Utilizando el Electrorretinograma para evaluar la función en el Roedor Retina y los efectos protectores de distancia Limb Preacondicionamiento Isquémico

Resumen

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Resumen

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the ‘flash’ ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

Introducción

El ERG es un potencial eléctrico generado por la retina en respuesta a la luz, y grabado de la superficie corneal del ojo. Cuando las condiciones de grabación se manejan con cuidado, el ERG se puede utilizar en una variedad de maneras para evaluar la función de la retina. Aquí describimos cómo grabar el 'Flash ERG', el potencial generado cuando la retina se expone a un breve, flash brillante presentado en un fondo Ganzfeld. El Ganzfeld dispersa la luz de forma homogénea y el flash de la luz alcanza toda la retina aproximadamente uniforme. Si la retina está oscuro adaptado antes de grabar, y la oscuridad, la adaptación se mantiene como el animal se prepara para la grabación, el ERG obtenido se genera por ambas fotorreceptores conos y bastones.

El oscuro-adaptado de flash ERG tiene una forma de onda característica, que ha sido analizada de dos maneras. En primer lugar, principios y finales de los componentes de la forma de onda ERG se han distinguido, y en relación con la secuencia de la neuronaal activación en la retina. El primer componente es una latencia corta en sentido negativo potencial, la onda a (Figura 1). Esto es seguido por un potencial positivo va, llamada la onda b. La fase ascendente de la onda b muestra oscilaciones, que se consideran un componente separado (potenciales oscilatorios o PO). La onda a se considera que está generada por fotorreceptores, la onda b por las células de la capa nuclear interna, y los PO por las células amacrinas ^1.

Sobre la base de la fuerza del estímulo, las respuestas a destellos muy tenues denominan el umbral de respuesta escotópica son posibles. El umbral de respuesta escotópica se entiende que ser generado a partir de las células ganglionares de la retina ^2-4. En segundo lugar, el flash ERG se puede separar por adaptación a la luz, o por un protocolo de dos flash descritos a continuación, en componentes de bastón y cono impulsada. En condiciones fotópicas, la onda a es no detectable en ratas, porque la población de cono es baja, pero PO y una onda b sonclaro ^5. En los primates, cuyas retinas tienen poblaciones cono superior, tanto de varilla y las vías de cono generan una detectable una onda ^6.

Dos medidas útiles a menudo extraídos de la ERG flash son las amplitudes de la a- y b-ondas, medidos como en la Figura 1, con respuestas de flash típicos mostrados en la Figura 2. Cuando la población fotorreceptor se reduce, por ejemplo por la exposición a damagingly brillante luz, se reducen todos los componentes del ERG. Intervenciones neuroprotectoras, como a distancia precondicionamiento isquémico (RIP), pueden ser validados por la preservación de las amplitudes de la a- y b-ondas (Figura 3). En resumen, el análisis de la ERG permite comparaciones entre sana, ligera y de la retina dañada neuroprotected.

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices de cuidado de animales de la Universidad de Sydney.

1. Electrodos Fabricadores

1. Construir el electrodo positivo (el que se pondrá en contacto la córnea) a partir de un corto (5 cm) longitud de alambre de platino 1-2 mm de diámetro. Moda en un bucle de unos pocos milímetros de diámetro. Conecte este lazo a una ventaja convencional, el tiempo suficiente para llegar a la etapa de entrada del amplificador (ver Figura 4).
2. Construir el electrodo negativo (que irá en la boca del animal) utilizando un Ag / AgCl pellet 1-2 mm de diámetro, también conectado a una ventaja de convención (véase la Figura 4).
3. Como electrodo de referencia (que entrará en la grupa del animal), utilice una aguja hipodérmica limpia (23 G), también conectado a un cable de longitud adecuada (ver Figura 4).
4. Lo ideal es usar cables de tres líderes proporcionadas por los fabricantes de instrumentos, para conectar los tres electrodos (U positivo94; córnea, negativo → boca, la referencia → grupa) al amplificador.

2. Conexión y calibración del estímulo de luz y ERG Set-up

1. Crear (o localizar a) un laboratorio de grabación pequeño, que puede hacerse oscuro. Equipar con uno o ambos de una luz sobre-el-banco hecho de color rojo o una cabeza con lámpara roja.
2. Use un medidor de luz para confirmar que la iluminación de luz roja alcanzando el ojo de la rata durante la instalación no exceda de 1 lux.
   Nota: un filtro de densidad neutra se puede utilizar para reducir el brillo de la lámpara y la fuente de luz de la lámpara debe emitir específicamente luz roja. Adaptación oscuro se verá comprometida si las fuentes de luz emiten bajas (longitudes de onda visibles).
3. Sellar toda la luz parásita que entra en el laboratorio de grabación (esto a menudo requiere persistencia con cinta opaca) y preparar un filtro de densidad neutra (esto se puede comprar en las hojas) lo suficientemente grande como para caber en, y tan tenue, cualquier pantalla de ordenador que tendrá en el laboratorio.
   Nota: La luz parásita yla luz de una pantalla son suficientes para perjudicar adaptación a la oscuridad de los ojos de rata.
4. Conecte el amplificador al hardware de adquisición de datos. Conecte cables positivo, negativo y de referencia para el amplificador. Asegúrese de que el ordenador y la fuente de alimentación Ganzfeld LED estén bien conectados a una fuente de tierra.
   Nota: Algunos laboratorios han especializado puntos de puesta a tierra, conectado a una tierra del edificio; una pipa de agua es una alternativa eficaz.
5. Calibrar la fuente de luz LED con un radiómetro-calidad de la investigación. Fije el sensor del medidor en la posición en la que los ojos del animal se encuentra durante un experimento.
6. Programa de los LED Ganzfeld para ejecutar un protocolo ERG de campo completo con aumentos graduales en la energía flash, duración del flash, flash de repetición y el tiempo entre destellos, denominado intervalo interstimuls (ISI), los ajustes. Por ejemplo, un protocolo de campo completo véase el cuadro 1.
   Nota: El campo completo ERG destellos aumentan de destellos tenues repetitivas abderecha parpadea de una manera sabia paso. El programa de flash doble continuación del protocolo de campo completo y permite el aislamiento de las respuestas de conos y bastones.

3. Día Antes de ERG Experimentación

1. Oscuro adaptarse ratas Sprague-Dawley de 12 hr antes de la grabación. Es conveniente hacer esto en el laboratorio de grabación, una vez que la luz externa se ha eliminado.

4. Día de ERG Experimentación

1. Haga arreglos para que el animal sea calienta suavemente durante la grabación. Utilizamos una plataforma de metal ligero construido de manera que la cabeza del animal puede descansar en el punto correcto en la entrada a la Ganzfeld. La plataforma tiene tubo incorporado a través del cual bombeamos agua precalentada a 40 ° C en un baño de agua.
   Nota: La experiencia demuestra que esto mantiene la temperatura central del animal a 37 ° C.
2. Pesar la rata en condiciones de oscuridad. Apunte el peso y compensar ketamina correcta (60 mg / kg) y xilazina (5 mg / kg) dosis. Restringir la rata gently e inyectar anestesia por vía intraperitoneal.
3. Nota momento de la inyección. Una vez que el animal está inconsciente (generalmente dentro de 5 min) comprobar la profundidad de la anestesia ligeramente pellizcar una almohadilla del pie, para ver si una respuesta refleja está presente. Lo mejor es esperar hasta que este reflejo está ausente o débil, antes de proceder.
4. Aplique una gota de atropina y otro de proxmethacaine a la córnea.
5. Cortar una longitud de 10 cm de hilo negro. Haga un lazo con un nudo simple y deslice el aro sobre el ecuador del ojo. Apriete ligeramente; el efecto es dibujar el globo ocular ligeramente hacia adelante, con una presión mínima. Esto mantiene la córnea clara de los párpados.
6. Aplicar ojo carbómero cae a la superficie de la córnea. Asegurar carbómero permanece en la superficie de la córnea y no se derrame en los párpados o la cara.
7. Coloque la ropa de cama absorbente en la parte superior de la plataforma climatizada.
8. Posición de la rata en la ropa de cama, con la cabeza en el lugar recomendado en la apertura de la Ganzfeld.
9. Insertar intsonda de temperatura ernal en el recto. Sonda de temperatura segura en posición con cinta adhesiva el cable de la sonda a la cola.
10. Inserte el electrodo de referencia (la aguja 23 G) por vía subcutánea en la pata trasera, y conectarse a un amplificador.
11. Coloque el electrodo negativo (el sedimento de Ag / AgCl) de forma segura en la boca. Para evitar que esto se salga de la boca, colocar el cable de conexión a una superficie estable.
12. Coloque el electrodo positivo sobre el centro de la córnea. El uso de un micromanipulador, asegúrese de que el electrodo toca la córnea con suavidad.
13. Revise la temperatura del cuerpo está en 37,0 a 37,5 ° C.
14. Una vez que el animal esté correctamente colocado y electrodos están en su lugar, cubrir toda la configuración (Ganzfeld y animal) con un material opaco (para preservar la adaptación a la oscuridad). Utilizamos un paño negro suave.
15. En el software de adquisición ajustado a una frecuencia de muestreo de 2 KHz con un tiempo de colección de 100 a 1000 ms con 5 ms de muestreo pre-colección. Establezca los filtros de paso de banda para 1-1.000Hz y asegurar que el muestreo se activa para probar el periodo de ~ 250 ms después de un flash.
16. Compruebe la línea de base de la grabación. Debe estar libre de ruidos extraños, pero muestran un poco de ruido del amplificador y una oscilación respiratoria.
17. Si la línea de base muestra ruidos extraños, comenzará la solución de problemas. La mayoría de los problemas están relacionados con el deslizamiento en la posición del electrodo, o de puesta a tierra. Utilice una jaula de Faraday para garantizar grabaciones están libres de ruidos extraños.
18. Ejecute un destello de prueba, 0,4 log scot cd.sm ^-2. Una forma de onda ERG similar a la figura debería aparecer 2A. En nuestras respuestas típicas de laboratorio para un 0,4 log scot cd.sm ^-2 Flash son (una onda: -474 ± 39 mV y la onda b: 1.512 ± 160 mV, n = 11).
19. Deje que los animales a oscuro re-adaptarse durante 10 min. Es conveniente utilizar estos 10 min para volver a comprobar la línea de base.
20. Tras la confirmación de señal estable comenzar la grabación.
21. Al final de la sesión de grabación, compruebe que temperat cuerpose mantuvo ure. Retire los electrodos. Vuelva a aplicar polímero carbómero de córneas. Deje que el animal se recupere en una almohadilla de calor hasta que es completamente móvil y activo, antes de regresar a la vivienda de los animales.

5. La isquemia a distancia

1. Realizar isquemia a distancia, ya sea en roedores despiertos o anestesiados.
2. Si se anestesia el animal, lo pondré sobre una plataforma climatizada (arriba) y deslice el manguito del esfigmomanómetro sobre la parte superior de la extremidad posterior, clara de la rodilla.
3. Si los animales están acostumbrados a ser manejado, es posible llevar a cabo este procedimiento sin anestesia; esto requiere dos personas. A una persona le restringe el animal suavemente, y la segunda se aplica el manguito del esfigmomanómetro y opera el esfigmomanómetro.
4. Para los animales despiertos, use un pedazo de toalla de ~ 15 cm x 30 a 50 cm para envolver suavemente el animal, con un solo miembro posterior libre. Colocar el animal en la espalda a (por ejemplo) el antebrazo izquierdo, con la cabeza metida entre el brazo y el torso del titular, y el lugarel brazalete como se acaba de describir.
5. Desinflar el manguito y asegurar la válvula de presión de aire se cierra. Bombee el manguito a 160 mmHg en animales anestesiados, y 180 mmHg en animales despiertos. Esto supera la presión sistólica (generalmente 140 mmHg y 160 mmHg respectivamente).
6. Mantener estas presiones, según sea necesario, utilizando la bomba de mano.
7. Después de la hora prevista para la isquemia (usamos 2 períodos de 5 min separadas por 5 min de reperfusión), desinflar la presión del manguito aflojando la válvula de presión de aire.
8. Confirmar el efecto de la isquemia a distancia con una sonda de temperatura de la piel unida a la almohadilla de la pata. Temperatura de la piel por lo general cae 32-30 ° C, durante 5 min y se recupera en la reperfusión.

6. Daño Luz

1. Asegúrese de que las ratas están en un oscuro adaptado durante la noche, antes de que el procedimiento de daño de la luz.
2. En el momento apropiado después de isquemia de las extremidades (en nuestros experimentos sin demora), cada animal se coloca en solitario en una cajas de plexiglás, wiª de agua y alimentos en recipientes con base de suelo.
   Nota: El daño inducido por la luz sólo puede llevarse a cabo en animales albinos.
3. Encender una luz blanca pre-calibrado 1.000 lux a un tiempo estándar (normalmente 09 a.m.) y mantener esta condición durante 24 horas.

7. ERG extracción de datos y análisis

1. Adquirir formas de onda promediados del ERG. Si es necesario, correcto para una línea de base distinto de cero, por sustracción.
2. Medir la amplitud de la onda a (presentado en mediados a altas intensidades de estímulo), como la diferencia de voltaje entre la línea de base y la primera (<30 mseg latencia) canal (Figura 1).
3. Mida la amplitud de la onda b como la diferencia de voltaje entre el pico de la onda A y el positivo de la siguiente ola, que se producen normalmente en una latencia de 80 a 100 ms (Figura 1).
4. Aislar potenciales oscilatorios mediante el uso de una transformada de Fourier para filtrar los datos 60 a 235 Hz, con una banda de transición 90 Hz ^{7. Si se requiere la señal potencial oscilatorio aislado puede entonces ser restada de la forma de onda sin filtrar para confirmar la identidad de la vaguada de onda a.}
5. El tiempo implícito (latencia) de los picos A y B de onda también puede ser una medida útil (Figura 1). Utilice los destellos individuales para aislar la respuesta varilla. Restar la respuesta de los conos (flash 2) de la respuesta mixta (flash 1) para aislar la respuesta de varilla (Figura 2).
6. Normalizar la intensidad de luz individual una onda y amplitudes de onda b (post-tratamiento / post-tratamiento-base) o un promedio de grupos de tratamiento. Curvas Intensidad-respuesta trazar las amplitudes de grupo y de error contra la energía flash.

Resultados

El protocolo se puede utilizar para medir la función visual de la retina de roedores in vivo. La onda a, una medida de la función de los fotorreceptores, y la onda b, una medida de la función de la retina interna, se anotan en la Figura 1.

Las señales ERG aumentos de barra dominadas con el creciente estímulo de luz, como se muestra en la Figura 2A. La onda se convierte en un aparente en ~ 0,4 log scot cd.sm ^-2 y la amplitud de la ond...

Discusión

El método ERG flash adaptada a la oscuridad descrito anteriormente es un método fiable para evaluar la función de la retina en ratas. Tanto la onda ay la onda b se redujeron en un daño de la luz. Remoto precondicionamiento isquémico mitigado reducciones inducidas daños-luz en la onda ay la onda b. Esta preservación de la función retiniana sugiere que el precondicionamiento isquémico remoto ha inducido neuroprotección, asemejándose a otras formas de acondicionamiento previo de protección, tales como hipoxia, ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware	AD Instruments	PL 35044	Acquistion of ERG
Animal Bio Amp	AD Instruments	FE 136	Amplifier for ERG
Lab chart	AD Instruments		Signal collection software
Ganzfield	Photometric solutions	FS-250A	Light stimulus
Ganzfield operating system	Photometric solutions
Research Radiometer	International light technologies	ILT-1700	calibrate light series
Lux meter		LX-1010B	check red light illumanation
Excel	Microsoft
Lead wires	AD Instruments		Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator	AD Instruments		ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95%	A&E metals		postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet	SDR	E205	negative electode
26 G needle	BD		ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe	Harvard Appartus	507222F
Atropine 1% w/v	Bausch & Lomb		topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v	Bausch & Lomb		topical anaesthetic
Visco tears eye drops	Novartis		carbomer polymer
Thread			retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive	Blu tac		Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		muscle relaxant
Scale