Kurumuş kan lekeleri - hazırlanması ve uzun ve moleküler teknikleri kullanmak için işleme

Özet

Hazırlama ve işleme için onların son tahlilde kurumuş kan noktalar (DBS) hala kötü çoğu tanılama uygulaması standardize edilmiştir. Bu eksiklik üstesinden gelmek için kapsamlı adım adım iletişim kuralı önerdi ve daha sonra işaretleri viral enfeksiyonların algılama etkinliği ile ilgili olarak değerlendirildi.

Özet

Bir kağıt kartta kan toplanması ve daha sonra kurumuş kan lekeleri (DBS) bir asır önce kaynağı tanılama amacıyla kullanarak fikri. O zamandan beri DBS test onlarca yıl ağırlıklı olarak kalmıştır için kaynak sınırlı ayarları'nda özellikle bulaşıcı hastalıkların tanı odaklı veya sistematik yenidoğan için kalıtsal metabolik bozukluklar, eleme ve sadece son zamanlarda çeşitli var yeni ve yenilikçi DBS uygulamaları ortaya çıkmaya başladı. Uzun yıllar boyunca, önceden analitik değişkenleri yalnızca uygunsuz DBS test ve bugün bile, Yenidoğan tarama, hazırlık oluşur tüm önceden analitik faz ve DBS için işleme alanında kabul edildi onların Son tahlilde standart değil. Bu arka plan göz önüne alındığında, al temel aşamaları kapsar, kapsamlı bir adım adım protokol, Yani, kan toplanması önerilmiştir; kan lekeleri hazırlanması; kan lekeleri kurutma; depolama ve nakliye için-DBS; elüsyon DBS ve nihayet DBS eluates analizleri. Bu iletişim kuralı etkinliğinin ilk işaretleri Hepatit B virüsü, hepatit C virüsü ve human Immunodeficiency virus enfeksiyonları otomatik bir analitik platformunda algılamak için 1,762 eşleşmiş serum/DBS çiftleri ile değerlendirilmiştir. İkinci adımda, protokol aktif uyuşturucu kullanıcıları Berlin ve Essen Alman kentleri yapılmıştır bir pilot çalışma sırasında kullanılmıştır.

Giriş

Selüloz yapılan bir kağıt kartına toplanan kan kullanma fikri Ivar Christian Bang için (1869-1918), modern klinik microanalysis^{1, 2}babası atfedilen. 1913 yılında Bang glikoz Kjeldahl yöntemi ile bu filtre kağıdı tekniği²kullanarak da gerçekleştirilen eluates kurumuş kan lekeleri (DBS)³ ve daha sonra azot ölçüleri üzerinden belirlenir. Daha sonra birkaç müfettişler frengi²teşhis etmek için serolojik test etmek için DBS kullanımı bildirdi. Erken 1924'te olduğu gibi DBS test avantajları Chapman özetlenen ne zaman o özellikle vurguladı bugün hala geçerli olan dört öğeler: (1) kıyasla geleneksel iz, az kan hacmi gereklidir ve bu gerçeği Pediatrik içinde en önemli Tanılama; (2) kan toplama basit, olmayan invaziv ve ucuz değildir; (3) bakteriyel kirlenme veya hemoliz riskini en az düzeydedir; ve (4) DBS analitler^{2, 4}neredeyse hiçbir bozulma ile uzun süre korunabilir. Frengi için test kullanımı yanı sıra, DBS tekniği daha da erken uygulamaları, örneğin, kızamık, kabakulak, poliovirus, parainfluenza virüs ve respiratuar sinsisyal virüs (RSV) karşı antikor tespiti 1953²' de bulunan, Shigella tanımlaması dışkı içinde filtre kağıdı kuru ve normal posta yoluyla--dan Indonesia endemik bölgelerde alınan ve üç aydan fazla daha sonra analiz DBS^{5 Schistosoma antikorlar tespiti yanı sıra Hollanda Leiden sevk} . 1963 yılında, elli yıl sonra yerini özgün iletişim^{2, 6}, Guthrie Fenilketonüri topuk hıyar yenidoğan^{7, 8}tarafından elde edilen DBS gelen tanı için ünlü onun yöntemi sonunda yayınlandı.

Her ne kadar o zamandan itibaren DBS toplamak için yaygın olarak uygulanabilir bir yöntem olarak kabul edildi, depolama, taşıma ve insan vücut sıvıları⁵, çeşitli analiz kullanımları teşhis hala ağırlıklı olarak tanısında üzerinde duruldu kaldı enfeksiyonları özellikle içinde kaynak sınırlı ayarları ve yenidoğan yıl^{9, 10}için kalıtsal metabolik bozukluklar için sistematik tarama. 2005 yılından bu yana, ancak, çeşitli yeni ve yenilikçi DBS uygulamalar başlamıştır ortaya. Bu ilgili bilimsel yayınlardan DBS üzerinde yaklaşık 50 neredeyse 450 sayısını neredeyse üstel artış her yıl şu anda sonuçlandı. Gelişmekte olan uygulamalar arasında böyle toxico - ve farmakokinetik uygulama, metabolik profil oluşturma, tedavi edici ilaç izleme, adli toksikoloji veya çevresel kirlenme kontrolü^{10, 11}olarak farklı alanlardır.

DBS test böylece, yapılan klinik laboratuvar teşhis aracılığıyla bir zafer yürüyüşü geçmişte sırasında 100 yıl². Klinik kimya¹²olduğu gibi Ancak, bu yürüyüş sırasında önceden analitik değişkenleri yeterince uzun yıllar kabul edildi değil. Gerçekten de, bugün bile, CDC filtre kağıdı değerlendirme projesi¹³ veya filtre kağıdı Framework üzerinde kan topluluğu¹⁴, önceden analitik aşama eleme yenidoğan için ulusal bir standart formülasyonu olarak seçkin böyle etkinliklere sonra hala DBS test uygulanan^{5, 10}olduğu diğer alanların çoğunda büyük ölçüde gözardı durumda.

Bu arka plan göz önüne alındığında, tüm temel adımları kapsar, kullanmak uzun ve moleküler teknikleri, kapsamlı adım adım protokolü^14-16 hazırlama ve DBS aşağıdaki iletişim içinde işlemek için önerilmektedir: (1) kan toplama; (2) kan lekeleri hazırlanması; (3) kan lekeleri kurutma; (4) depolama ve taşıma; (5) DBS elüsyon; ve son olarak (6) analizleri DBS eluates. İletişim kuralı etkinliğinin ilk 1,762 eşleşmiş serum/DBS çiftiyle Hepatit B virüsü (HBV) yüzey antijeni (HBsAg), HBV çekirdek antijen (anti-HBc), HBV yüzey antijeni (anti-HBs), HBV DNA, antikor antikor algılamak için değerlendirildi antikorlar Hepatit C virüs (HCV) (anti-HCV), HCV RNA ve insan immün yetmezlik virüsü (HIV) 1-p24-antijen/anti-HIV 1/tam otomatik platform veya hassas nitel nükleik asit kullanarak 2 testleri. ¹⁷. İkinci adımda, pilot çalışma "uyuşturucu ve kronik enfeksiyon tarafından Robert Koch-Enstitüsü yakın işbirliği içinde ulusal başvuru Merkezi ile aktif Hepatit C için yapılmıştır hastalığa" ("DRUCK çalışma") iletişim kuralı kullanılmıştır Berlin ve Essen¹⁸Alman şehirlerde uyuşturucu kullanıcıları.

Protokol

Protokol tıbbi teşhis kullanılmak üzere tasarlanmış olduğundan, uygulama Helsinki Bildirgesi¹⁹ilkeleri takip gerekir. Sonuçları bu iletişimde sunulan ilk bölümü için hem hastalar tarafından ayrı bir anlaşma ve bir Etik Komitesi tarafından onaylandıktan iki nedenden dolayı gereksiz gibi görünüyordu: (1) "üzerine kabul" Essen Üniversitesi Hastanesi, "sağlar her hasta için yazılı izni tüm gerekli biyokimyasal, bakteriyolojik ve virolojik İncelemeler için." ¹⁷ (2) "DBS test değerlendirme kullanılan tüm örneklerini Enstitüsü Viroloji rutin klinik tanı sürecinde gönderildi. Böylece, özellikle çalışma amacıyla toplanan örneklerin hiçbiri değil tek bir ek iz gerçekleştirilmiş ve malzemelerin hiçbiri normal sırasında hekimler tarafından gerekli olanlar dışında herhangi bir parametre için test edildi Tanılama iş-up." ¹⁷ "Uyuşturucu ve kronik enfeksiyon hastalıkları" (çalışma DRUCK")¹⁸DBS test sonunda Alman şehirleri Berlin ve Essen aktif uyuşturucu enjekte insanlar değerlendirmek için kullanıldığı, çalışma tarafından veri Federal Komiseri kabul edildi Koruma ve özgürlük bilgi (Berlin, Almanya) ve de Tıp Üniversitesi Charité (Berlin, Almanya) Etik Komitesi gibi.

1. kan toplanması

1. İz^{14, 15, 20, 21}
   1. Tek kullanımlık lateks lastik eldiven takmışım ve bir uygun dezenfektan, örneğin, % 70 izopropil alkol ile amaçlanan ponksiyon sitenin (tercihen medyan kübital ven kolundaki fossa) alan temiz.
   2. Sargı bezi 4-6 santim üzerinden sözde ponksiyon damarları distend siteye uygulanır. Hastanın damar içine iğne rehberlik ve bir kez o yerde, bir antikoagülan olarak EDTA içeren bağlı kan tüpü yavaşça doldurun.
   3. İz tam olduğu gibi Turnikeyi serbest bırakmak ve iğne çekilme. Sonra bir kuru gazlı bez yastık yerde bir bandaj tarafından daha sonra yapılacak ponksiyon sitede tuşuna basın.
2. Cilt ponksiyon (şekil 1A)^{13-15, 20, 22, 23}
   1. Bir çift tek kullanımlık lateks lastik eldiven koymak.
   2. Cilt delik önce hasta seçtiğin bu kullanıcı eller sıcak. Parmak masaj anterogradely kan akımı doğru site kestiği zenginleştirin var.
   3. İpucu distal falanks üçüncü veya dördüncü parmak bir uygun dezenfektan, örneğin, % 70 izopropil alkol sigara yazma el palmar tarafında deri temiz. Cilt tarafından tek kullanımlık Emanet lanset delik. Parmak yerçekimi parmak ucu kan toplanmasını kolaylaştırır böyle bir konumda tutulmalıdır.
   4. Cilt ponksiyon tarafından kapiller kan toplama işleminiz bittiğinde, bir bandaj parmak ucu yerleştirin.

2. kan lekeleri hazırlanması

1. İz¹⁵ tarafından toplanan kan gelen hazırlık
   1. Toplanan anti-pıhtılaşmış (EDTA) bütün Venöz kan filtre kartlarında en kısa zamanda nokta. Kurumuş kan lekeleri 24 saat daha fazla iz sonra hazırlamak değil.
   2. Tüm bilgileri gerekli hasta tanımlanması için filtre karttan. Bir kart sadece tek bir kişinin kanı ile görmüş gerekirdi.
   3. Tek kullanımlık lateks lastik eldiven takmışım.
   4. Kan toplama tüp 2-4 kez yavaşça tersine çevirin ve daha sonra tıpa dikkatlice açın.
   5. Bütün Venöz kan bir pipet ile tek kullanımlık bir ucu kullanarak 50 µl Aspire edin. Kan filtre kağıt pipet ucu ile doğrudan temas etmeden bir dairenin Center'a aktarın. Tam daire emdirmek çalışın.
   6. Kartın tüm gerekli Çemberleri doldurmak için bu yordamı yineleyin.
2. Hazırlık kandan cilt tarafından toplanan (rakamlar 1B ve 1 C)^{13-16, 23} ponksiyon
   1. Aşırı doku sıvılarının içerebileceğinden ilk damla kan ile bir gazlı bez yastık yok etmek. Tekrar ponksiyon sitesinde kan akışını arttırmak için parmak masaj. Aşağıdaki açılan bir filtre kartı dairelerin birine parmak ucu doğrudan yüzeyle temas etmeden aktarın. Kan kılcal kuvvetler tarafından filtre doku batırılmış izin.
   2. Kılcal kan form üzerinde parmak ucu sonraki büyük damla izin ve sonraki çemberde toplamak. Bu yordam tüm gerekli Çemberleri dolu veya kan akışını durdurur kadar devam.
   3. Sıkmak veya "parmak aşırı kan akımı filtre kartı tüm gerekli Çemberleri doldurmak için yeterli değilse sağ" değil. Kan akışını durdurur, parmak ucunda bir bandaj koyun. Daha fazla kan sınav için gerekirse ikinci bir cilt ponksiyon başka bir parmağında gerçekleştirin.

3. kan lekeleri kurutma

1. Kan lekeleri kuru için tercihen O/N kartları temiz bir kağıt havlu bir biohazard güvenlik kabini ve onlara kuru, filtre koymak (en az 4 için gönderilen), RT ısı herhangi bir dış kaynak yokluğu. Kurutma işlemi tamamlandığında, düzgün koyu kahverengimsi renk kan lekeleri var ve hiç kırmızı alanı görülebilir (şekil 1 d)^{13, 15, 16}.

4. depolama ve nakliye için-kurumuş kan lekeleri (DBS)

Not: Kan lekeleri işlenmesi kuruduktan sonra durdurulabilir. Filtre kartları-ebilmek şimdi var olmak saklı^{13-16, 23}.

1. Muhafazası için filtre kağıdı kartı örnekler (şekil 1E) nemden korumak için 1-2 nem alıcı paketler içeren bir tek, gaz geçirmez fermuarlı torbaya koyun. İsteğe bağlı olarak, bir nem göstergesi kartı ekleyin.
2. Bu çanta bir dondurucu bir sıcaklığı-20 ° c ile transfer veya en kısa zamanda azaltmak. Dondurucular alan koşullar altında kullanılabilir değilse, depolama-4 ° C'de veya ortam sıcaklığında bile 14 gün için mümkün olabilir.
3. Kuru buz dondurulmuş DBS numune taşıma. Başlangıçta ortam sıcaklığında muhafaza filtre kartları için fermuar bag(s) iç container(s) yanı sıra bir iç ve bir dış zarf oluşan bir üçlü paket yönetim sistemi kullanın. Hiçbir içerik işaretler normal posta yoluyla sevk irsaliyesi için dış zarfta gereklidir ama uluslararası biyolojik tehlike sembolü için birincil iç kapsayıcı¹⁶yapıştırılmış olmalıdır.
4. Nem alıcı paketleri ve/veya ek nem göstergesi kartı için pembe bir renk değişirse daha fazla işleme filtre kartları hariç.

5. elüsyon kurumuş kan,^{13, 15, 16, 23} Spotlar

1. Bir noktaya her kan içindeki daire sınıf 903 filtre kartı (şekil 1F) tek kullanımlık 6 mm aygıtıyla yumruk at. Transfer tüm 12-şey plaka bir kuyu kurumuş kan noktalar tek bir hastadan yumruk attı.
2. Kuyu % 0.05 arası 20 ve %0,08 sodyum azid (şekil 1G) içeren serum fosfat tamponlu doldurun. Kurumuş kan lekeleri eluates daha sonraki analiz için kullanılan testin en az ilgili gereksinimleri için eklenen arabellek hacmi uyum.
3. Kurumuş kan spot eluates ikinci bir dizi moleküler analizleri gerçekleştirmek için elde etmek için bu adımları yineleyin.
4. Bir laboratuvar shaker hücre kültür plaka koymak ve yavaşça en az 4 saat boyunca elute delikli kurumuş kan lekeleri izin veya tercihen, O/N (şekil 1 H).
5. Ertesi gün, noktalar kandan neredeyse ücretsiz ve hemolitik supernatants (şekil 1I) oluşturdular. Bu eluates microcentrifuge tüpler için transfer. O zaman, onları Santrifüjü 10.500 x g (şekil 1J) supernatants (şekil 1 K) elüsyon sırasında oluşmuş herhangi bir enkaz üzerinden ücretsiz için de 2 min için tabi.

6. Eluates analizi

1. Centrifuged eluates şimdi amaçlanan çözümlemeler için kullanılmak üzere hazır. Eluates Hepatit B virüsü, hepatit C virüsü ve piyasada Kitleri kullanarak HIV enfeksiyonu işaretçileri için araştırmak ve ilgili üreticilerin yönergeleri dikkatle izleyin (şekil 1 L).

Şekil 1. Protokolü'nün grafik Özet teklif hazırlama ve işleme kurumuş kan noktalar uzun ve moleküler teknikleri tarafından kullanılmak üzere bu iletişimde. Bütün Venöz kan ve kapiller kan iz ya da deri ponksiyon lanset(a)tarafından elde edilen kurumuş kan spot analiz için numune olarak hizmet verebilir. Kan bir sınıf 903 filtre kartı (B, C) daireler için aktarımdan sonra örnekleri tercihen O/N, ortam sıcaklığında bir biohazard güvenlik formu noktalar eşit olarak kahverengi bir renk kırmızı herhangi bir interspersion olmadan kabine kurutulmuş alanları (D). Ne zaman, kurutma kan lekeleri tamamlandığında ve depolama gereklidir filtre kartları 1 – 2 nem alıcı paketler (E) içeren gaz geçirmez fermuarlı torbalarda paketlenmiş olabilir. DBS, laboratuvar işleme daha fazla Daire (F, G), elüsyon PBS tabanlı arabellekte bir shaker (H üzerinde yumruklar en az 4 sa veya tercihen, O/N Merkezi'nden 6 mm tek aygıt tarafından yumruklar nesil oluşturan ), eluates (Ben) ve nihayet Santrifüjü laboratuvar bardak (DBS eluates (K) elüsyon işlemi sırasında ortaya çıkmış herhangi bir enkaz üzerinden ücretsiz için,J) kurtarma. Daha sonra DBS eluates HBV, HCV ve HIV enfeksiyonları, serolojik işaretleri sırasıyla algılamak için bir tam otomatik platformu (L) tarafından gerçekleştirilen analizleri için hazırsınız demektir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Sonuçlar

Protokolünün etkinliği için hazırlık önerdi ve DBS işlenmesi ilk işaretleri 1,762 eşleşmiş serum/DBS çifti HBV, HCV ve HIV enfeksiyonu analiz ederek değerlendirilmiştir. ¹⁷. bu amaçla, DBS 100 µl bütün Venöz kan (cf. puan 2.1.1-2.1.6 önceki iletişim kuralı) hazırlanmıştır ve PBS dayalı olarak 1000 µl ile eluted, her, (cf. 5.1-5,5 yukarıda belirtilen iletişim kuralının puan) işlemini tamamlamak için arabellek tüm yedi parametreleri için iki ayrı işlem. Böyle bir yaklaşım elüsyon koşulların tek her analit için dikkatli optimizasyon olmadan oldukça yüksek örnek işlem hacmi nispeten kısa sürede "uyuşturucu ve kronik önümüzdeki saha çalışması sırasında beklenen çünkü kaçınılmaz gibi görünüyordu Bulaşıcı hastalıklar"("DRUCK çalışması").

Tüm ölçümler üreticinin önerilerini DBS analizleri sırasında yapıştırılır ama hemoliz etkisi veya seyreltme sonucu için telafi etmek için HBsAg ve anti-HBs tayini ile ilgili olarak değiştirilmesi gerekiyordu. 0,05 IU/ml kesme değeriyle birlikte HBsAg DBS eluates kurşun yanlış-mutlak %14,7 (52 dışarı-in 354) oranının ne zaman karşılaştırmak için serum test örnekleri (şekil 2A). Alıcı karakteristik (ROC) analiz^{25, 26} verilerin çalışma 0,15 IU/ml eşiğine artış HBsAg negatif (0.986 [duyarlılık], 0.000 [1-özgüllük], HBsAg pozitif ideal bir ayrılık neden olacağından belirtilen Şekil 2B). Öte yandan, 10 IU/m anti-HBs miktar için cut-off ile antikor oranı % 14.2 (47 dışarı-in 331) yanlış negatif ölçümleri oldu (şekil 2C) kaydetti. Bu nedenle, tekrar ROC analizi, bu kesme 1,5 IU/M'ye (0.917 [duyarlılık], 0,007 [1-özgüllük], şekil 2B) değerlerden en uygun bir ayrımcılık ulaşmak için indirdi.

Şekil 2. HBsAg ve anti-HBs DBS eluates (¹⁷değiştirilmiş) testi. ROC-güdümlü artış (A) için 0,15 IU/ml 0,05 IU/ml den HBsAg miktar için cut-off değerinin indirimli (B) yanlış pozitif sonuçları oran % %14,7 0'a. Benzer şekilde, anti-HBs konsantrasyonları ROC analizi, başlangıçta tüm tespitler % 14.2 için muhasebeleştirilir yanlış negatifler, böylece tamamen ortadan kaldırarak ilgili eşik 10 IU/l (C) 1,5 IU/M'ye (D), bir düşüş önerdi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Eşleşmiş serum/DBS analiz sonuçları tablo 1¹⁷' özetlenir. Sigara yok özgüllük DBS herhangi yedi analitler için test sırasında kaydedildi.

Ne zaman DBS eluates HBsAg, ı. e. serolojik anahtar parametreyi HBV ile akut ve kronik enfeksiyon varlığı için incelenmiş %98.6 analitik bir duyarlılık tespit edilmiştir. İki yanlış negatif sera konsantrasyonlarda HBsAg 749 IU/ml 6 IU/ml, idi. Anti-HBc antikorlar başarıyla 176 dışarı-in 204 ' (ı. e %86.3) tespit edildi DBS eluates. Yirmi iki ko-HIV ile enfekte bireylerin kökenli ölçümleri tarafından algılanmadı 28 örnekler dışında. Böylece, eğer HIV pozitif kişilerin hesaplama dışı bırakıldı, bir duyarlılık %97.1 anti-HBc antikorlar eluted kurutulmuş bütün Venöz kan almak için elde edildi. Benzer gözlemler anti-HBs antikor tayini için doğru tuttu. Hatta tahlil için 1,5 IU/l kesme değerini ayarlaması sonrası, dokuz tutarsız serum DBS sonuçları oluştu. HIV ile ko-enfekte olmayan hastalarda serum anti-HBs konsantrasyonları 11-26 IU/m hangi sonra kurumuş kan elüsyon algılama için izin vermek için çok düşük bulundu.

Anti-HCV antikorları ya bir akut veya kronik ya da çözülmüş enfeksiyonu işaret etmektedir. Sadece dört (ı. e. % 2.2) yanlış negatif anti-HCV sonuçları DBS eluates belirlenmiştir ve daha fazla serolojik ve moleküler analizleri ilgili sera çok muhtemelen olan enfeksiyonlar çoktan olmuştu hastalardan çekilmiş sergilenmez çözüldü.

DBS eluates tam otomatik sistem ile Anti-HIV antikor tespiti analitik bir duyarlılık % 100 kazandıran tamamen pürüzsüz bir süreç oldu.

"Ortalama HBV DNA toplama tam kan eluates üzerinden 100 numuneler üzerinde gerçekleştirilen (DNA konsantrasyon anlamına gelecektir: 1,573,898 IU/ml, aralığı: < 357 - > 17,860,000 IU/ml) ve %93.0 değeri vermiştir. Böylece, düşük serum HBV DNA konsantrasyonları 409 ve 3,643 IU/ml arasında yedi örnekleriyle test DBS tarafından algılanmadı. HCV RNA pozitif olduğu kanıtlanmıştır 100 sera (yani HCV RNA konsantrasyon: 1,415,944 IU/ml, aralığı: 2,479 - > 7,692,000 IU/ml), karşılık gelen tam kan aliquots kullanıma hazır hale getirildi. DBS eluates üzerinden HCV RNA belirlemeleri için %100 analitik bir duyarlılık karşılaştırmalı araştırma sonuçlandı." ¹⁷

Hazırlama ve DBS alan koşullarda işleme için anahatları belirlenmiş iletişim kuralı test etmek için bu yakın işbirliği ile Robert Koch-Enstitüsü (Berlin, Almanya) "Uyuşturucu ve kronik bulaşıcı olan hastalıklar", çalışmanın pilot aşamasında kullanılmıştır Berlin ve Essen¹⁸Alman kentleri etkin uyuşturucu kullanıcılarında yapılan. Bölümlerde 2.2.1-2.2.3 önceki iletişim kuralı, ayrıntılı olarak açıklandığı gibi kılcal kan örnekleme kayıtlı tüm 534 katılımcılar (433 erkek ve 101 kadın) uygulandı ve DBS yeniden, buna ek olarak PBS tabanlı arabellek 1.000 µl tarafından eluted.

İki kişi kronik HBV ile bulaşması için teşhis ve 39 çözümlenmiş bir HBV enfeksiyonu serolojik desen gösterdi. Ayrıca, on beş katılımcıların anti-HBs (sonrasi hipererjik durumu) için olumlu ve sekiz anti-HBc için yalnız olumlu bulundu. Katılımcılar arasında anti-HCV prevalansı %57.3 idi (N = 193) Berlin ve %73.0 (N = 144) Essen'de. Antikor pozitif % 65 örnekleri (N = 125) ve % 62 (N 89 =) da viremic vardı. Yirmi-beş 534 bireylerin dışında Anti-HIV pozitif. On dokuz enfeksiyonların zaten biliniyordu ve 24 bu bireylerin ortak HCV ile enfekte.

DBS sınayarak elde edilen sonuçları dikkatle kendi kendine bildirilen HBV ve HCV durumuyla ilgili çalışmaya katılanların anamnestic veri ile karşılaştırıldı. Bu karşılaştırma test sonuçları ile birlikte birleştiğinde serum/DBS çiftleri sınama algoritma küçük değişiklikler "DRUCK altı ek büyük şehirlerde Alman etkin uyuşturucu kullanıcılarının kayıt çalışması" ana aşaması için yol açtı: "bireyler ile enfekte HIV her zaman test edilebilir HBV DNA varlığı için. Katılımcılar olan DBS eluates anti-HBc veya anti-HBs pozitif bir iz için ikinci bir Danışma sırasında kesinlikle anti-HBc/anti-HBs durumlarını açıklamak için tabi olması ve son olarak, tüm DBS eluates HCV RNA için gösterimi yapılacak anti-HCV testi sonuçları ne olursa olsun." ¹⁷

Parametreleri	Eşleşmiş sera/DBS eluates (N)	Tutarsız sonuçlar (N)	Serum ve DBS eluates test arasında farklılıklar nedeni
HBV
HBsAg	299	2	Kronik HBV enfeksiyonu ile iki hasta. Hem antiviral tedavi edildi ve bunlardan biri ortak HIV ile enfekte oldu. Serum konsantrasyonlarda HBsAg: 749 IU/ml ve 6 IU/ml, anılan sıraya göre.
Anti-HBc	305	28	Serum içinde yirmi iki çözümlenmiş bir HBV enfeksiyonu vardı. Altı bireylerin serolojik bulma "anti-HBc yalnız" gösterdi. 22 yaşında olan hastaların ortak HIV ile enfekte. "HBV çözümleyiciler" yirmi olarak değerlendirildi "DBS test ederek anti-HBs pozitif yalnız" ve böylece, yanlışlıkla "koşulu sonrasi hipererjik" olarak sınıflandırıldı.
Anti-HBs	310	9	HIV ile ko-enfekte değil dört hasta serum anti-HBs konsantrasyonları 11 ‑ vardı 26 IU/l, elüsyon kurumuş kan lekeleri sonra antikor algılama için izin vermek için çok az oldu.
HBV DNA	150	7	409 IU/ml 3,643 IU/ml arasında değişen düşük serum HBV DNA konsantrasyonları ile ilgili sera seven hastalardan elde vardı.
HCV
Anti-HCV	339	4	Bu dört sera çoktan çözülmüş HCV enfeksiyonu olan hastalarda dan alınmıştı.
HCV RNA	150	0	-
HIV
HIV 1-p24/anti-HIV 1/2	209	0	-

Tablo 1: Hangi kurumlara ve bu iletişim protokolü önerilen tüm Venöz kan aşağıda üzerinden işlenen, 1,762 DBS elde edilen sonuçlar bir referans olarak eşleşmiş serum numuneleri bulguları ile karşılaştırıldığında.

Tartışmalar

DBS 100 yıl² için kullanılmıştır ama şaşırtıcı bir şekilde, hala onların hazırlama ve işleme hakkında genel bir fikir birliği yoktur. Tüm diğer uygulamaları DBS^{5, 16, 23}test için farklı protokolleri çeşitli var ise bugüne kadar bu önemli önceden analitik faz yeterli bir standardizasyon sadece yenidoğan tarama¹⁴, alanında elde edilmiştir. Bu dikkat çekici heterojenite üstesinden gelmek için uzun ve moleküler teknikleri tarafından kullanılmak üzere hazırlama ve DBS işlemek için kullanılan bir kapsamlı adım adım talimat bu iletişimde sunulan ve etkinliği ile ilgili olarak değerlendirildi işaretleyicileri HBV, HCV ve HIV enfeksiyonları algılamak için. Aşağıdaki tartışma odağı öncelikle önerilen protokol farklı basamaklarında yer alıyor.

Birçok farklı filtre kağıdı test DBS tarihinde kartları kullanılan² olmuştur ama bugün sadece iki ticari kaynak sınıf II tıbbi cihazlar için kan toplama^{5, 16}olarak FDA tarafından onaylanan. Bu filtre kart sistemleri son derece düzgün ve böylece ikisinin de üzerinde hazırlanan kapiller kandan elde edilen analitik sonuçlar % 4-%5²⁸daha farklı değil çok benzer emme özelliklere sahip. Doğal olarak, Masciotra ve co-işçiler²⁹ bu nedenle HIV-1 RNA tespit eşit derecede kan toplama kartları farklı kaynaklardan gelen elüsyon sonra bir nitel tahlil ile iyi. Bu veriler göz önüne alındığında, bu hemen hemen herhangi bir test ederken gözlenen farklılıklar birleştiğinde işaretçileri için serum/DBS çiftlerini HBV, HCV ve HIV enfeksiyonları¹⁷ tek başına filtre kartı seçimi ile neden oldu dışlanabilir. Ancak, bir analit doğru miktar vazgeçilmez olduğunda, kaynak kaynak değişimi artık önemsiz olabilir ve daha sofistike teknikleri, örneğin, microsampling³⁰ veya hazırlık için bir yöntemi olarak DBS (PDB) delikli kurutulmuş serum lekeler (DSS)^{31 10}test geleneksel DBS yerine uygulanması gerekebilir.

Sadece az miktarda kan testi DBS için kullanıldığından (kılcal kan bir damla oluşur yaklaşık 50 µl)^{5, 16}, numune hacmi değişimler önemlidir ve itiraf etmek gerekirse, en azından bazı serolojik sonuçları arasındaki farklılıkları ve katılımcının kendi kendine bildirilen HBV ve HCV durumu "DRUCK çalışması" Pilot sırasında kaydedilen bu değişkene atfedilebilecek. "Dalgalanmalar" numune hacmi en aza indirmek için tek en önemli etken kuşkusuz sadece teknik personel²²dikkatli ve devam eden eğitim tarafından elde edilebilir kılcal kan toplama doğru bir tekniktir. Ayrıca, kalite kontrol, bir ölçüsü olarak tüm laboratuvarlar DBS ile çalışma zaten yordamlar belirlenmesi ve daha sonra yetersiz veya geçersiz¹⁶olarak dikkate alınması gereken var DBS örnekleri hariç olmak üzere başlatılan.

Öncelikle HIV³² bağlamında yürütülen çalışmalar ve yenidoğan tarama³³ yüksek nem analitler düşmesine neden olabilir, ama şimdiye kadar hiçbir fikir birliği ne kadar DBS air-dried olması gerektiği ile ilgili soru ulaşıldı göstermiştir . En az 4 saat ve tercihen bir aralığı O/N bu iletişim, bu nedenle tüm ilgili yayınları^{32, 34} veri depolama DBS büyük çoğunluğu HBV ve HCV için daha sonra kullanılmak üzere kullanılmaya başlanmıştır koşulları kabul önerilen test çakışıyor. 1981 yılında çağdaş analitik teknikler uygulamış, Villa ve co-işçiler³⁵, antikor titreleri olsaydı depolama RT, HBV analizleri sonuçlarını 180 gün tüm gözlem döneminde etkilemedi rapor > 1/1000, ama o DBS 15 gün sonra serum titreleri sadece 1/100 yaşındayken sınır-pozitif veya negatif bile oldu. Depolama Sıcaklığı-20 ° C veya 4 ° C, önemli bir gelişme sonuçlanmamıştır. Buna ek olarak, otuz yıl sonra³⁶ test HBV-pozitif örnek çoğaltır bir çalışma yaptık ve yazarlar bu anti-HBc Oysa HBsAg aynı koşullar altında olmuş anti-HBs antikor için 183 yaşam, RT, istikrarlı yanı sıra bulundu 63 gün sonra zaten yanlış negatif. DBS eluates HBV DNA algılama, ile ilgili olarak viral nükleik asit konsantrasyonu en az yedi gün 37 ° C³⁷ istikrarlı veya depolama vasıl ilâ üç haftadır RT "dayanıklı" olduğunu kanıtladı³⁸. İki piyasada bulunan üçüncü nesil uzun³⁹ doğru sonuçlar bir gün süre ile 117-20 ° C, 2-8 ° C ve 20-25 ° C, sırasıyla depolanan DBS numuneleri kullanılarak sağlanan kullanarak anti-HCV antikor testi. -20 ° c, depolama Ancak, optik yoğunluğu en düşük varyasyon sonuçlandı. Uygulama bir dördüncü nesil anti-HCV ELISA, Yani, Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, test, Larrat ve ark. DBS bağlamında ⁴⁰ analitik özgüllük üç gündür RT., DBS numuneler depolamak sonra keskin bir düşüş gözlendi Öte yandan, kesin test sonuçlar örnekleri çeşitli koşullarda (-20 ° C, 2-8 ° C ve 22-26 ° C) 60 gün boyunca Brandao ve iş⁴¹tarafından yatırılan kullanan aynı kiti ile elde edilmiştir. En çok bir yıl⁴² için hiçbir önemli değişiklik-RT, DBS HCV RNA konsantrasyonlarda çeşitli saklama koşulları altında düşüş üzerine gözlemler ortam sıcaklığı⁴³dört hafta sonra on kat bir değişim alanı. Bu oldukça çakışan veri istikrar HBV ve HCV antijenleri, nükleik asitler ve antikorlar dikkate alarak, bu daha önce için kullanılması için DBS örneklerin depolama birimi için tanımlanan bir fikir birliği için önerilen protokolündeki geri çekmek mantıklı mı geldi ^{15, 30}test HIV: daha uzun bir süre için en iyi depolama donmuş koşullar ise kısa vadeli ifade (ilâ iki hafta) için antijenleri, viral nükleik asit ve antikorlar RT, ahırda olarak kabul edilmektedir.

Bir kural olarak, üç parametre bir elüsyon Protokolü tasarlarken dikkate alınmalıdır: (1) elüsyon arabellek; (2) süresi ve elüsyon sıcaklığını; ve (3) elüsyon birim²³. Tüm ilgili yayınları büyük çoğunluğu fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) DBS eluting için kullanıldı ve çoğu yazarlar bir protein, örneğin, sığır serum albumin (BSA) veya ara 20, yüzey aktif, sabitleme ile tahlil sinyallerinin geliştirilmesi için eklendi proteinler, çözüm ve aynı anda engelleme non-spesifik bağlama siteleri²³giderken. Doğrudan farklı elüsyon arabellekleri DBS test bağlamında karşılaştırmak, sadece birkaç raporlar kullanılabilir. Villar vd. ³⁶, örneğin, hemen hemen eşdeğer elüsyon kapasiteleri, PBS/BSA kullanılan tüm arabellekleri için kaydedilen % 0.5 spesifik olmayan reaktivite düşük düzeyde sonuçlandı. Çok benzer bir gözlem Croom ve iş⁴⁴ tarafından yapılan anti-HCV antikorları elüsyon genetik sistemler rLAV ÇED numune seyreltici DBS uygularken. Örnek bozulma riski DBS (yukarı bakın) hazırlanması sonra ilk saat içinde son derece düşük olduğundan, bu noktalar O/N, ortam sıcaklığında kuluçkaya ve nazik bitti sıra karıştırılarak elüsyon işlemi desteklemek için karar verildi. Bu yaklaşım örnekler önceki yumruk avantajı vardır gün doğrudan transfer için rutin tanı erken ertesi sabah²³. Elüsyon arabellek hacmi seyreltme faktörü mümkün olduğunca düşük tutmak için daha sonraki analizler için kullanılan deneyleri en az kendi ihtiyaçlarına adapte edilmelidir. Ancak, yüksek örnek işlem hacmi nispeten kısa sürede sırasında "DRUCK çalışması"¹⁷garanti çünkü elüsyon koşullar tek her analit için dikkatli bir optimizasyon önceki değerlendirilmesinde mümkün değildi. Sonuç olarak, 1.000 µl PBS tabanlı arabellek oldukça olumsuz hacmi için iki ayrı işlem tüm parametreleri tüm elüsyon işlemini tamamlamak için kullanıldı.

Bu yaklaşım bir yandan "tamamen anti-HBc/anti-HBs sistemi nedeniyle düşük antikor konsantrasyonları; HIV ile enfekte kişilerin için başarısız ... ve HBV DNA ile ilgili olarak en iyi analitik hassasiyetle moleküler biyolojik yordamları gerekli ve HCV RNA sınar. " ¹⁷ Öte yandan, yüksek elüsyon birim hiçbir şekilde HBsAg, anti-HCV ve Anti-HIV değerlendirme kullanılan kitleri tarafından belirlenmesi için dezavantajlı olduğunu kanıtladı. "HBsAg pozitif tam kan eluates malzemelerden başarılı %98.6 100 µl, 250 µl veya 600 µl veya 500 µl çok daha küçük bir elüsyon hacmi kısmen kullanmış olduğu önceki çalışmalarda olduğu gibi aynı şekilde yüksek derecede bir hassasiyetle tespiti"^{17 ,36, 45, 46}. %97,8 179 serum/DBS çiftleri soruşturmada anti-HCV antikorları zaten var olan sonuçlarını denk için belirlenen duyarlılığını 5-10 kat daha düşük bir elüsyon birimdeki çalıştı^{24, 44, 47, 48, 49}, raporlar. "Ayrıca, anti-HCV algılama protokollerde uygun şekilde... kendi kesme noktaları ana tarafından optimize edilmiştir"^{17, 24, 48, 49} "veya 20 µl 100 µl örnek birimlere artırarak." ^{17, 49} son olarak, analitik özgüllük ve Anti-HIV algılama için kurulan duyarlılık (% 100 her) eşit veya^{50, 51} test DBS için özel olarak uyarlanmış diğer uzun performans özelliklerinin daha üstün "veya bir kademeli yordamı birkaç Anti-HIV testleri kombine kullanımı ile"^17,52. "Onlar, gerçekten de, aynı zamanda performans göstermiş özel olarak geliştirilmiş ve DBS eluates (Q önlemek HIV 1 + 2 DBS kiti) Anti-HIV antikor tespiti için optimize edilmiş bir testin aşıldı." ^{17, 53}  

Birlikte ele alındığında, bu iletişimde sunulan kapsamlı adım adım Protokolü hazırlama ve DBS işleme için mümkün ve kullanıcı dostu bir araç olduğu ortaya çıktı ve böylece, güvenilir bir şekilde tanı Viroloji kullanılabilir. Otomasyon ⁵⁴ kullanarak yaklaşımlar sağlar ve mükemmel performans özellikleri nedeniyle bir tür için bir gelecek genel kabul gören uzlaşma protokol DBS laboratuarda test küresel alandaki temel taşı olarak hizmet potansiyeline sahiptir Tıp.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Latex rubber gloves	Hartmann	#4049500041515
70% isopropyl alcohol	Bode Chemie	#9768050
Mulifly safety cannula	Sarstedt	#85.1638
EDTA blood collection tube	Sarstedt	#02.1066.001
Adhesive bandage	Hartmann	#2994163
Dry gauze pad	Hartmann	#143213
Singel-use safety lancet	Owen Mumford	#3802421
Filter paper card	Whatman/sigmaaldrich	#10534612	Filter paper card Grade 903
Disposable pipette tips	Starlab	#S1126-7810, #S1120-8810
Zipper bag	Flexico	#20219
Mini desiccant bag	Tropack	#-
Disposable Punch	pfmmedical	#48601	6.0 mm Disposable Biopsy Punch
Disposable Forceps	Servoprax	#H7301
12 Well Cell Culture Plate	Greiner	#665180
PBS Buffer	Gibco	#14190-136
Tween 20	Applichem	#A1389.0500
Sodium Azide	Merck	#66880250
Safe-Lock Tubes, 1.5 ml	Eppendorf	#30120086
ARCHITECT HBsAg (Quantitative)	Abbott	#6C3642
ARCHITECT anti-HBc II	Abbott	#8L4425
ARCHITECT anti-HBs	Abbott	#7C1825
ARCHITECT anti-HCV	Abbott	#6C3725
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo	Abbott	#4J2727
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit	Roche	#6374891001
artus HBV LC PCR Kit	Qiagen	#4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)
VERSANT HCV TMA Assay IVD	Siemens Healthcare	#2554311