齧歯類網膜とリモート四肢虚血プレコンディショニングの保護効果に機能を評価するために電図を用いて、

要約

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

要約

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the ‘flash’ ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

概要

ERGは、光に応答して、網膜によって生成され、眼の角膜表面から記録された電位です。記録条件は、慎重に管理されている場合、ERGは、網膜機能を評価するための種々の方法で使用することができます。ここでは、「フラッシュERG」、網膜が全体野の背景に提示簡単な、明るいフラッシュにさらされたときに発生する電位を記録する方法を説明しました。全体野が均一に光を分散し、光のフラッシュがほぼ均一に全体の網膜に到達します。網膜は、暗い記録前適応、及び動物の記録のために準備されるように暗順応を維持し、ERGが得られた場合、ロッドと錐体光受容体の両方によって生成されます。

暗順応フラッシュERGは、次の2つの方法で分析された特徴的な波形を有しています。まず、ERG波形の初期および後期成分を区別し、神経細胞の配列に関連しています網膜中のAlの活性化。最古のコンポーネントは、短い待ち時間負に向かう可能性のある、A波（ 図1）です。これは、b波と呼ばれ、正方向電位が続きます。 b波の立ち上がり位相が別の構成要素（振動電位またはOPS）と考えられている振動を示しています。 A波は、内顆粒層の細胞、およびアマクリン細胞による¹のOPによってb波、光受容体によって発生すると考えられます。

刺激強度に基づいて、非常に薄暗いフラッシュへの対応は、暗順応閾値応答が可能であると呼ばれます。暗順応の閾値応答は、網膜神経節細胞^2-4から生成されていると理解されます。第二に、フラッシュERGは明順応により分離することができる、または2つのフラッシュプロトコルによって棒状と円錐駆動コンポーネントに、以下に説明します。明所視条件下では、円錐集団が低いため、A波は、ラットでは検出可能ではなく、のOP及びb波であります⁵明確。その網膜高いコーン集団を持つ霊長類では、ロッド状と円錐経路の両方は、検出波^6を発生させます。

多くの場合、フラッシュERGから抽出された2つの有用な尺度は、図2に示される典型的なフラッシュの応答と、 図1のように測定し、A-の振幅とb波である。感光体集団はdamagingly明るいへの曝露によって、例えば、低減された場合光、ERGのすべてのコンポーネントが低減されます。このような遠隔虚血プレコンディショニング（RIP）などの神経保護の介入は、A及びB波（ 図3）の振幅を維持することによって検証することができます。要約すると、ERGの分析は、健康、光損傷を受けたとneuroprotected網膜の間の比較を可能にします。

プロトコル

このプロトコルは、シドニー大学の動物ケアのガイドラインに従っています。

1.メイキング電極

1. 正極白金線直径1〜2ミリの短い（5 cm）の長さから（角膜に接触することになる1）を構築します。ループ直径が数mmにファッションを。あなたのアンプの入力段に到達するために十分な長さ、従来の鉛にこのループを接続します（ 図4を参照）。
2. 銀/塩化銀はまた、大会リードに接続直径1〜2ミリ、ペレット使用して（動物の口の中に移動します）負極を構成する（ 図4参照）。
3. （動物の臀部になります）を参照電極として、清潔な注射針（23 G）を使用し、また、適切な長さのリードに接続された（ 図4参照）。
4. 理想的には、（正のU 3つの電極を接続し、機器の製造業者によって提供される3つのリードケーブルを使用94;角膜、負→口、アンプへの臀部→参照）。

光刺激とERGセットアップの2の接続とキャリブレーション

1. ダークにすることができる小型の記録実験室、作成（または見つけ）。赤製オーバーベンチ光または赤ヘッドランプのいずれかまたは両方を装備。
2. セットアップ時に、ラットの目に到達する赤色光照度が1ルクスを超えていないことを確認するルクスメーターを使用してください。
   注：中性濃度フィルタは、ランプの明るさを減少させるために使用することができ、ランプ光源は、具体的に、赤色光を放出しなければなりません。光源は低い（可視）波長を放射する場合ダーク適応性が損なわれます。
3. あなたが持っているであろう記録研究室に入るすべての迷光を封鎖（これは多くの場合、不透明なテープで永続性を必要とする）と、オーバーフィットするのに十分な大きさ、など薄暗い減光フィルタ（これはシートに購入することができます）、任意のコンピュータの画面を準備ラボ。
   注：迷光と画面の光がラットの眼の暗順応を害するのに十分です。
4. データ集録ハードウェアにアンプを接続します。アンプに正、負の基準リード線を接続します。コンピュータとLED全体野電源ユニットは確実に接地源に接続されていることを確認してください。
   注：一部のラボでは、建物のグランドに接続され、接地点を専門にしています。水道管は、効果的な代替手段です。
5. 研究品質の放射計とLED光源を調整します。動物の眼は実験中に配置される位置にあるメーターのセンサーを修正しました。
6. フラッシュエネルギー、フラッシュ期間、フラッシュ間のフラッシュの繰り返しや時間の段階的な増加にフルフィールドERGプロトコルを実行するプログラム全体野のLEDは、設定をinterstimuls間隔（ISI）と呼ばれます。例えば、フルフィールドプロトコルについては、表1を参照してください。
   注：フルフィールドERGは、Bに繰り返し薄暗いが点滅から増加を点滅段階的な様式で右が点滅します。ツインフラッシュプログラムは、フルフィールドのプロトコルからの続き、ロッドとコーンの応答の分離を可能にします。

ERGの実験に3日前

1. ダーク記録する前に12時間のSDラットを適応させます。これは、迷光が除去された後、記録研究室でこれを行うことが便利です。

ERG実験の4日目

1. 録音中、穏やかに加熱される動物のためにアレンジ。私たちは、動物の頭部が全体野へのエントリで正しいポイントで休むことができるように構築された軽金属プラットフォームを使用しています。プラットフォームは、我々は水浴中で40℃に予熱した水をポンプこれを通してチューブを内蔵しています。
   注：経験は、これは37℃での動物のコア温度を維持することを示しています。
2. 暗条件下でラットを計量。レコードの重みと正しいケタミン（60 mgの/ kg）およびキシラジンを構成する（5ミリグラム/ kg）の用量。ラットGENを抑えますTLYと腹腔内に麻酔薬を注入します。
3. 注入時に注意してください。動物が無意識になると（通常は5分以内）軽く反射応答が存在するかどうかを確認するために、片足パッドをつまんで麻酔の深さを確認してください。なお、この反射は先に進む前に、存在しないか、または弱いまで待つのがベストです。
4. 角膜へのアトロピンとproxmethacaineの別の一滴を適用します。
5. 黒糸の10cmの長さをカットします。簡単な結び目でループ状にして、目の赤道上にループを滑ります。少し締め。影響は最小限の圧力で、やや前方眼球を描画することです。これは、まぶたから透明な角膜を保持します。
6. カルボマー眼は角膜の表面に低下適用されます。カルボマーは、角膜表面上に残り、まぶたや顔の上にこぼれないようにします。
7. 加熱されたプラットフォーム上に吸収性寝具を置きます。
8. 全体野の開口部に推奨代わりに頭をベッド上の位置ラット、。
9. 挿入int型直腸にernal温度プローブ。尾へのプローブコードをテーピングにより所定の位置に温度プローブを固定します。
10. 皮下後脚に参照電極（23 G針）を挿入し、アンプに接続します。
11. 口の中でしっかりと負極（銀/塩化銀ペレット）を配置します。これは口を滑らないようにするには、安定した面に接続するリード線を取り付けます。
12. 角膜の中心の上に正極を配置します。マイクロマニピュレーターを用いて、電極を静かに角膜に触れることを確認してください。
13. 37.5°C - チェック体温は37.0です。
14. 動物が適切に配置され、電極が所定の位置にあるされたら、（暗順応を維持するために）、不透明な材料で、全体のセットアップ（全体野および動物）を羽織ります。我々は、柔らかい黒い布を使用しています。
15. 取得ソフトウェアで事前収集サンプリングの5ミリ秒で100〜1000ミリ秒の収集時間で2 kHzのサンプリング·レートで設定します。 1〜1000のバンドパスフィルタを設定しますヘルツとそのサンプリングがフラッシュ以下〜250ミリ秒の期間をサンプリングするようにトリガされていることを確認します。
16. 記録ベースラインを確認してください。これは、外来ノイズを含まないことが、いくつかのアンプのノイズや呼吸振動を表示する必要があります。
17. ベースラインは外来ノイズを示している場合は、トラブルシューティングを開始します。ほとんどの問題は、電極の位置、またはアースに滑りに関連しています。録音は外来ノイズの自由であることを確認するためにファラデーケージを使用します。
18. テストフラッシュ、0.4ログスコットcd.sm ^-2を実行します。 図2Aと同様のERG波形が表示されます。 （：-474±39μVとb波：1,512±160μV、N = 11波）当研究室では0.4ログスコットcd.sm ^-2フラッシュのための典型的な応答があります。
19. ダーク10分間の再適応に動物を可能にします。これは、ベースラインを再確認するために、これらの10分を使用すると便利です。
20. 安定した信号の次の確認は、録音を開始します。
21. 記録セッションの終了時に、そのボディtemperatをチェックUREを維持しました。電極を取り外します。角膜へのカルボマーポリマーを再適用します。それは、動物のハウジングに戻る前に、完全なモバイルとアクティブになるまで動物が熱パッド上に回復することができます。

5.リモート虚血

1. 覚醒または麻酔げっ歯類のいずれかでリモート虚血を実行します。
2. 動物が麻酔されている場合は、膝の明確な、加熱されたプラットフォーム上に置く（上）と後肢の上部にわたって血圧計用カフをスリップ。
3. 動物は処理さに慣れている場合には、麻酔なしでこの手順を実行することが可能です。これは、2人が必要です。一人は静かに動物を拘束し、第二は、血圧計用カフを適用し、血圧計を運営しています。
4. 覚醒動物の場合、1後肢無料で、静かに動物をラップするために~15センチ×30〜50センチメートルタオルの一部を使用しています。その頭をホルダの腕や胴体、および場所の間に隠れてと、左前腕（例えば）に背に動物を置きますカフは、今説明しました。
5. カフを収縮し、空気圧バルブが閉じていることを確認します。麻酔動物で160 mmHgのにカフをポンプと、覚醒動物における180 mmHgです。これは、収縮期血圧（通常は140 mmHgで160 mmHgのそれぞれ）を超えています。
6. 必要に応じて手持ちのポンプを使用して、これらの圧力を維持します。
7. 虚血のために計画された時間（私たちは、5分間の再灌流によって分離された5分の2ピリオドを使用）した後、空気圧バルブを緩めてカフ圧を収縮させます。
8. フットパッドに接続されている皮膚の温度プローブを使用して、リモート虚血の効果を確認してください。皮膚温度は、典型的には、5分間かけて、32-30°Cから落下し、再灌流に回復します。

6.光損傷

1. 光損傷の手順の前に、ラットが暗順応一晩であることを確認してください。
2. （遅滞なく我々の実験で）肢虚血以下の適切な時間に、各動物をプレキシガラス箱の中に単独で配置され、WI床式の容器に目の水と食料。
   注：光誘起損傷は、アルビノ動物において行うことができます。
3. 標準時間（通常は午前9時）に予め較正千ルクスの白色光に切り替え、24時間この状態を維持します。

7. ERGデータ抽出と分析

1. ERGの平均波形を取得します。減算によって、非ゼロのベースラインの、正しい必要であれば。
2. ベースラインと第一の電圧差として、（高刺激強度半ばで発表）は、A波の振幅を測定（<30ミリ秒の待ち時間）トラフ（ 図1）。
3. 典型的には80〜100ミリ秒（ 図1）の待ち時間で発生する、次の波のa波と正のピークとの間の電圧差としてb波の振幅を測定します。
4. 90 Hzの遷移帯域で、60-235ヘルツからデータをフィルタリングするために、フーリエ変換を用いて、振動電位を分離します ^{7。必要に応じて、単離された振動電位信号は、A波の谷の身元を確認するためにフィルタリングされていない波形から減算することができます。}
5. A及びB波のピークの暗黙の時間（待ち時間）は、有用な測定（ 図1）であることができます。ロッド応答を分離するために双子の点滅を使用します。混合応答（フラッシュ1）ロッド応答を分離する（ 図2）からの錐体応答（フラッシュ2）を減算します。
6. 個々の光強度を波およびb波の振幅を正規化（後処理/後処理ベースライン）、または治療群について平均。強度応答曲線は、フラッシュエネルギーに対してグループ振幅と誤差をプロットします。

結果

プロトコルは、 インビボでげっ歯類の網膜の視覚機能を測定することができます。 A波、光受容体の機能の測定値、及びb波、内網膜の機能の測定値は、 図1に注釈されています。

増加した光刺激を有するロッド支配ERG信号が増加すると、 図2（a）に示すように。 A波は〜0.4ログスコットのcd.sm ^-2および2.5ログスコットcd.sm ^-2（

ディスカッション

上記の暗順応フラッシュERG方法は、ラットの網膜機能を評価するための信頼できる方法です。 A波とB波の両方は、光損傷によ​​って減少しました。リモート虚血プレコンディショニングは、A波とB波の光損傷誘導減少を軽減します。網膜機能のこの保存は遠隔虚血プレコンディショニングは、低酸素症、虚血および運動^8-10などの保護事前調整の他の形態に似ている、神経保護を誘?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware	AD Instruments	PL 35044	Acquistion of ERG
Animal Bio Amp	AD Instruments	FE 136	Amplifier for ERG
Lab chart	AD Instruments		Signal collection software
Ganzfield	Photometric solutions	FS-250A	Light stimulus
Ganzfield operating system	Photometric solutions
Research Radiometer	International light technologies	ILT-1700	calibrate light series
Lux meter		LX-1010B	check red light illumanation
Excel	Microsoft
Lead wires	AD Instruments		Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator	AD Instruments		ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95%	A&E metals		postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet	SDR	E205	negative electode
26 G needle	BD		ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe	Harvard Appartus	507222F
Atropine 1% w/v	Bausch & Lomb		topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v	Bausch & Lomb		topical anaesthetic
Visco tears eye drops	Novartis		carbomer polymer
Thread			retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive	Blu tac		Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		muscle relaxant
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