باستخدام مخطط كهربية لتقييم وظيفة في القوارض الشبكية وتأثيرات واقية من بعيد الاطراف الدماغية شروط مسبقة

Summary

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Abstract

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the ‘flash’ ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

Introduction

وأرج هو إمكانية الكهربائية المولدة عن طريق القرنية في الاستجابة للضوء، والمسجلة من سطح القرنية من العين. عندما تدار شروط تسجيل بعناية، وأرج يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من الطرق لتقييم وظيفة الشبكية. نحن هنا وصف كيفية تسجيل "فلاش أرج"، واحتمال ولدت عندما يتعرض الشبكية إلى وجيزة، ومضة مشرقة المعروضة في خلفية فريق Ganzfeld. وفريق Ganzfeld يشتت ضوء متجانس ومضة من الضوء تصل إلى شبكية العين كلها تقريبا بشكل موحد. إذا شبكية العين ويتم تكييف الظلام قبل التسجيل، ويتم الحفاظ على التكيف مع الظلام، كما يتم إعداد الحيوان للتسجيل، حصل على أرج يتم إنشاؤها من قبل كل من قضيب والمخروط خلايا مستقبلة للضوء.

فلاش أرج تتكيف مع الظلام لديه الموجي مميزة، والتي تم تحليلها بطريقتين. أولا، تم تمييزها المبكرة والمتأخرة مكونات الموجي أرج، وترتبط إلى سلسلة من الخلايا العصبيةتفعيل القاعدة في شبكية العين. أقرب العنصر هو الكمون القصير إمكانية الذهاب سلبيا، وعلى بعد موجة (الشكل 1). ويتبع ذلك عن طريق إمكانية الذهاب إيجابية، ودعا ب الموجة. المرحلة طلوع ب الموجة تظهر التذبذبات، التي تعتبر عنصرا منفصلا (إمكانات متذبذبة أو المكتب). يعتبر من الموجة إلى أن تولدها خلايا مستقبلة للضوء، وب الموجة من قبل خلايا الطبقة النووية الداخلية، والبروتوكولات الاختيارية من قبل خلايا عديم الاستطالات ^1.

استنادا إلى قوة التحفيز، وصفته الردود على ومضات خافتة جدا الاستجابة عتبة ظلامية ممكنة. ومن المفهوم الاستجابة عتبة ظلامية أن تتولد من خلايا الشبكية العقدة ^2-4. ثانيا، فلاش أرج يمكن فصلها عن طريق التكيف مع الضوء، أو عن طريق بروتوكول اثنين فلاش هو موضح أدناه، إلى مكونات rod- ويحركها مخروط. في ظل ظروف فوتوبيك، وعلى بعد موجة ليست قابلة للكشف في الفئران، لأن السكان مخروط منخفض، ولكن مكتب خدمات المشاريع وأ ب الموجة هيواضح ^5. في المقدمات، التي لديها السكان مخروط أعلى شبكية العين، سواء rod- ومسارات cone- توليد للكشف على الموجة ^6.

اثنين من التدابير المفيدة في كثير من الأحيان المستخرجة من فلاش أرج هي سعة من A و B موجات يقاس في الشكل 1، مع الردود فلاش النموذجية هو مبين في الشكل (2). وعندما يتم خفض السكان مبصرة، على سبيل المثال من خلال التعرض لدمارا مشرق ضوء، يتم تخفيض جميع مكونات أرج. التدخلات اعصاب، مثل البعيد شروط مسبقة الدماغية (RIP)، ويمكن التصديق عليها من قبل المحافظة على سعة من A و B موجات (الشكل 3). وباختصار، فإن تحليل ERG يتيح مقارنات بين الأصحاء، وعلى ضوء تلف شبكية العين وneuroprotected.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة سيدني.

1. صنع أقطاب

1. بناء القطب الموجب (واحد والتي سوف نتصل القرنية) من مسافة قصيرة (5 سم) طول سلك البلاتين 1-2 مم في القطر. أزياء قبل أن تتحول إلى حلقة بضعة ملليمترات. ربط هذه الحلقة إلى رصاص التقليدي، طويلة بما فيه الكفاية للوصول إلى مرحلة الإدخال من مكبر للصوت (انظر الشكل 4).
2. بناء القطب السالب (والتي سوف تذهب في فم الحيوان) باستخدام حج / أجكل بيليه 1-2 مم في القطر، وأيضا على صلة الرصاص اتفاقية (انظر الشكل 4).
3. كما القطب المرجعية (التي سوف تذهب إلى الردف الحيوان)، واستخدام إبرة تحت الجلد نظيفة (23 G)، مرتبطة أيضا بفارق طول المناسب (انظر الشكل 4).
4. من الناحية المثالية، استخدام الكابلات الثلاثة الرصاص المقدمة من قبل الشركات المصنعة أداة، لتوصيل الأقطاب الثلاثة (إيجابية U94؛ القرنية، سلبي → الفم، إشارة → الكفل) لمكبر للصوت.

2. اتصال ومعايرة ضوء التحفيز وأرج مجموعة المتابعة

1. إنشاء (أو موقع) مختبر تسجيل صغير، والتي يمكن أن تكون مصنوعة الظلام. تجهيز مع أي من الإفراط في مقاعد البدلاء ضوء مصنوعة أحمر أو أحمر الرأس مصباح أو كليهما.
2. استخدام متر لوكس للتأكد من أن الضوء الأحمر مضوائية الوصول إلى عين فأر أثناء الإعداد لا تتجاوز 1 لوكس.
   ملاحظة: يمكن استخدام فلتر الكثافة محايدة للحد من سطوع المصباح ومصدر ضوء مصباح يجب أن تنبعث منها على وجه التحديد الضوء الأحمر. وسوف يتأثر التكيف الظلام إذا مصادر الضوء ينبعث الدنيا (مرئية) الأطوال الموجية.
3. اغلاق كافة الضوء الشارد دخول المختبر تسجيل (هذا غالبا ما يتطلب استمرار مع الشريط مبهمة) وإعداد فلتر الكثافة المحايدة (يمكن شراؤها في ورقة) كبيرة بما يكفي لتناسب أكثر، وخافت جدا، أي شاشة الكمبيوتر سوف يكون في المختبر.
   ملاحظة: ضوء شارد وضوء شاشة تكفي ليمس التكيف مع الظلام من العين الفئران.
4. توصيل مكبر للصوت الأجهزة الحصول على البيانات. ربط الإيجابية، ويؤدي سلبية وإشارة إلى مكبر للصوت. تأكد من توصيل الكمبيوتر وفريق Ganzfeld الصمام وحدة إمدادات الطاقة بشكل آمن إلى مصدر الأرض.
   ملاحظة: بعض المعامل المتخصصة ونقاط التأريض، متصلة الأرض بناء. النرجيلة هو بديل فعال.
5. معايرة مصدر ضوء LED مع الاشعاع البحوث ذات الجودة. إصلاح أجهزة الاستشعار المقياس في الموضع الذي سيقع العين الحيوان أثناء التجربة.
6. برنامج المصابيح فريق Ganzfeld لتشغيل بروتوكول أرج كامل الحقل مع زيادات تدريجية في الطاقة فلاش، مدة فلاش، فلاش التكرار والوقت بين ومضات، ووصف interstimuls الفاصلة (ISI)، إعدادات. لوضع بروتوكول سبيل المثال كامل الحقل أنظر الجدول 1.
   ملاحظة: حقل كامل زيادة ومضات أرج من ومضات خافتة المتكررة لبومضات الصحيحة بطريقة حكيمة الخطوة. يتبع برنامج فلاش مزدوج على من بروتوكول كامل الحقل ويمكن عزل قضيب ومخروط الردود.

3. يوم قبل أرج التجريب

1. الظلام التكيف مع الفئران سبراغ داولي لمدة 12 ساعة قبل التسجيل. أنه لأمر مريح للقيام بذلك في المختبر التسجيل، مرة واحدة وقد تم القضاء على ضوء شارد.

4. يوم أرج التجريب

1. ترتيب للحيوان أن تكون ساخنة بلطف أثناء التسجيل. نستخدم منصة المعادن الخفيفة بنيت بحيث رأس الحيوان يمكن أن تبقى عند نقطة الصحيحة عند مدخل إلى فريق Ganzfeld. على منصة لديه أنابيب يحمل في ثناياه عوامل نستطيع من خلالها ضخ المياه مسخن الى 40 درجة مئوية في حمام مائي.
   ملاحظة: تبين التجربة أن هذا يبقي درجة الحرارة الأساسية الحيوان عند 37 درجة مئوية.
2. وزن الفئران في ظل الظروف المظلمة. سجل الوزن والماكياج الكيتامين الصحيح (60 ملغ / كلغ) وزيلازين (5 ملغ / كلغ) جرعة. كبح جماح الفئران جنرالTLY وحقن مخدر داخل الصفاق.
3. ملاحظة وقت الحقن. مرة واحدة الحيوان فاقد الوعي (عادة في غضون 5 دقائق) تحقق عمق التخدير بواسطة معسر برفق وسادة قدم واحدة، لمعرفة ما إذا كان رد الفعل المنعكس موجودة. فمن الأفضل أن ننتظر حتى هذا لا ارادي غير موجود أو ضعيف، قبل المتابعة.
4. تطبيق قطرة واحدة من الأتروبين وآخر من proxmethacaine إلى القرنية.
5. قطع بطول 10 سم من الخيط الأسود. جعل حلقة مع عقدة بسيطة وزلة حلقة فوق خط الاستواء للعين. تشديد عليه قليلا؛ وأثر هو رسم مقلة العين إلى الأمام قليلا، مع الحد الأدنى من الضغط. هذا يحافظ على القرنية واضحة من الجفون.
6. قطرات العين تطبيق كربومير على سطح القرنية. تبقى ضمان كربومير على سطح القرنية ولا تسرب على الجفون أو وجهه.
7. وضع الفراش ماصة على قمة منصة ساخنة.
8. موقف الفئران على الفراش، مع الرأس في مكان الموصى بها في الجلسة الافتتاحية للفريق Ganzfeld.
9. إدراج الباحثالتحقيق في درجة الحرارة ernal في المستقيم. التحقيق في درجة الحرارة آمن في الموقف عن طريق تسجيل الحبل التحقيق الى الذيل.
10. إدراج القطب المرجعية (إبرة 23 G) تحت الجلد في الساق الخلفية، والاتصال مكبر للصوت.
11. وضع القطب السالب (بيليه حج / أجكل) بشكل آمن في الفم. لمنع هذا الانزلاق خارج الفم، ويضعوا زمام المبادرة بالاتصال على سطح ثابت.
12. وضع القطب الموجب على مركز للقرنية. باستخدام micromanipulator، تأكد من أن القطب يلمس القرنية بلطف.
13. تحقق من درجة حرارة الجسم في 37،0-37،5 درجة مئوية.
14. مرة واحدة يتم وضع الحيوان بشكل صحيح والأقطاب في مكانها الصحيح، ثنى الإعداد كله (فريق Ganzfeld والحيوان) مع مادة مبهمة (للحفاظ على التكيف مع الظلام). نستخدم قطعة قماش سوداء لينة.
15. في برنامج الحصول على تعيين في معدل أخذ العينات 2 كيلو هيرتز مع الوقت مجموعة من 100-1000 ميللي ثانية مع 5 ميللي ثانية لأخذ العينات قبل المجموعة. تعيين مرشحات تمرير الفرقة 1-1،000يتم تشغيل هرتز والتأكد من أخذ العينات لأخذ عينات من فترة ~ 250 مللي ثانية بعد ومضة.
16. تحقق من الأساس التسجيل. يجب أن تكون خالية من الضوضاء الدخيلة، ولكن تظهر بعض الضوضاء مكبر للصوت والتذبذب في الجهاز التنفسي.
17. إذا تبين الأساس الضوضاء الدخيلة، تبدأ المشاكل. ترتبط معظم مشاكل لإنزلاق في موقف القطب، أو التأريض. استخدام قفص فاراداي لضمان التسجيلات خالية من الضوضاء الدخيلة.
18. تشغيل فلاش اختبار، 0.4 سجل الاسكتلندي cd.sm ^-2. الموجي أرج على غرار الشكل يجب أن تظهر 2A. في مختبرنا ردود نموذجية ل0.4 سجل الاسكتلندي cd.sm ^-2 فلاش هي: (أ الموجة: -474 ± 39 μV وب الموجة: 1512 ± 160 μV، ن = 11).
19. السماح الحيوان مظلمة إعادة التكيف لمدة 10 دقيقة. أنها مريحة لاستخدام هذه 10 دقيقة لإعادة فحص خط الأساس.
20. بعد تأكيد إشارة مستقرة تبدأ تسجيل.
21. في نهاية الدورة تسجيل، تأكد من أن temperat الجسمواستمر لدى عودتهم. إزالة الأقطاب. تطبيق البوليمر كربومير لقرنية العين. السماح للحيوان للتعافي على وسادة الحرارة حتى يصبح المحمول بشكل كامل وفعال، قبل أن يعود إلى حظائر الحيوانات.

5. نقص التروية عن بعد

1. أداء نقص التروية عن بعد في أي من القوارض مستيقظا أو anesthetised.
2. إذا تم تخدير الحيوان، وضعه على منصة ساخنة (أعلاه)، وتنزلق الكفة مقياس ضغط الدم على الجزء العلوي من أطرافه الخلفية، واضحة في الركبة.
3. إذا تم استخدام الحيوانات ليجري التعامل معها، فمن الممكن لتنفيذ هذا الإجراء دون تخدير. هذا يتطلب شخصين. شخص واحد يقيد الحيوان برفق والثانية تنطبق الكفة مقياس ضغط الدم ويعمل على مقياس ضغط الدم.
4. للحيوانات مستيقظا، استخدم قطعة من منشفة ~ 15 سم × 30-50 سم إلى التفاف بلطف الحيوان، مع hindlimb واحد مجانا. وضع الحيوان على ظهرها (ويقول) الساعد الأيسر، مع رئيسها مدسوس بين ذراع حامل والجذع، ومكانصفعة وصفها بأنها مجرد.
5. فرغ الكفة والتأكد من إغلاق صمام ضغط الهواء. ضخ الكفة إلى 160 مم زئبق في الحيوانات anesthetised، وإلى 180 مم زئبق في الحيوانات مستيقظا. هذا يتجاوز الضغط الانقباضي (عادة 140 مم زئبق و 160 مم زئبق على التوالي).
6. الحفاظ على هذه الضغوط على النحو المطلوب، وذلك باستخدام مضخة يدوية.
7. بعد الوقت المخطط له لنقص التروية (نستخدم 2 فترات 5 دقائق مفصولة 5 دقائق ضخه)، فرغ ضغط الكفة عن طريق فك صمام ضغط الهواء.
8. تأكيد تأثير نقص التروية عن بعد مع تحقيق درجة حرارة الجلد تعلق على قاطع الطريق. درجة حرارة الجلد وعادة ما تقع 32-30 ° C، أكثر من 5 دقائق ويتعافى على ضخه.

6. ضوء الأضرار

1. تأكد من أن الفئران هي في ليلة وضحاها تكييفها الظلام، قبل إجراء اضرار طفيفة.
2. في الوقت المناسب بعد نقص تروية الأطراف (في تجاربنا دون تأخير)، يتم وضع كل حيوان منفردة إلى صناديق شبكي، وايالمياه التاسع والمواد الغذائية في حاويات القائم على الأرض.
   ملاحظة: لا يمكن إلا أن يضطلع الضرر الناجم عن الضوء في الحيوانات البيضاء.
3. التبديل على 1000 لوكس الضوء الأبيض معايرة قبل في وقت قياسي (عادة 9:00) والحفاظ على هذه الحالة لمدة 24 ساعة.

7. أرج استخراج وتحليل البيانات

1. اكتساب أشكال موجة متوسط ​​من أرج. إذا لزم الأمر، صحيح لخط الأساس غير صفرية، من خلال الطرح.
2. قياس السعة من على بعد موجة (قدمت في منتصف لشدة التحفيز عالية)، حيث أن فرق الجهد بين خط الأساس والأولى (<30 مللي ثانية الكمون) حوض (الشكل 1).
3. قياس السعة ب الموجة بالفرق بين الجهد ذروة في الموجة والموجب من الموجة التالية، والتي تحدث عادة في الكمون من 80-100 ميللي ثانية (الشكل 1).
4. عزل إمكانات متذبذبة باستخدام تحويل فورييه لتصفية البيانات 60-235 هرتز، مع فرقة الانتقال 90 هرتز ^{7. إذا يمكن بعد ذلك طرح المطلوبة معزولة إشارة محتملة متذبذبة من الموجي فلتر لتأكيد هوية الحوض الصغير على بعد الموجة.}
5. الوقت الضمني (الكمون) من A و B موجة القمم يمكن أيضا أن تكون مقياسا مفيدا (الشكل 1). استخدام مضات التوأم لعزل استجابة قضيب. طرح استجابة مخروط (فلاش 2) من ردود فعل متباينة (فلاش 1) لعزل استجابة قضيب (الشكل 2).
6. تطبيع شدة الضوء الفردية على الموجة وسعة ب الموجة (بعد العلاج / بعد المعاملة الأساس) أو متوسط ​​لمجموعات العلاج. منحنيات شدة الاستجابة مؤامرة سعة مجموعة والخطأ ضد الطاقة فلاش.

النتائج

بروتوكول يمكن استخدامها لقياس وظيفة البصرية من القوارض شبكية العين في الجسم الحي. وعلى بعد موجة، وهو مقياس لوظيفة مبصرة، وب الموجة، وهو مقياس لوظيفة شبكية العين الداخلية، ومشروحة في الشكل 1.

وأرج زيادات إشارة التي ?...

Discussion

فلاش طريقة أرج الظلام تكييفها المذكورة أعلاه هو طريقة يمكن الاعتماد عليها لتقييم وظيفة شبكية العين في الفئران. خفضت كل من على بعد موجة وب الموجة التي كتبها اضرار طفيفة. جهاز التحكم عن بعد شروط مسبقة الدماغية التخفيف التخفيضات الناجمة عن الأضرار الخفيفة في لالموجة وا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware	AD Instruments	PL 35044	Acquistion of ERG
Animal Bio Amp	AD Instruments	FE 136	Amplifier for ERG
Lab chart	AD Instruments		Signal collection software
Ganzfield	Photometric solutions	FS-250A	Light stimulus
Ganzfield operating system	Photometric solutions
Research Radiometer	International light technologies	ILT-1700	calibrate light series
Lux meter		LX-1010B	check red light illumanation
Excel	Microsoft
Lead wires	AD Instruments		Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator	AD Instruments		ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95%	A&E metals		postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet	SDR	E205	negative electode
26 G needle	BD		ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe	Harvard Appartus	507222F
Atropine 1% w/v	Bausch & Lomb		topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v	Bausch & Lomb		topical anaesthetic
Visco tears eye drops	Novartis		carbomer polymer
Thread			retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive	Blu tac		Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		muscle relaxant
Scale