Manchas de sangue seco - preparação e processamento para uso em imunoensaios e em técnicas moleculares

Resumo

A preparação e o processamento de manchas de sangue seco (DBS) para sua análise final ainda mal são padronizados para a maioria das aplicações de diagnóstico. Para superar esta lacuna, um abrangente protocolo passo a passo é sugerido e posteriormente avaliado no que respeita à sua eficácia para a detecção de marcadores de infecções virais.

Resumo

A ideia de coleta de sangue em um cartão de papel e posteriormente, usando as manchas de sangue seco (DBS) para fins de diagnóstico originou-se há um século atrás. Desde então, DBS testes por décadas manteve-se predominantemente focado sobre o diagnóstico de doenças infecciosas, especialmente em recursos limitados ou a sistemática de triagem dos recém-nascidos para distúrbios metabólicos herdados e só recentemente têm uma variedade de novas e inovadoras aplicações de DBS começadas a emergir. Por muitos anos, variáveis pré-analíticas foram apenas inadequadamente consideradas no campo de testes de DBS e até hoje, com excepção dos recém-nascidos de triagem, toda a fase pré-analítica, que compreende a preparação e processamento de DBS para seus análise final não tem sido padronizado. Tendo em conta este pano de fundo, um protocolo passo a passo completo, que abrange al as fases essenciais, propõe-se, ou seja, coleta de sangue; preparação de manchas de sangue; secagem de manchas de sangue; armazenamento e transporte de DBS; eluição de DBS e, finalmente, as análises de eluídos DBS. A eficácia deste protocolo foi avaliada primeiro com pares de 1.762 soro acoplado/DBS para detecção de marcadores do vírus da hepatite B, hepatite C vírus e infecções de vírus da imunodeficiência humana em uma plataforma analítica automatizada. Em uma segunda etapa, o protocolo foi utilizado durante um estudo-piloto, que foi realizado em usuários de droga ativa nas cidades alemãs de Essen e de Berlim.

Introdução

A ideia de usar o sangue coletado em um cartão de papel feito de celulose é atribuída ao Ivar Christian Bang (1869-1918), o pai da moderna microanálise clínica^{1, 2}. Em 1913, Bang determinado glicose a partir de medições de nitrogênio eluídos de sangue seco manchas (DBS)³ e, mais tarde, que também se apresentou usando o método de Kjeldahl com esta técnica de papel de filtro². Posteriormente, vários investigadores relataram sobre o uso de DBS para testes serológicos para diagnosticar sífilis². Como cedo como em 1924, Chapman resumiu as vantagens de DBS testes quando particularmente ressaltou quatro itens, que ainda são válidos hoje: (1) punção venosa em relação ao convencional, menor volume de sangue é necessário e este facto era mais importante em Pediatria diagnóstico; (2) coleta de sangue é simples, não invasivos e onerosos; (3) o risco de contaminação bacteriana ou hemólise é mínimo; e DBS (4) podem ser preservados por longos períodos com quase nenhuma deterioração dos analitos^{2, 4}. Além de seu uso em testes para sífilis, mais cedo aplicações da técnica DBS incluídas, por exemplo, a detecção de anticorpos contra sarampo, caxumba, poliomielite, vírus parainfluenza, vírus sincicial respiratório (VSR) e em 1953², a identificação de Shigella em fezes secas em papel de filtro e enviado por correio normal da Indonésia para Leiden, na Holanda, bem como a detecção de anticorpos contra o Schistosoma em DBS tomadas em áreas endêmicas e analisou mais de três meses mais tarde⁵ . Em 1963, cinquenta anos depois do Bang original comunicação^{2, 6}, Guthrie finalmente publicou seu famoso método para o diagnóstico da fenilcetonúria de DBS obtido por uma picada de calcanhar de recém-nascidos,^{7, 8}.

Embora a partir dessa época, DBS foram considerados como um método comumente aplicável para coletar, armazenar, transportar e analisando uma variedade de fluidos do corpo humano⁵, sua utilização no diagnóstico ainda permaneceu predominantemente focado sobre o diagnóstico de infecções, especialmente em recursos limitados e o rastreio sistemático dos recém-nascidos para distúrbios metabólicos herdados por décadas,^{9, 10}. Desde 2005, no entanto, uma variedade de novas e inovadoras aplicações de DBS começaram a surgir. Isto resultou em um aumento quase exponencial do número de publicações científicas respectivas em DBS de cerca de 50 a quase 450 anualmente neste momento. Entre as aplicações emergentes são campos tão diversos como ter - e os estudos farmacocinéticos, perfil metabólico, monitoramento de drogas terapêuticas, toxicologia forense ou contaminação ambiental controle^{10, 11}.

Teste de DBS, assim, fez uma marcha triunfal através de diagnósticos de laboratório clínico durante os últimos 100 anos². Como na química clínica¹², no entanto, durante esta marcha variáveis pré-analíticas não foram devidamente consideradas por muitos anos. Com efeito, ainda hoje, depois de tais atividades eminentes como¹³ projeto avaliação do papel de filtro do CDC ou a formulação de uma norma nacional para coleta de sangue em papel de filtro no âmbito do recém-nascido triagem¹⁴, a fase pré-analítica ainda é largamente subestimado na maioria dos outros campos, em que testes de DBS são aplicada^{5, 10}.

Tendo em conta este pano de fundo, um protocolo passo a passo completo de^14-16 para uso em imunoensaios e em técnicas moleculares, que abrange todas as etapas essenciais, é sugerido para preparação e processamento de DBS na comunicação seguinte: (1) coleta de sangue; (2) preparação de manchas de sangue; (3) secagem de manchas de sangue; (4) armazenamento e transporte; (5) eluição de DBS; e finalmente (6) análises de eluídos DBS. A eficácia do protocolo foi avaliada primeiro com pares de 1.762 soro acoplado/DBS de detecção da hepatite B (HBV) superfície antígeno do vírus (HBsAg), anticorpos contra o antígeno do núcleo VHB (anti-HBc), anticorpos contra o VHB antigénio de superfície (anti-HBs), HBV DNA, anticorpos para o vírus da hepatite C (HCV) (anti-HCV), testes HCV RNA e vírus de imunodeficiência humana (HIV) 1-p24-Antigénio/anti-HIV 1/2 utilizando uma plataforma totalmente automatizada ou qualitativo sensível do ácido nucleico. ¹⁷. em uma segunda etapa, o protocolo foi utilizado o estudo piloto "drogas e infecciosas doenças crônicas" ("DRUCK estudar") que foi realizado por Robert Koch-Instituto em estreita colaboração com o centro de referência nacional para hepatite C em ativo usuários de drogas nas cidades alemãs de Berlim e Essen¹⁸.

Protocolo

Desde que o protocolo é projetado para uso em diagnóstico médico, sua aplicação deve seguir os princípios da declaração de Helsinque¹⁹. Para a primeira parte dos resultados apresentados na presente comunicação, simultaneamente um acordo separado pelos pacientes e aprovação por um Comitê de ética pareciam ser dispensável por duas razões: (1) "em cima de admissão" ao hospital da Universidade de Essen, "todos os pacientes fornece consentimento por escrito de todas as investigações bioquímicas, bacteriológicos e virológicos necessárias." ¹⁷ (2) "todas as amostras utilizadas durante a avaliação do teste de DBS foram enviadas para o Instituto de virologia no processo de diagnóstico clínico rotineiro. Assim, nenhum dos espécimes foram coletado especificamente para fins de estudo, não uma única venosa adicional foi efectuada e nenhum dos materiais foi testado para qualquer parâmetro diferente daquelas exigidas pelos médicos no decurso normal diagnóstico check-up." ¹⁷ o estudo "Drogas e crônica doenças infecciosas" (DRUCK estudar")¹⁸, em que DBS testes foi finalmente usado nas cidades alemãs de Essen e de Berlim para avaliar pessoas que ativamente injetam drogas, foi aprovado pela Comissário Federal para dados Proteção e liberdade de informação (Berlim, Alemanha) e, assim como pelo Comitê de ética do médico Universidade Charité, (Berlim, Alemanha).

1. coleta de sangue

1. Punção venosa,^{14, 15, 20, 21}
   1. Colocar as luvas descartáveis de látex de borracha e limpe a área do local da punção pretendido (de preferência a veia cubital mediana na fossa antecubital) com um desinfectante adequado, por exemplo, álcool isopropílico a 70%.
   2. Aplica um torniquete, 4-6 polegadas acima do local da punção putativo para dilatar as veias. Guiar a agulha na veia do paciente e, uma vez que é no lugar, suavemente, encha o tubo de sangue conectados, que contém EDTA como anticoagulante.
   3. Tão logo a venopunção é completa, liberar o torniquete e retirar a agulha. Em seguida, pressione uma gaze seca no local de punção, que posteriormente pode ser mantido no lugar por uma bandagem.
2. Punção de pele (figura 1A)^{13-15, 20, 22, 23}
   1. Colocar um par de luvas descartáveis de látex de borracha.
   2. Antes de punção da pele, o paciente deve aquecer sua mãos. O dedo é massajado anterogradely a enrich o sangue flui em direção ao local de punção.
   3. Limpe a pele do lado palmar da falange distal ponta do terceiro ou quarto dedo da mão não-escrita com um desinfectante adequado, por exemplo, álcool isopropílico a 70%. Perfure a pele de uma lanceta de segurança de uso único. O dedo deve ser realizado em uma posição tal que a gravidade facilita a coleta de sangue sobre a ponta do dedo.
   4. Quando a coleta de sangue capilar por punção da pele estiver concluída, coloque um curativo sobre a ponta do dedo.

2. preparação de manchas de sangue

1. Preparação de sangue coletado por punção venosa¹⁵
   1. Aviste o coletados anticoagulado (EDTA) todo sangue venoso nos cartões filtro logo que possível. Não Prepare-se manchas de sangue seco, mais de 24 horas após a punção venosa.
   2. Colocar todas as informações necessárias para a identificação do paciente na placa do filtro. Um cartão deve ser visto apenas com o sangue de um único indivíduo.
   3. Coloque luvas descartáveis de látex de borracha.
   4. Inverta suavemente o tubo de coleta de sangue de 2 a 4 vezes e posteriormente abrir a rolha com cuidado.
   5. Aspire 50 µ l de sangue venoso inteiro usando uma pipeta com uma ponta descartável. Transferi o sangue para o centro de um círculo sem tocar o papel de filtro diretamente com a ponta da pipeta. Tente saturar completamente o círculo.
   6. Repita este procedimento para preencher todos os círculos necessários do cartão.
2. Preparação de sangue coletado por pele punctura (Figuras 1B e 1C)^{13-16, 23}
   1. Limpe a primeira gota de sangue com uma gaze, pois pode conter fluidos do excesso de tecido. Massage o dedo novamente para aumentar o fluxo de sangue no local da punção. Transferi o seguinte a um dos círculos de cartão um filtro sem tocar a superfície diretamente com a ponta do dedo. Permitir que o sangue ser embebido na textura do filtro por forças capilares só.
   2. Deixe-a próxima grande queda de forma de sangue capilar sobre a ponta do dedo e recolhê-la no próximo círculo. Continue esse procedimento até que todos os círculos necessários são preenchidos ou interrompe o fluxo de sangue.
   3. Não esprema ou "leite" o dedo excessivamente se o fluxo de sangue não é suficiente para preencher todos os círculos necessários do cartão de filtro. Se o fluxo de sangue parar Coloque uma bandagem sobre a ponta do dedo. Realizar uma segunda pele punção no dedo de outra se houver necessidade de mais sangue para o exame.

3. secagem de manchas de sangue

1. Para secar as manchas de sangue, coloque o filtro cartões sobre um papel limpo em um gabinete de segurança de risco biológico de toalha e deixem-os secar, de preferência O/N (mas pelo menos 4 horas), em RT na ausência de qualquer fonte externa de calor. Quando o processo de secagem é completo, as manchas de sangue tem uma cor acastanhada uniformemente escura e sem áreas vermelhas são visíveis mais (Figura 1)^{13, 15, 16}.

4. armazenamento e transporte de manchas de sangue seco (DBS)

Nota: O processamento das manchas de sangue pode ser interrompido após a secagem. As cartas de filtro agora podem ser armazenado^{13-16, 23}.

1. Para armazenamento, colocar o cartão de papel de filtro em um saco de zíper único, gás-impermeável, contendo 1 a 2 sachês dessecantes para proteger os espécimes de umidade (Figura 1E). Opcionalmente, adicione um cartão de indicador de umidade.
2. Transferir este saco para um freezer com uma temperatura de-20 ° C ou inferior logo que possível. Se o congelador não está disponíveis em condições de campo, armazenamento a-4 ° C ou até mesmo a temperatura ambiente é viável por até 14 dias.
3. Transporte as amostras DBS congeladas em gelo seco. Para placas de filtro inicialmente mantidas à temperatura ambiente, use um sistema de embalagem tripla, que consiste os zíper condicionados como o contêiner interna (s), bem como um interior e um envelope exterior. Sem marcas de conteúdo são necessárias no envelope exterior para envio por correio normal, mas o símbolo internacional de risco biológico deve ser aposto para o recipiente interno primário de¹⁶.
4. Exclua as placas de filtro de processamento adicional se os pacotes de dessecante e/ou a placa do indicador de umidade adicional muda para uma cor rosa.

5. eluição de sangue seco pontos^{13, 15, 16, 23}

1. Um soco num lugar com um dispositivo de uso único 6 mm de cada círculo sangrentos da placa de filtro da classe 903 (Figura 1F). Transferi todo perfurado manchas de sangue seco de um único paciente a um poço da placa de 12.
2. Encha o poço com tampão fosfato salino contendo 0,05% Tween 20 e 0,08% de azida sódica (Figura 1). Adapte o volume de reserva adicional para os respectivos requisitos mínimos do ensaio usado para posterior análise de eluídos de manchas de sangue seco.
3. Repita essas etapas para obter uma segunda série de eluídos mancha de sangue seco, a fim de executar análises moleculares.
4. Coloque a placa de cultura de células num agitador de laboratório e deixe as manchas de sangue seco perfurado eluir suavemente para um mínimo de 4 horas ou, de preferência, O/N (Figura 1 H).
5. No dia seguinte, as manchas estão quase livres de sangue e sobrenadantes hemolíticas formaram (Figura 1I). Transferi estes eluídos para tubos microcentrifuga. Em seguida, submetê-los a centrifugação por 2 min a 10.500 x g (Figura 1J) para libertar os sobrenadantes de quaisquer detritos que tinha formado durante a eluição (Figura 1 K).

6. análise de eluídos

1. Eluídos centrifugados agora estão prontos para ser usado para a análise pretendida. Investigar os eluídos para marcadores do vírus da hepatite B, vírus da hepatite C e infecção pelo HIV usando kits comercialmente disponíveis e siga cuidadosamente as instruções dos respectivos fabricantes (Figura 1 L).

Figura 1. Resumo gráfico do protocolo proposto nesta comunicação para preparação e tratamento de manchas de sangue seco deve ser usado em imunoensaios e por técnicas moleculares. Sangue todo venoso e sangue capilar obtidos por punção venosa ou punção da pele por uma lanceta (A) podem servir como amostras para análise de mancha de sangue seco. Após a transferência do sangue para os círculos de um cartão de filtro da classe 903 (B, C), as amostras devem ser secos de preferência O/N a temperatura ambiente em uma câmara de segurança risco biológico para manchas de forma de uma cor acastanhada uniformemente sem qualquer interspersion de vermelho áreas (D). Quando secar as manchas de sangue é completa e armazenamento é necessário, os cartões de filtro podem ser embalados em sacos de zíper impermeável de gás contendo 1 a 2 sachês dessecantes (E). Transformação de laboratório de DBS incluem a geração de socos por um dispositivo de uso individual de 6 mm do centro dos círculos (F, G), a eluição dos socos em um buffer de PBS durante um mínimo de 4 horas ou, de preferência, O/N num agitador (H ), a recuperação do eluídos (eu) e finalmente centrifugação dos copos laboratório (J) para libertar os eluídos DBS de qualquer detrito que pode ter originado durante o processo de eluição (K). Posteriormente, os eluídos DBS estão prontos para análises, que foram realizadas por uma plataforma totalmente automatizada (L) a fim de detectar marcadores sorológicos da infecção pelo VHB, VHC e HIV, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

A eficácia do protocolo sugerido para preparação e processamento de DBS primeiro foi avaliado através da análise de 1.762 pares acoplados soro/DBS para marcadores da infecção por HIV, HCV e HBV. ¹⁷. para o efeito, DBS foram preparados a partir de 100 µ l sangue venoso todo (cf. pontos 2.1.1 – 2.1.6 do protocolo anterior) e foram eluídos com 1.000 µ l de PBS-baseado do buffer, cada um, (cf. pontos 5.1 – 5.5 do referido protocolo) para concluir o processo para todos os sete parâmetros em duas operações distintas. Tal abordagem sem cuidado otimização das condições de eluição para cada analito único parecia ser inevitável, porque esperava-se uma taxa de transferência de amostra bastante elevado em um tempo relativamente curto, durante o estudo de campo próximas "drogas e crônica Doenças infecciosas"("estudo DRUCK").

Todas as medições cumpridas as recomendações do fabricante no curso de análises DBS, mas tinham que ser modificado no que diz respeito a determinações de HBsAg e anti-HBs para compensar para o efeito da hemólise ou o resultado da diluição. Com um valor de corte de 0,05 UI/ml, HBsAg teste de DBS eluídos chumbo a uma taxa de falso-positivos de 14,7% (52 de 354) quando comparado ao soro amostras (Figura 2A). Receptor de funcionamento característico (ROC) análise^{25, 26} dos dados indicou que um aumento do limiar de 0,15 UI/ml resultaria em uma separação ideal de HBsAg-positivos de HBsAg-negativos (0.986 [sensibilidade], 0.000 [1-especificidade], Figura 2B). Por outro lado, com um corte de 10 UI/l para quantificação de anti-HBs anticorpos que uma taxa de falso-negativos medições de 14,2% (47 de 331) foi gravado (Figura 2). Daí, após análise ROC novamente, esse limite foi reduzido para 1,5 UI/l para alcançar uma ideal discriminação dos valores (0.917 [sensibilidade], 0,007 [1-especificidade], Figura 2D).

Figura 2. HBsAg e anti-HBs teste em eluídos DBS (modificados de¹⁷). O aumento de ROC-guiado do valor Cut-off para quantificação de HBsAg de 0,05 UI/ml (A) para 0,15 UI/ml (B) reduziu a taxa de resultados falso-positivos de 14,7% para 0%. Da mesma forma, análise ROC de concentrações anti-HB sugeriu uma diminuição do limiar respectivo de 10 UI/l (C) a 1,5 UI/l (D), eliminando, assim, completamente falso-negativos, que inicialmente representam 14,2% de todas as determinações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Os resultados das análises acopladas soro/DBS estão sumarizados na tabela 1,¹⁷. Não existe nenhuma especificidade foi gravada no decurso de DBS testes para qualquer um dos sete analitos.

Quando eluídos DBS foram investigados para a presença de HBsAg, i. e. o parâmetro chave serológico de infecção aguda e crônica com HBV, determinou-se uma sensibilidade analítica de 98,6%. Concentrações de HBsAg no dois sera falsamente negativos foram 749 UI/ml e 6 UI/ml, respectivamente. Anticorpos anti-HBc com êxito foram detectados em 176 de 204 (i. e 86,3%) Eluídos DBS. Vinte e dois fora dos 28 espécimes que não foram detectados por medições originadas-se indivíduos co infectados com HIV. Assim, se indivíduos HIV-positivos foram excluídos do cálculo, uma sensibilidade de 97,1% foi alcançada para recuperar o anti-HBc anticorpos do sangue venoso todo seco eluted. Observações semelhantes realizada verdadeiras para a determinação de anticorpos anti-HBs. Mesmo após o ajuste do valor Cut-off do ensaio a 1,5 UI/l, ocorreram nove resultados DBS soro discrepantes. Nos pacientes não co infectados com HIV, foram encontradas concentrações do anti-HBs soro de 11 – 26 UI/l, que eram demasiado baixas para permitir a detecção de após eluição do sangue seco.

Anticorpos anti-HCV são indicativos de qualquer infecção aguda ou crônica ou resolvida. Apenas quatro resultados de falsamente negativo anti-HCV (i. e. 2.2%) foram determinados de eluídos DBS e mais análises moleculares e sorológicos demonstraram claramente que o respectivo sera muito provavelmente foram tirado de pacientes, cujas infecções faz tempo que tinham sido resolvido.

A detecção de anticorpos anti-HIV em eluídos DBS com o sistema totalmente automatizado foi um processo completamente liso, que rendeu uma sensibilidade analítica de 100%.

"Concentração média HBV DNA do sangue total eluídos realizou-se em 100 espécimes (concentração de DNA: 1.573.898 UI/ml, intervalo: < 357 - > 17,860,000 UI/ml) e gerou um valor de 93,0%. Assim, sete amostras com concentrações de HBV DNA baixos soro entre 409 e 3.643 UI/ml não foram detectadas por testes o DBS. Do 100 sera que tinha provado para ser HCV RNA positivo (concentração de HCV RNA: 1.415.944 UI/ml, intervalo: 2.479 - > 7.692.000 UI/ml), alíquotas de sangue total correspondente estavam disponíveis. A investigação comparativa resultou em uma sensibilidade analítica de 100% para as determinações de HCV RNA de eluídos DBS." ¹⁷

Foi usado para testar o protocolo descrito para a preparação e processamento de DBS em condições de campo, em estreita colaboração com o Robert Koch-Instituto (Berlim, Alemanha) durante a fase piloto do estudo "Drogas e crônica doenças infecciosas", que foi realizado em usuários de droga ativa nas cidades alemãs de Berlim e Essen¹⁸. Todos 534 participantes inscritos (433 homens emulheres 101) passou por amostragem de sangue capilar, conforme descrito em detalhes nas seções 2.2.1 – 2.2.3 do protocolo anterior, e DBS foram, novamente, eluídos por adição de 1.000 µ l de tampão PBS-baseado.

Dois indivíduos foram diagnosticados para ser cronicamente infectados com o VHB, e 39 mostrou o padrão serológico de uma infecção por HBV resolvida. Além disso, quinze participantes foram positivos para anti-HBs (estatuto após a vacinação) e oito foram considerados positivos para anti-HBc sozinho. A prevalência de anti-HCV entre os participantes foi de 57,3% (N = 193) em Berlim e 73.0% (N = 144) em Essen. Do anticorpo-positivos amostras 65% (N = 125) e 62% (N = 89) também foram virémicos. Vinte e cinco fora os 534 indivíduos testou positivo para anti-HIV. Dezenove das infecções já eram conhecidas e 24 destes indivíduos eram co-infectados pelo HCV.

Os resultados obtidos através do teste de DBS cuidadosamente foram comparados com dados de história clínica dos participantes do estudo diz respeito ao estatuto auto-relatados de VHB e VHC. Esta comparação em conjunto com os resultados dos testes acoplado pares de soro/DBS levados a pequenas modificações do algoritmo de teste para a fase principal do "Estudo DRUCK", que irá matricular os usuários de droga ativa em seis adicionais grandes cidades alemãs: "indivíduos infectados com HIV serão sempre testado para a presença de HBV DNA. Os participantes cujos eluídos DBS são positivos para anti-HBc ou anti-HBs devem ser sujeitas a uma punção venosa durante uma segunda consulta para esclarecer definitivamente o seu estatuto de anti-HBc/anti-HBs e, finalmente, todos os eluídos DBS serão projectados para HCV RNA independentemente dos resultados dos testes anti-HCV." ¹⁷

Parâmetros	Eluídos acoplado soros/DBS (N)	Resultados discrepantes (N)	Razão de discrepâncias entre testes de soro e eluídos DBS
HBV
HBsAg	299	2	Dois pacientes com infecção crônica pelo VHB. Ambos estavam sob tratamento antiviral e um deles era co-infectados com HIV. Concentrações de HBsAg no soro: 749 UI/ml e 6 UI/ml, respectivamente.
Anti-HBc	305	28	No soro, vinte e dois pacientes tiveram uma infecção HBV resolvida. Seis indivíduos mostraram o achado sorológico "anti-HBc sozinho". Vinte e dois dos pacientes eram co-infectados com HIV. Desde os "resolvedores HBV," vinte anos foram avaliados como "Anti-HBs positivo sozinho" testando DBS e, assim, falsamente foram classificados como "condição após a vacinação".
Anti-HBs	310	9	Os quatro pacientes co não infectados com HIV tiveram concentrações do anti-HBs soro de 11 ‑ 26 UI/l, que eram demasiado baixas para permitir a pesquisa de anticorpos após a eluição das manchas de sangue seco.
HBV DNA	150	7	O respectivo sera tinha sido obtido de sete pacientes com concentrações de HBV DNA baixos soro desde 409 UI/ml para 3.643 UI/ml.
HCV
Anti-HCV	339	4	Estes quatro soros tinham foi tirados de pacientes, com longo desde infecções de HCV resolvidos.
HCV RNA	150	0	-
HIV
HIV 1-p24/anti-HIV 1/2	209	0	-

Tabela 1: Resultados obtidos de 1.762 DBS, que foram preparados e processados do seguinte sangue venoso todo o protocolo proposto nesta comunicação, comparavam com os achados em amostras de soro acoplado como referência.

Discussão

DBS têm sido utilizados para 100 anos² , mas, surpreendentemente, há ainda não há consenso geral sobre a sua preparação e processamento. Até à data, uma padronização suficiente desta importante fase pré-analítica só foi alcançada no campo de teste do pezinho¹⁴, Considerando que existe uma variedade de diferentes protocolos, para todos os outros aplicativos do ADO teste^{5, 16, 23}. Para superar esta heterogeneidade notável, uma instrução passo a passo abrangente para preparação e processamento de DBS para ser utilizada em imunoensaios e por técnicas moleculares é apresentada na presente comunicação e avaliada no que respeita à sua eficácia para a detecção de marcadores de HBV, HCV e HIV e infecções. O foco da discussão a seguir é colocado principalmente sobre as diferentes etapas do protocolo sugerido.

Na história da DBS teste de papel de filtro diferente muitos cartões foram usados² mas hoje somente duas fontes comerciais são aprovadas pelo FDA como dispositivos médicos da classe II para coleta de sangue a^{5, 16}. Esses sistemas de cartão de filtro são altamente uniformes e têm características muito semelhantes de absorção para que os resultados analíticos obtidos de sangue capilar, preparado em qualquer um deles não diferem em mais de 4%-5%²⁸. Não surpreendentemente, Masciotra e cooperadores do²⁹ , portanto, detectado o HIV-1 RNA igualmente bem com um ensaio qualitativo após eluição de cartões de coleta de sangue de diferentes fontes. Tendo em conta estes dados, pode praticamente excluir-se que qualquer das discrepâncias observadas quando o teste acoplado pares de soro/DBS para marcadores do VHB, VHC e HIV infecções¹⁷ foi causado pela escolha da placa-filtro sozinha. No entanto, quando a quantificação exata de um analito é indispensável, variação de fonte de fonte já não pode ser insignificante e técnicas mais sofisticadas, por exemplo, perfurado DBS (PDBS) como um método para microsampling³⁰ ou a preparação de manchas secas soro (DSS)³¹ pode ter que ser aplicada em vez de DBS convencional teste¹⁰.

Uma vez que apenas pequenas quantidades de sangue são utilizadas para testes de DBS (uma gota de sangue capilar consiste de cerca de 50 µ l)^{5, 16}, as variações no volume da amostra são cruciais e, reconhecidamente, ao menos algumas das discrepâncias entre os resultados serológicos e do participante auto-relatada VHB e VHC status registrado durante a pilotagem do "Estudo DRUCK" são atribuíveis a essa variável. O fator mais importante para minimizar "flutuações", volume da amostra, sem dúvida, é uma técnica correta de coleta de sangue capilar, que só pode ser conseguida pela cuidadosa e em curso de formação do pessoal técnico²². Além disso, como medida de controle de qualidade, todos os laboratórios que trabalham com DBS devem já iniciou procedimentos para identificar e posteriormente, excluindo as amostras que devem ser considerados como insatisfatórios ou inválido¹⁶DBS.

Estudos realizados principalmente no contexto do HIV³² e teste do pezinho³³ têm mostrado que a alta umidade pode conduzir a uma degradação dos analitos, mas até agora não tem um consenso quanto à questão de quanto tempo o DBS devem ser secas ao ar . Um intervalo pelo menos 4 horas ou, de preferência O/N é proposto na presente comunicação, que adotou, portanto, condições que foram usadas na maioria de todas as publicações relevantes^{32, 34} dados no armazenamento de DBS para ser usada posteriormente para HBV e HCV teste estão em conflito. Em 1981, Villa e colegas de trabalho de³⁵, aplicaram técnicas analíticas contemporâneas, relatou que armazenamento em RT não afetou os resultados das análises de VHB durante o período de observação inteira de 180 dias, se anticorpos foram > 1/1.000, mas esse DBS tornou-se a fronteira-positivo ou negativo mesmo depois de 15 dias, quando a concentração no soro foram apenas 1/100. Armazenamento a-20 ° C ou 4 ° C não resultou em uma melhoria substancial. Em contraste, um estudo realizado mais tarde³⁶ testado Replica de uma amostra de HBV positivo de trinta anos, e os autores encontraram que anti-HBc, bem como anticorpos anti-HBs eram estáveis até 183 dias no RT, Considerando que se tornou HBsAg nas mesmas condições falso-negativos já depois de 63 dias. No que se refere a deteção de HBV DNA de eluídos DBS, a concentração do ácido nucleico viral foi estável durante pelo menos sete dias a 37 ° C³⁷ ou provou para ser "resistente" ao armazenamento em RT por até três semanas³⁸. Testes para anticorpos anti-HCV usando dois comercialmente disponível terceira geração imunoensaios³⁹ fornecido resultados precisos para um período de 117 dias usando DBS amostras conservadas a-20 ° C, 2 – 8 ° C e 20-25 ° C, respectivamente. Armazenamento a-20 º C, no entanto, resultou na menor variação de densidades ópticas. Aplicação de uma quarta geração anti-HCV ELISA, ou seja, Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, no contexto da DBS testes, Larrat et al ⁴⁰ , observada uma diminuição acentuada na especificidade analítica após armazenar as amostras DBS por mais de três dias no RT Por outro lado, resultados de testes precisos foram obtidos com o mesmo kit utilizando amostras depositadas por 60 dias sob diferentes condições (-20 ° C, 2 – 8 ° C e 22 a 26 ° C) por Brandão e cooperadores⁴¹. Observações sobre o declínio das concentrações de HCV RNA em DBS sob diferentes condições de armazenamento variam de nenhuma alteração significativa no RT por até um ano⁴² para variar dez vezes após quatro semanas em temperatura ambiente⁴³. Tendo esses dados bastante conflitantes sobre a estabilidade do VHB e VHC antígenos, ácidos nucleicos e anticorpos em conta, parecia razoável retrair no protocolo proposto para um consenso, que foi definido anteriormente para o armazenamento de amostras DBS a ser usado para HIV testes^{15, 30}: para deposição de curto prazo (até duas semanas) do ácido nucleico viral, antígenos e anticorpos são considerados como estável na RT, considerando ideal armazenamento por períodos mais longos é em condições congeladas.

Como regra geral, três parâmetros devem ser considerados ao projetar um protocolo de eluição: (1) o tampão de eluição; (2) a duração e a temperatura de eluição; e (3) o volume de eluição²³. Na grande maioria de todas as publicações relevantes tampão fosfato salino (PBS) foi usado para eluição DBS, e a maioria dos autores adicionou uma proteína, por exemplo, albumina de soro bovino (BSA) ou Tween 20, um surfactante, a fim de melhorar o sinal de ensaio por estabilização proteínas, como eles vão para a solução e simultaneamente bloqueio inespecificas sites²³. Apenas alguns relatórios, que comparam diretamente os buffers de eluição diferente no contexto do teste de DBS, estão disponíveis. Villar et al ³⁶, por exemplo, gravou quase equivalente de eluição das capacidades de todos os buffers usados, mas PBS/BSA 0,5% resultou em nível mais baixo de reatividade inespecífica. Uma observação muito similar foi feita por Croom e cooperadores⁴⁴ ao aplicar o diluente de amostra de rLAV a genética sistemas EIA para a eluição de anticorpos anti-HCV de DBS. Uma vez que o risco de degradação da amostra é extremamente baixo nas primeiras horas após preparação de DBS (veja acima), foi decidido para incubar as manchas O/N a temperatura ambiente e a apoiar o processo de eluição misturando gentil extremidade-sobre-extremidade. Essa abordagem tem a vantagem de espécimes soquei o anterior dia pode ser transferido diretamente para o diagnóstico de rotina no início da próxima manhã²³. O volume de tampão de eluição deverá ser adaptado para os respectivos requisitos mínimos dos ensaios utilizados para análises subsequentes, a fim de manter o fator de diluição mais baixo possível. No entanto, uma cuidado otimização das condições de eluição para cada analito único não foi possível na avaliação anterior, porque uma taxa de transferência alta amostra tinha que ser garantidos em um tempo comparativamente curto durante o "Estudo de DRUCK"¹⁷. Consequentemente, o volume um pouco desfavorável de 1.000 µ l de tampão PBS-baseado foi utilizado para completar o processo de eluição inteira para todos os parâmetros em duas operações distintas.

Esta abordagem um um lado falha "completamente no sistema de anti-HBc/anti-HBs para aqueles indivíduos infectados com o HIV devido as concentrações de anticorpos de baixa; ... e exigiu procedimentos biológicos moleculares com ótima sensibilidade analítica em matéria de DNA do HBV e HCV RNA testes. " ¹⁷ por outro lado, o volume de eluição alta provou para ser de nenhuma maneira desvantajosa para a determinação de HBsAg, anti-HCV e anti-HIV pelos kits utilizados durante a avaliação. "A detecção de HBsAg positivos materiais de sangue total eluídos sucedeu com uma sensibilidade de 98,6% para um grau elevado da mesma forma como em estudos anteriores, que em parte tinha usado um muito menor volume de eluição de 100 µ l, 250 µ l, ou 600 µ l ou 500 µ l"^{17 ,36, 45, 46}. A sensibilidade de 97,8% determinado no inquérito de 179 pares de soro/DBS para anticorpos anti-HCV correspondem aos resultados das já existentes relatórios^{24, 44, 47, 48, 49}, que havia trabalhado com um volume de eluição que foi menor por um fator de 5 a 10. "Além disso, os protocolos para a deteção de anti-HCV tinham sido devidamente optimizados... por estipular seus próprios pontos de corte",^{17, 24, 48, 49} "ou aumentando os volumes de amostra de 20 µ l a 100 µ l." ^{17, 49} -finalmente, a especificidade analítica e sensibilidade (100% cada) estabelecido para a deteção de anti-HIV foram iguais ou superiores para as características de desempenho de outros imunoensaios especificamente adaptados para DBS teste^{50, 51} "ou um passo a passo procedimento com o uso combinado de vários testes de anti-HIV"^17,52. "Eles, na verdade, também excederam o registro de desempenho de um ensaio que foi especialmente desenvolvido e otimizado para a detecção de anticorpos anti-HIV em eluídos DBS (Q-prevenir HIV 1 + 2 kit de DBS)." ^{17, 53}  

Tomados em conjunto, o protocolo passo a passo completo apresentado na presente comunicação provou para ser uma ferramenta viável e user-friendly para preparação e processamento de DBS e pode, portanto, ser usado confiantemente em virologia diagnóstica. Permite abordagens usando automação ⁵⁴ e devido às suas características de desempenho excelente, tem o potencial de servir como uma espécie de fundação-pedra para um protocolo de futuro consenso geralmente aceites no campo global de DBS, testes em laboratório medicina.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Latex rubber gloves	Hartmann	#4049500041515
70% isopropyl alcohol	Bode Chemie	#9768050
Mulifly safety cannula	Sarstedt	#85.1638
EDTA blood collection tube	Sarstedt	#02.1066.001
Adhesive bandage	Hartmann	#2994163
Dry gauze pad	Hartmann	#143213
Singel-use safety lancet	Owen Mumford	#3802421
Filter paper card	Whatman/sigmaaldrich	#10534612	Filter paper card Grade 903
Disposable pipette tips	Starlab	#S1126-7810, #S1120-8810
Zipper bag	Flexico	#20219
Mini desiccant bag	Tropack	#-
Disposable Punch	pfmmedical	#48601	6.0 mm Disposable Biopsy Punch
Disposable Forceps	Servoprax	#H7301
12 Well Cell Culture Plate	Greiner	#665180
PBS Buffer	Gibco	#14190-136
Tween 20	Applichem	#A1389.0500
Sodium Azide	Merck	#66880250
Safe-Lock Tubes, 1.5 ml	Eppendorf	#30120086
ARCHITECT HBsAg (Quantitative)	Abbott	#6C3642
ARCHITECT anti-HBc II	Abbott	#8L4425
ARCHITECT anti-HBs	Abbott	#7C1825
ARCHITECT anti-HCV	Abbott	#6C3725
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo	Abbott	#4J2727
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit	Roche	#6374891001
artus HBV LC PCR Kit	Qiagen	#4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)
VERSANT HCV TMA Assay IVD	Siemens Healthcare	#2554311