء ثقب جلد ثاني على إصبع آخر إذا كان مطلوباً المزيد من الدم للفحص.

3-تجفيف بقع الدم

1. لتجفيف بقع الدم، وضع تصفية بطاقات على ورقة نظيفة منشفة في خزانة سلامة واقية والسماح لهم الجافة، ويفضل أن يكون O/N (ولكن على الأقل 4 ساعات)، في الرايت نظراً لعدم وجود أي مصدر خارجي للحرارة. عند اكتمال عملية التجفيف وبقع الدم بشكل موحد داكنة لون البنى ولا توجد مناطق حمراء مرئية بعد الآن (الشكل 1)،^{13، 15، 16}.

4-التخزين والنقل من بقع الدم المجفف (DBS)

ملاحظة: يمكن أن توقف تجهيز بقع الدم بعد التجفيف. بطاقات التصفية يمكن الآن المخزن^{13-16، 23}.

1. للتخزين، ووضع بطاقة ورق الترشيح في حقيبة السوستة وحيد والغاز كتيمة، التي تحتوي على 1 إلى 2 كيس المجففة لحماية العينات من الرطوبة (الشكل 1E). بشكل اختياري، أضف بطاقة مؤشر رطوبة.
2. نقل هذه الحقيبة لثلاجة بدرجة حرارة-20 درجة مئوية أو أقل وقت ممكن. إذا لم تتوفر الثلاجات الظروف الميدانية، الممكن تخزين-4 درجة مئوية أو حتى في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 14 يوما.
3. نقل العينات DBS المجمدة في الثلج الجاف. لتصفية بطاقات أبقى في البداية في درجة حرارة الغرفة، استخدم نظام تغليف ثلاثي، الذي يتكون من bag(s) سحاب container(s) الداخلية فضلا عن الداخلية ومغلف خارجي. لا تحمل علامات المحتوى مطلوبة في المحيط الخارجي للشحن بالبريد العادي ولكن يجب أن الملصقة رمز اقية الدولية ل الحاويات الداخلية الأولية¹⁶.
4. استبعاد البطاقات مرشح من مزيد من المعالجة إذا كانت حزم المجففة و/أو بطاقة مؤشر الرطوبة إضافية يتغير إلى لون وردي.

5-شطف الدم المجفف البقع^{13، 15، 16، 23}

1. لكمه على بقعة واحدة مع جهاز 6 مم من استخدام واحد من كل دائرة الدماء بطاقة تصفية الصف 903 (الشكل 1F). نقل جميع لكمات بقع الدم المجفف من مريض واحد لواحد من لوحة 12-جيدا جيدا.
2. سد البئر مع الفوسفات مخزنة المالحة التي تحتوي على 0.05% 20 توين و 0.08 في المائة أزيد الصوديوم (الشكل 1). التكيف مع حجم المخزن المؤقت إضافة إلى الحد الأدنى من المتطلبات الخاصة بكل منها للمقايسة المستخدمة للتحليل اللاحق الواتيس بقع الدم المجفف.
3. كرر هذه الخطوات للحصول على سلسلة ثانية من الواتس بقعة الدم المجفف من أجل إجراء التحليلات الجزيئية.
4. وضع لوحة الثقافة الخلية على شاكر مختبر وترك بقع الدم المجفف لكمات الوتي برفق للحد أدنى من الموارد البشرية 4، أو يفضل، O/N (الشكل 1 ح).
5. في اليوم التالي، البقع خالية تقريبا من الدم وقد شكلت supernatants الانحلالي (1I الشكل). نقل هذه الواتس لأنابيب ميكروسينتريفوجي. ثم إخضاعها للطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في س 10,500 ز (الشكل 1J) لتحرير سوبيرناتانتس من أي حطام قد شكلت خلال شطف (الشكل 1 K).

6-تحليل الواتس

1. الواتس تثفيل الآن جاهزة للاستخدام للتحليلات المقصود. التحقيق في الواتيس لعلامات لفيروس التهاب الكبد باء وفيروس التهاب الكبد الوبائي وفيروس نقص المناعة البشرية باستخدام أدوات متوفرة تجارياً واتباع تعليمات الشركات المصنعة كل منها بعناية (الشكل 1 لتر).

رقم 1- ملخص رسومي للبروتوكول المقترح في هذه الاتصالات من أجل إعداد وتجهيز بقع الدم المجفف استخدامها في تحديدكم والتقنيات الجزيئية. الدم كله وريدي والشعرية التي تم الحصول عليها أما من فينيبونكتوري أو ثقب الجلد مجلة لانسيت (A) قد تخدم كعينات لتحليل بقعة الدم المجفف. بعد نقل الدم إلى دوائر بطاقة تصفية 903 الصف (ب، ج)، العينات يجب أن تجفف يفضل O/N في درجة الحرارة المحيطة بسلامة واقية مجلس الوزراء على شكل بقع اللون البنى بالتساوي دون أي إينتيرسبيرسيون الأحمر المناطق (د). عند تجفيف بقع الدم كاملة والتخزين ضروري، يمكن تعبئتها بطاقات التصفية في الزمام الغاز كتيمة حقائب تحتوي على 1 – 2 كيس المجففة (E). كذلك تجهيز مختبر DBS تشمل توليد اللكمات بجهاز واحد استخدام 6 مم من وسط الدوائر (و، ز)، شطف اللكمات في المخزن مؤقت المستندة إلى برنامج تلفزيوني للحد أدنى من الموارد البشرية 4، أو يفضل، س/ن على شاكر (ح )، استرداد الواتيس (أنا)، وأخيراً استخدام الطرد المركزي الكؤوس المختبرية (ي) لتحرير الواتيس DBS من أي حطام قد نشأت أثناء عملية شطف (K). وفي وقت لاحق، الواتس DBS مستعدون للتحليلات التي أجريت بمنصة مؤتمتة بالكامل (L) من أجل كشف علامات المصلية للالتهابات HBV، سي، وفيروس نقص المناعة البشرية، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

النتائج

فعالية البروتوكول المقترح لإعداد وتجهيز DBS قيمت أولاً بتحليل 1,762 المصل/DBS يزوج أزواج لعلامات الإصابة بالتهاب، سي، وفيروس نقص المناعة البشرية. ¹⁷-لهذا الغرض، أعدت من 100 ميليلتر كله وريدي الدم (انظر النقاط 2.1.1 – 2.1.6 البروتوكول السابق) DBS وكانت الوتيد مع ميليلتر 1,000 على أساس برنامج تلفزيوني للمخزن المؤقت، كل منها (انظر النقاط 5.1 – 5.5 من البروتوكول المذكور أعلاه) لإتمام العملية لكل المعلمات السبعة في عمليتين منفصلتين. هذا نهج دون الأمثل عناية الشروط شطف لكل واحد من أكثر يبدو أمرا لا مفر منه لأنه كان يتوقع إنتاجية عالية بدلاً من نموذج في وقت قصير نسبيا أثناء الدراسة الميدانية القادمة "المخدرات والمزمنة الأمراض المعدية "(" دراسة دروك ").

جميع القياسات التقيد بتوصيات الشركة المصنعة خلال التحليلات DBS، لكنه اضطر إلى تعديل فيما يتعلق بقرارات HBsAg وميزانيات المناهضة لتعويض أثر انحلال الدم أو نتيجة لتمييع. بوقف إنتاج المواد الانشطارية قيمة 0.05 وحدة دولية/مل، عينات اختبار HBsAg DBS الواتس يؤدي إلى معدل إيجابيات كاذبة من 14.7% (52 من أصل 354) عند مقارنتها بالمصل (الشكل 2A). جهاز استقبال يعمل المميزة (ROC) تحليل^{25، 26} من البيانات أشارت إلى أن زيادة الحد الأدنى إلى 0.15 وحدة دولية/مل سيؤدي فصل HBsAg من إيجابيات مثالية من السلبيات HBsAg (0.986 [حساسية]، 0.000 [1-خصوصية]، الشكل 2). من ناحية أخرى، مع إنتاج 10 وحدات دولية/لتر للتحديد الكمي لميزانيات مكافحة تسجيل الأجسام المضادة كان معدل السلبية الكاذبة القياسات من 14.2 في المائة (47 من أصل 331) (الشكل 2). ومن ثم، بعد تحليل ROC مرة أخرى، خفضت هذا الوقف إلى 1.5 وحدة دولية/لتر تحقيقا تمييز أمثل للقيم (0.917 [حساسية]، 0.007 [1-خصوصية], الشكل 2D).

الشكل 2- HBsAg ومكافحة-ميزانيات اختبار في الواتيس DBS (معدلة من¹⁷)- زيادة قيمة الوقف للقياس الكمي HBsAg من 0.05 وحدة دولية/مل (A) إلى 0.15 وحدة دولية/مل الإرشادية ROC (ب) تخفيض معدل نتائج إيجابية كاذبة من 14.7 في المائة إلى 0%. وبالمثل، اقترح ROC تحليل ميزانيات مكافحة تركيزات انخفاض عتبة كل منهما من 10 وحدات دولية/لتر (ج) إلى 1.5 وحدة دولية/لتر (د) تماما وبالتالي القضاء على السلبيات الكاذبة، التي شكلت في البداية 14.2 في المائة من جميع القرارات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

ويرد في الجدول 1¹⁷نتائج التحاليل إلى جانب المصل/DBS. لم يسجل أي غير خصوصية أثناء DBS الاختبار لأي من التحاليل سبعة.

عندما جرى التحقيق DBS الواتيس لوجود HBsAg، أولاً هاء المعلمة الرئيسية المصلية للإصابة الحادة والمزمنة مع HBV، عازمة حساسية تحليلية 98.6 في المائة. وكانت تركيزات HBsAg في الأمصال السلبية زورا اثنين 749 وحدة دولية/مل و 6 وحدة دولية/مل، على التوالي. تم بنجاح الكشف عن الأجسام المضادة-HBc في 176 من أصل 204 (أولاً ه 86.3 ٪) DBS الواتس. اثنان وعشرون من أصل 28 العينات التي تم الكشف عنها لا بالقياسات نشأت من الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. وهكذا، إذا تم استبعاد الأفراد المصابين من الحساب، تحقق حساسية 97.1 في المائة لاسترجاع الأجسام المضادة-HBc من التيد الدم الوريدي كله المجففة. ملاحظات مماثلة عقد صحيح لتحديد الأجسام المضادة HBs. حتى بعد تعديل قيمة إنتاج الإنزيم إلى 1.5 وحدة دولية/لتر، وقع النتائج DBS المصل discrepant تسعة. في المرضى غير المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية، وجدت تركيزات المضادة HBs المصل من 11 – 26 وحدة دولية/لتر، التي كانت منخفضة للغاية للسماح للكشف بعد شطف الدم المجفف.

الأجسام المضادة-سي تعتبر مؤشرا أما العدوى الحادة أو المزمنة أو حلها. وحددت نتائج زورا السلبية-مكافحة فيروس التهاب الكبد جيم (أولاً هاء 2.2 في المائة) فقط أربعة من الواتس DBS وكذلك أثبتت التحاليل المصلية والجزيئية بوضوح جداً ربما اتخاذ سيرا كل من المرضى، والإصابات التي كانت منذ فترة طويلة حل.

تم الكشف عن الأجسام المضادة فيروس نقص المناعة البشرية في الواتس DBS مع النظام الآلي بالكامل عملية سلسة تماما التي أسفرت عن حساسية تحليلية 100%.

"تركيز الحمض النووي HBV يعني من الواتس الدم كله أجرى على عينات من 100 (يعني تركيز الحمض النووي: 1,573,898 وحدة دولية/مل، ومجموعة: < 357--> 17,860,000 وحدة دولية/مل) وأسفرت عن قيمة 93.0%. وهكذا، لم الكشف عن العينات السبعة مع تركيزات المصل منخفضا الحمض النووي HBV بين 409 و 3,643 وحدة دولية/مل قبل DBS اختبار. 100 سيرا الذي ثبت أنه "سي الجيش الملكي النيبالي" إيجابية (يعني تركيز "سي الجيش الملكي النيبالي": 1,415,944 وحدة دولية/مل، ومجموعة: 2,479--> 7,692,000 وحدة دولية/مل)، المقابلة الدم كله مختبرين كانت متاحة. التحقيق المقارن أسفر عن حساسية تحليلية 100% لقرارات "سي الجيش الملكي النيبالي" من الواتس DBS. " ¹⁷

استخدامه لاختبار البروتوكول المحدد لإعداد وتجهيز DBS الظروف الميدانية، بالتعاون الوثيق مع روبرت كوخ-المعهد (برلين، ألمانيا) خلال المرحلة التجريبية لدراسة "المخدرات والأمراض المزمنة المعدية"، الذي كان أجريت على متعاطي المخدرات النشطة في المدن الألمانية في برلين واسن¹⁸. خضع جميع المشاركين 534 المسجلين (433 الرجال والنساء 101) أخذ عينات الدم الشعرية كما هو موضح بالتفصيل في الأقسام 2.2.1 – 2.2.3 البروتوكول السابق، و DBS، مرة أخرى، الوتيد بإضافة ميليلتر 1,000 المخزن المؤقت المستند إلى برنامج تلفزيوني.

تم تشخيص اثنين من الأفراد أنهم مصابون بأمراض مزمنة HBV، و 39 وأظهرت المصلية عدوى التهاب حلها. وعلاوة على ذلك، خمسة عشر مشاركاً بإيجابية لمكافحة--هكسابايت (المركز بعد التلقيح) وثمانية تم العثور على أن تكون إيجابية لمكافحة--HBc وحدها. انتشار فيروس التهاب الكبد جيم-مكافحة بين المشاركين كان 57.3% (N = 193) في برلين و 73.0% (N = 144) في إيسن. عينات من الجسم-الإيجابية 65% (N = 125) و 62% (N = 89) كما كانت فيريميك. خمسة وعشرون من أصل الأفراد 534 اختبار إيجابية لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. تسعة عشر من الإصابات كانت معروفة بالفعل وشاركت المصابة بفيروس التهاب الكبد جيم 24 من هؤلاء الأفراد.

وقورنت النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق اختبار DBS بعناية مع بيانات المشاركين في الدراسة أنامنيستيك فيما يتعلق بالحالة المبلغ عنها ذاتيا HBV وفيروس التهاب الكبد جيم. هذه المقارنة بالاقتران مع نتائج الاختبار إلى جانب أزواج المصل/DBS أدت إلى إجراء تعديلات طفيفة من خوارزمية الاختبار للمرحلة الرئيسية من "الدراسة دراك" التي ستلتحق متعاطي المخدرات النشطة في ست مدن ألمانية كبيرة إضافية: "الأفراد المصابين سيتم اختبار فيروس نقص المناعة البشرية دائماً لوجود الحمض النووي HBV. المشاركين الذين الواتس DBS إيجابية بالنسبة HBc المضادة أو مكافحة ميزانيات ينبغي أن تتعرض فينيبونكتوري خلال مشاورة ثانية من أجل توضيح وضعهم المضادة-HBc/مكافحة-ميزانيات بالتأكيد، وأخيراً، سيعرض جميع DBS الواتس "الجيش الملكي النيبالي سي" بغض النظر عن نتائج اختبار سي المضادة ". ¹⁷

معلمات	يقترن سيرا/DBS الواتيس (N)	نتائج discrepant (N)	أسباب التباين بين اختبار المصل والواتس DBS
HBV
HBsAg	299	2	اثنين من المرضى بعدوى مزمنة HBV. سواء كانت تحت العلاج المضاد للفيروسات، وواحد منهم كان يشترك المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. HBsAg التركيزات في مصل الدم: 749 وحدة دولية/مل و 6 وحدة دولية/مل، على التوالي.
HBc المضادة	305	28	في مصل الدم، كان المرضى اثنان وعشرون من عدوى HBV حلها. وأظهرت ستة أفراد إيجاد المصلية "مكافحة-HBc وحدها". اثنان وعشرون من المرضى قد شارك المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. قيمت عشرين من "resolvers HBV"، كما "المضادة HBs الإيجابية وحدها" عن طريق اختبار DBS، وهكذا، زورا صنفت على أنها "حالة بعد التطعيم".
مكافحة--هكسابايت	310	9	أربعة المرضى غير المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية قد تركيزات مصل المضادة HBs 11 ‑ 26 وحدة دولية/لتر، التي كانت منخفضة للغاية للسماح للكشف عن الأجسام المضادة بعد شطف بقع الدم المجفف.
الحمض النووي HBV	150	7	قد تم الحصول على الأمصال الخاصة بكل منها من سبعة مرضى مع تركيزات الحمض النووي HBV المصل منخفضة تتراوح بين 409 وحدة دولية/مل 3,643 وحدة دولية/مل.
فيروس التهاب الكبد جيم
مكافحة--سي	339	4	لقد اتخذت هذه الأمصال أربعة من المرضى، مع فترة طويلة منذ حل سي التهابات.
سي الجيش الملكي النيبالي	150	0	-
فيروس نقص المناعة البشرية
فيروس نقص المناعة البشرية 1-p24/مكافحة-فيروس نقص المناعة البشرية 1/2	209	0	-

الجدول 1: النتائج التي تم الحصول عليها من 1,762 دي بي إس، التي أعدت ومعالجتها من الدم الوريدي كلياً بعد البروتوكول المقترح في هذه الاتصالات، مقارنة بالنتائج التي توصل إليها في عينات المصل إلى جانب كمرجع.

Discussion

DBS قد استخدمت لسنوات 100² ، لكن المثير للدهشة، لا يزال هناك لا توافق عام في الآراء حول إعداد وتجهيز. وحتى الآن، توحيد كافية في هذه المرحلة التحليلية السابقة الهامة فقط قد أحرز في مجال فحص حديثي الولادة¹⁴، بينما توجد مجموعة متنوعة من البروتوكولات المختلفة لكافة التطبيقات الأخرى من DBS الاختبار^{5، 16، 23}. للتغلب على هذا التباين الملحوظ، المعروضة في هذا البلاغ تعليمة خطوة بخطوة شاملة لإعداد وتجهيز DBS أن تستخدمها في تحديدكم والتقنيات الجزيئية وتقييمها فيما يتعلق بفعالية للكشف عن علامات الإصابة بالتهاب، سي، وفيروس نقص المناعة البشرية. المناقشة التالية هي أساسا التركيز على الخطوات المختلفة للبروتوكول المقترح.

في تاريخ DBS اختبار ورقة تصفية مختلفة العديد من بطاقات تستخدم² ولكن اليوم سوى اثنين من مصادر تجارية تحظى بموافقة إدارة الأغذية والعقاقير كالفئة الثانية الأجهزة الطبية لجمع الدم^{5، 16}. أنظمة بطاقة تصفية هذه الغاية موحدة ويكون استيعاب خصائص مشابهة جداً بحيث لا تختلف النتائج التحليلية التي تم الحصول عليها من الدم الشعرية التي أعدت في أي منهما بأكثر من 4%-5%²⁸. وليس من المستغرب، ماسسيوترا وزملاء العمل²⁹ ولذلك تم الكشف عن فيروس نقص المناعة البشرية-1 "الجيش الملكي النيبالي" جيدا على قدم المساواة مع تحليل نوعي بعد شطف من بطاقات جمع الدم من مصادر مختلفة. نظراً لهذه البيانات، فإنه يمكن عمليا استبعاد أن أي من التناقضات ولاحظ عند اختبار اقتران أزواج المصل/DBS لعلامات من HBV، سي وكان سببه عدوى فيروس نقص المناعة البشرية¹⁷ اختيار بطاقة تصفية وحدها. ومع ذلك، عند دقة التحديد الكمي لأكثر أمر لا غنى عنه، يعد التباين المصدر للمصدر قد لا يعتد بها وتقنيات أكثر تطورا، مثلاً، مثقب DBS (بدبس) كأسلوب ميكروسامبلينج³⁰ أو إعداد بقع المصل المجففة قد (DSS)³¹ لتطبيقها بدلاً من التقليدية DBS اختبار¹⁰.

حيث تستخدم كميات صغيرة فقط من الدم لاختبار DBS (قطره واحدة من الدم الشعرية تتكون من حوالي 50 ميليلتر)^{5، 16}، الاختلافات في حجم العينة الحاسمة، ومن المسلم به أن على الأقل بعض الاختلافات بين النتائج المصلية وذكر مشارك الذاتي HBV وفيروس التهاب الكبد جيم حالة سجلت خلال تجريب "دراسة دراك" تعزى إلى هذا المتغير. أهم عامل للتقليل إلى أدنى حد "تقلبات" حجم العينة هو بلا شك أسلوب صحيح لجمع الدم الشعرية، التي يمكن أن يتحقق إلا بتدريب الموظفين التقنيين²²دقيقة ومستمرة. وعلاوة على ذلك، كتدبير من تدابير مراقبة الجودة، وجميع المختبرات العاملة مع DBS ينبغي قد شرعت إجراءات لتحديد، وفي وقت لاحق باستثناء DBS العينات التي قد تعتبر غير مرضية أو غير صالح¹⁶.

دراسات تجري أساسا في سياق فيروس نقص المناعة البشرية³² وفحص الوليد³³ أظهرت أن ارتفاع نسبة الرطوبة قد يؤدي إلى تدهور لتحليلها، ولكن حتى الآن تم التوصل إلى أي توافق في الآراء بشأن مسألة كم من الوقت ينبغي أن يكون DBS الهواء المجفف . فاصل على الأقل 4 ساعة أو يفضل أن يقترح O/N في هذه الرسالة، التي اعتمدت لذلك الشروط التي استخدمت في الغالبية العظمى من جميع المنشورات ذات الصلة^{32، 34} البيانات في التخزين DBS لاستخدامها في وقت لاحق HBV وفيروس التهاب الكبد جيم اختبار تكون متعارضة. في عام 1981، وفيلا وزملاء العمل³⁵، الذي يطبق التقنيات التحليلية المعاصرة، أفادت أن التخزين في الرايت لا تؤثر نتائج التحاليل HBV أثناء فترة المراقبة كامل لمدة 180 يوما إذا كان جسم التتر > 1/1,000، ولكن ذلك DBS وأصبح الشريط الحدودي-الإيجابية أو السلبية حتى بعد 15 يوما عندما كان التتر في مصل الدم فقط 1/100. التخزين في-20 درجة مئوية أو 4 درجات مئوية لم تسفر عن تحسن كبير. وفي المقابل، إجراء دراسة ثلاثين عاماً يتطابق لاحقة³⁶ اختبار عينة HBV-إيجابية، ووجد الباحثون أن مكافحة-HBc، فضلا عن الأجسام المضادة-ميزانيات كانت مستقرة ليصل إلى 183 يوما في الرايت، بينما أصبح HBsAg نفس الظروف السلبية الكاذبة فعلا بعد 63 يوما. وفيما يتعلق بالكشف عن الحمض النووي HBV من الواتس DBS، تركيز الحمض النووي الفيروسي مستقرة لمدة سبعة أيام على الأقل في³⁷ من 37 درجة مئوية أو ثبت أن "مقاومة" لتخزين في RT لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع³⁸. اختبار الأجسام المضادة لفيروس التهاب الكبد جيم-مكافحة استخدام اثنين من الجيل الثالث المتاحة تجارياً تحديدكم³⁹ تقدم نتائج دقيقة لفترة 117 يوما باستخدام عينات DBS المخزنة في-20 درجة مئوية، 2 – 8 درجة مئوية ومن 20-25 درجة مئوية، على التوالي. ومع ذلك، أدى التخزين في-20 درجة مئوية، أدنى اختلاف الكثافة البصرية. تطبيق مكافحة جيل الرابع-سي إليزا، أي، مونوليسا سي-جي-Ab-الترا، في سياق DBS اختبار، لارات et al. ⁴⁰ لوحظ انخفاض حاد في الدقة التحليلية بعد تخزين العينات DBS لأكثر من ثلاثة أيام في الرايت من ناحية أخرى، تم الحصول على نتائج اختبار دقيقة مع هذه المجموعة نفسها استخدام العينات التي أودعتها برانداو وزملاء العمل⁴¹لمدة 60 يوما تحت ظروف مختلفة (-20 درجة مئوية، 2 – 8 درجة مئوية، و 22-26 درجة مئوية). ملاحظات بشأن الانخفاض تركيزات "سي الجيش الملكي النيبالي" في DBS تحت ظروف التخزين المختلفة تتراوح بين لا تغيير كبير في الرايت لتصل إلى واحد سنة⁴² إلى تغيير عشرة إضعاف بعد أربعة أسابيع في درجة الحرارة المحيطة⁴³. أخذ هذه البيانات المتضاربة بدلاً من ذلك على الاستقرار في HBV ومولدات المضادات سي والأحماض النووية والأجسام المضادة في الاعتبار، يبدو من المعقول تتراجع في البروتوكول المقترح إلى توافق في آراء، التي تم تعريفها مسبقاً لتخزين العينات DBS ستستخدم فيروس نقص المناعة البشرية اختبار^{15، 30}: لترسب قصيرة الأجل (تصل إلى أسبوعين) مولدات المضادات، والحمض النووي الفيروسي، والأجسام المضادة تعتبر مستقرة في الرايت، بينما يتم التخزين الأمثل لفترات أطول في ظروف المجمدة.

كقاعدة عامة، ينبغي النظر المعلمات الثلاث عند تصميم بروتوكولا شطف: (1) شطف المخزن المؤقت؛ (2) المدة ودرجة الحرارة من شطف؛ و (3) حجم شطف²³. في الغالبية العظمى من جميع المنشورات ذات الصلة مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) استخدمت التينج DBS، ومعظم المؤلفين بإضافة البروتين، مثلاً، ألبومين المصل البقري (BSA) أو توين 20، خافض للتوتر السطحي، بغية تحسين إشارة المقايسة باستقرار البروتينات، كما أنها تذهب إلى الحل، وفي نفس الوقت حظر مواقع غير محددة ملزمة²³. فقط بعض التقارير، مقارنة مباشرة مخازن شطف مختلفة في سياق اختبار DBS، متاحة. فيلار et al. ³⁶، مثلاً، سجلت قدرات شطف معادل تقريبا لكافة المخازن المؤقتة استخدامها، ولكن برنامج تلفزيوني/جيش صرب البوسنة أدت إلى 0.5% في أدنى مستوى من مفاعليه غير محددة. وأدلى ملاحظة مماثلة جداً مطعمة وزملاء العمل⁴⁴ عند تطبيق مخفف عينة من "أنظمة الوراثة" رلاف تقييم الأثر البيئي شطف الأجسام المضادة-سي من DBS. نظراً لخطر تدهور العينة منخفض للغاية في الساعات الأولى بعد إعداد DBS (انظر أعلاه)، تقرر لاحتضان البقع O/N في درجة حرارة الغرفة ودعم عملية شطف بخلط النهاية أكثر لطيف. ويمتاز هذا النهج أن العينات اللكم خارج السابقة يوم يمكن مباشرة نقل للتشخيص الروتيني مبكرا صباح اليوم التالي²³. وينبغي تكييف حجم المخزن المؤقت شطف للحد الأدنى من المتطلبات الخاصة بكل منها من الاختبارات المستخدمة للتحاليل اللاحقة بغية إبقاء عامل إضعاف منخفضة قدر الإمكان. ومع ذلك، تحسين عناية الشروط شطف لكل واحد من أكثر لم يكن ممكناً في التقييم السابق سبب عينة عالية إنتاجية يجب أن تكون مضمونة في وقت قصير نسبيا خلال "دروك دراسة"¹⁷. ونتيجة لذلك، كان استخدام وحدة التخزين غير مواتية بدلاً من 1,000 ميليلتر من المخزن المؤقت المستند إلى برنامج تلفزيوني بغية استكمال عملية شطف كامل لجميع المعلمات في عمليتين منفصلتين.

يفشل هذا النهج واحد، من الناحية "تماما في نظام مكافحة-HBc/مكافحة-ميزانيات لأولئك الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية نتيجة لتركيزات منخفضة من الأجسام المضادة؛ ... وأنها تتطلب إجراءات البيولوجية الجزيئية مع حساسية تحليلية الأمثل فيما يتعلق بالحمض النووي HBV واختبارات "الحمض النووي الريبي سي". " ¹⁷ ، من ناحية أخرى، حجم شطف عالية ثبت في أي شكل من الأشكال غير مؤات لتحديد HBsAg، سي المضادة، ومكافحة فيروس نقص المناعة البشرية بمجموعات المواد المستخدمة في التقييم. "الكشف عن مواد إيجابية من الواتس الدم كله نجح مع حساسية 98.6 في المائة إلى درجة عالية وبالمثل كما هو الحال في الدراسات السابقة، التي استخدمت في جزء وحدة تخزين شطف أصغر بكثير من 100 ميليلتر أو 250 ميليلتر، أو ميليلتر 600 أو 500 ميليلتر HBsAg"^{17 ،36، 45، 46}. حساسية 97.8 في المائة تحدد في التحقيق في 179 المصل/DBS أزواج للأجسام المضادة-سي تتفق مع النتائج الموجودة بالفعل تقارير^{24، 44، 47، 48، 49}، التي عملت مع وحدة تخزين شطف كان أقل بمقدار 5 إلى 10. "وباﻹضافة إلى ذلك، البروتوكولات للكشف عن فيروس التهاب الكبد جيم-مكافحة قد تم على النحو المناسب الأمثل... إذ ينص على نقاط وقف إنتاج المواد الانشطارية الخاصة بهم"،^{17، 24، 48، 49} "أو عن طريق زيادة حجم العينة من 20 ميكروليتر إلى 100 ميليلتر." ^{17، 49} وأخيراً، خصوصية التحليلية وحساسية (100% كل) المنشأة للكشف عن مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية كانت مساوية أو متفوقة على خصائص الأداء لتحديدكم الأخرى على وجه التحديد تتكيف DBS اختبار^{50، 51} "أو تدريجي الإجراء مع الاستخدام المشترك للعديد من الاختبارات لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية "^17،52. "أنهم، في الواقع، كما تجاوز سجل الأداء المقايسة التي أعدت خصيصا والأمثل للكشف عن الأجسام المضادة فيروس نقص المناعة البشرية في الواتس DBS (س-منع فيروس نقص المناعة البشرية 1 + 2 طقم DBS)." ^{17, 53}  

أخذت معا، البروتوكول خطوة بخطوة شامل المعروضة في هذا البلاغ أثبت أنه أداة مجدية وسهلة الاستخدام لإعداد وتجهيز DBS و، وهكذا، يمكن استخدام موثوق في علم الفيروسات التشخيصي. يسمح نهج استخدام أتمتة ⁵⁴ ، ونظرا لخصائصها الأداء الممتاز وقد يمكن أن تكون بمثابة نوع من حجر الأساس لبروتوكول مستقبل توافق آراء مقبولة عموما في ميدان العالمية DBS التجارب في المختبرات الطب.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Latex rubber gloves	Hartmann	#4049500041515
70% isopropyl alcohol	Bode Chemie	#9768050
Mulifly safety cannula	Sarstedt	#85.1638
EDTA blood collection tube	Sarstedt	#02.1066.001
Adhesive bandage	Hartmann	#2994163
Dry gauze pad	Hartmann	#143213
Singel-use safety lancet	Owen Mumford	#3802421
Filter paper card	Whatman/sigmaaldrich	#10534612	Filter paper card Grade 903
Disposable pipette tips	Starlab	#S1126-7810, #S1120-8810
Zipper bag	Flexico	#20219
Mini desiccant bag	Tropack	#-
Disposable Punch	pfmmedical	#48601	6.0 mm Disposable Biopsy Punch
Disposable Forceps	Servoprax	#H7301
12 Well Cell Culture Plate	Greiner	#665180
PBS Buffer	Gibco	#14190-136
Tween 20	Applichem	#A1389.0500
Sodium Azide	Merck	#66880250
Safe-Lock Tubes, 1.5 ml	Eppendorf	#30120086
ARCHITECT HBsAg (Quantitative)	Abbott	#6C3642
ARCHITECT anti-HBc II	Abbott	#8L4425
ARCHITECT anti-HBs	Abbott	#7C1825
ARCHITECT anti-HCV	Abbott	#6C3725
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo	Abbott	#4J2727
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit	Roche	#6374891001
artus HBV LC PCR Kit	Qiagen	#4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)
VERSANT HCV TMA Assay IVD	Siemens Healthcare	#2554311