Utilisation de la Électrorétinogramme pour évaluer la fonction dans le Retina rongeurs et les effets protecteurs de la distance préconditionnement ischémique Limb

Résumé

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Résumé

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the ‘flash’ ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

Introduction

L'ERG est un potentiel électrique généré par la rétine en réponse à la lumière, et enregistré à partir de la surface de la cornée de l'oeil. Lorsque les conditions d'enregistrement sont gérés avec soin, l'ERG peut être utilisé dans une variété de façons d'évaluer la fonction rétinienne. Ici, nous avons décrit comment enregistrer l''éclair ERG », le potentiel généré lorsque la rétine est exposée à un bref flash lumineux présenté dans un fond de Ganzfeld. Le Ganzfeld disperse la lumière de façon homogène et le flash de lumière atteint la rétine entière près uniformément. Si la rétine est sombre adapté avant l'enregistrement, et l'adaptation à l'obscurité est maintenue tant que l'animal est préparé pour l'enregistrement, l'ERG obtenue est générée par les deux photorécepteurs à bâtonnets et des cônes.

La adaptés à l'obscurité éclair ERG a une forme d'onde caractéristique, qui a été analysée de deux manières. Tout d'abord, précoces et tardives composants de la forme d'onde ERG ont été distingués, et liée à la séquence de neuroneal activation de la rétine. Le premier composant est un court temps de latence devenant négative potentielle, l'un d'onde (Figure 1). Il est suivi par un potentiel positif en cours, appelé b-ondes. La phase de montée de l'onde b montre des oscillations, qui sont considérés comme une composante distincte (des potentiels oscillatoires ou PO). L'un d'onde est considéré être généré par des photorécepteurs, la b-ondes par les cellules de la couche nucléaire interne, et les PO par les cellules amacrines ^1.

Sur la base de l'intensité de stimulation, les réponses à éclairs très faibles dits la réponse scotopique de seuil sont possibles. La réponse du seuil scotopique est entendu être générés à partir des cellules ganglionnaires de la rétine ^4.2. Deuxièmement, le flash ERG peut être séparé par adaptation à la lumière, ou par un protocole en deux flash décrit ci-dessous, en composants Rodgers et entraîné de cône. Dans des conditions photopiques, l'un d'onde est pas détectable chez les rats, parce que la population de cône est faible, mais les PO et un b-ondes sont⁵ clair. Chez les primates, dont les rétines ont des populations de cône supérieur, tant de bâtonnet et les voies de cône génèrent un détectable ^onde-6.

Deux mesures utiles souvent extraites du flash ERG sont les amplitudes de la A et B-ondes, mesurées comme dans la figure 1, avec des réponses flash typiques de la figure 2. Lorsque la population de photorécepteur est réduite, par exemple par l'exposition à dommageable lumineux la lumière, toutes les composantes de l'ERG sont réduits. Interventions neuroprotecteurs, comme à distance préconditionnement ischémique (RIP), peuvent être validés par la préservation des amplitudes de la A et B-ondes (figure 3). En résumé, l'analyse de l'ERG permet des comparaisons entre la santé, la lumière et de la rétine endommagée neuroprotected.

Protocole

Ce protocole suit les directives de protection des animaux de l'Université de Sydney.

1. réaliser des électrodes

1. Construire l'électrode positive (celui qui prendra contact avec la cornée) d'un court (5 cm) de longueur de fil de platine de 1-2 mm de diamètre. Façonner dans une boucle de quelques mm de diamètre. Connectez cette boucle à une connexion classique, assez long pour atteindre le stade de votre amplificateur d'entrée (voir Figure 4).
2. Construire l'électrode négative (qui ira dans la bouche de l'animal) en utilisant un Ag / AgCl culot 1-2 mm de diamètre, également reliée à une avance de convention (voir Figure 4).
3. Comme une électrode de référence (qui ira dans la croupe de l'animal), utiliser une aiguille hypodermique propre (23 G), également relié à un fil d'une longueur appropriée (voir Figure 4).
4. Idéalement, utiliser des câbles de trois plomb fournies par les fabricants d'instruments, pour relier les trois électrodes (U positif94; cornée, négative → bouche, référence → croupe) à l'amplificateur.

2. Raccordement et étalonnage du stimulus lumineux et ERG Set-up

1. Créez (ou localiser) un petit laboratoire d'enregistrement, qui peut être fait sombre. Equipé d'un ou des deux une lumière over-the-banc en rouge ou une lampe frontale rouge.
2. Utilisez un luxmètre pour confirmer que l'éclairement de la lumière rouge atteindre l'oeil du rat lors de l'installation ne dépasse pas 1 lux.
   Remarque: Un filtre de densité neutre peut être utilisé pour réduire la luminosité de la lampe et la source de lumière de la lampe doit spécifiquement émettre de la lumière rouge. Adaptation à l'obscurité sera compromise si les sources lumineuses émettent plus faibles longueurs d'onde (visibles).
3. Sceller toute lumière parasite entrer dans le laboratoire d'enregistrement (ce qui nécessite souvent la persistance avec du ruban adhésif opaque) et préparer un filtre de densité neutre (ce qui peut être acheté en feuilles) assez grand pour accueillir plus, et si faible, un écran d'ordinateur que vous aurez dans le laboratoire.
   Note: La lumière parasite etla lumière d'un écran sont suffisantes pour porter atteinte adaptation à l'obscurité de l'oeil de rat.
4. Branchez l'amplificateur de matériel d'acquisition de données. Branchez, fils négatifs et positifs référence à l'amplificateur. Assurez-vous que l'ordinateur et l'unité d'alimentation de Ganzfeld LED sont bien connectés à une source de masse.
   Remarque: Certains laboratoires sont spécialisés points de mise à la terre, relié à une masse d'un bâtiment; une conduite d'eau est une alternative efficace.
5. Calibrer la source de lumière LED avec un radiomètre la recherche de qualité. Fixer le capteur de l'appareil de mesure dans la position à laquelle l'oeil de l'animal sera situé au cours d'une expérience.
6. Programme des LED Ganzfeld Pour exécuter un plein champ protocole ERG avec des augmentations graduelles de l'énergie flash, durée de flash, flash répétition et le temps entre les bouffées, appelé intervalle de interstimuls (ISI), les réglages. Pour un protocole exemple plein champ voir le tableau 1.
   Remarque: Le plein champ ERG clignote augmentent à partir répétitives clignote sombres à bdroite clignote dans un sage manière progressive. Le programme flash double suite au protocole de plein champ et permet d'isoler des réponses des bâtonnets et des cônes.

3. Jour Avant ERG Expérimentation

1. Adapter foncé rats Sprague-Dawley pendant 12 heures avant l'enregistrement. Il est commode de le faire dans le laboratoire d'enregistrement, une fois la lumière parasite a été éliminée.

4. Jour de l'ERG Expérimentation

1. Prendre des dispositions pour l'animal d'être chauffé doucement pendant l'enregistrement. Nous utilisons une plate-forme de métal léger construit de telle sorte que la tête de l'animal peut se reposer au point correcte à l'entrée de la Ganzfeld. La plate-forme dispose d'un tube intégré à travers lequel nous pomper l'eau préchauffé à 40 ° C dans un bain d'eau.
   Remarque: L'expérience montre que ce qui maintient la température à coeur de l'animal à 37 ° C.
2. Peser le rat dans des conditions sombres. Enregistrer le poids et maquillage kétamine correcte (60 mg / kg) et de xylazine (5 mg / kg) la dose. Retenez le rat gently et injecter un anesthésique par voie intrapéritonéale.
3. Remarque moment de l'injection. Une fois que l'animal est inconscient (généralement dans les 5 min) vérifier la profondeur de l'anesthésie en pinçant légèrement un plot de pied, pour voir si une réponse réflexe est présent. Il est préférable d'attendre jusqu'à ce que ce réflexe est absente ou faible, avant de poursuivre.
4. Appliquer une seule goutte d'atropine et un autre de proxmethacaine à la cornée.
5. Couper une longueur de 10 cm de fil noir. Faire une boucle avec un nœud simple et glisser la boucle sur l'équateur de l'œil. Serrer légèrement; l'effet est d'attirer l'œil légèrement vers l'avant, avec une pression minimale. Cela permet de maintenir la cornée claire des paupières.
6. Appliquer œil carbomère tombe à la surface de la cornée. Assurer carbomère reste sur la surface de la cornée et ne se renverse sur les paupières ou le visage.
7. Placez la literie absorbante sur le dessus de la plate-forme chauffée.
8. Position rat sur la literie, avec la tête à l'endroit recommandé à l'ouverture de la Ganzfeld.
9. Insérer internal sonde de température dans le rectum. Sonde de température sécurisé en position en collant la sonde cordon à la queue.
10. Insérez l'électrode de référence (l'aiguille 23 G) sous-cutanée dans la patte arrière, et se connecter à un amplificateur.
11. Placer l'électrode négative (la pastille Ag / AgCl) en toute sécurité dans la bouche. Pour éviter ce glisser hors de la bouche, apposer le câble de raccordement sur une surface stable.
12. Placez l'électrode positive sur le centre de la cornée. Utilisation d'un micromanipulateur, veiller à ce que l'électrode touche doucement la cornée.
13. Vérifiez la température du corps est à 37,0 à 37,5 ° C.
14. Une fois que l'animal est correctement positionné et les électrodes sont en place, le drapé toute configuration (Ganzfeld et animale) avec un matériau opaque (pour préserver adaptation à l'obscurité). Nous utilisons un chiffon doux noir.
15. Dans le logiciel d'acquisition fixé à un taux d'échantillonnage de 2 kHz avec un temps de collecte de 100-1000 msec avec 5 ms de pré-collecte échantillonnage. Réglez les filtres passe-bande à 1-1,000Hz et veiller à ce que l'échantillonnage est déclenché pour goûter à la période de ~ 250 ms à la suite d'un flash.
16. Vérifiez la ligne de base de l'enregistrement. Il doit être exempt de bruits parasites, mais montrer un peu de bruit de l'amplificateur et une oscillation respiratoire.
17. Si la ligne de base montre les bruits parasites, commencer le dépannage. La plupart des problèmes sont liés à des dérapages dans la position de l'électrode, ou d'échouement. Utilisez une cage de Faraday pour assurer des enregistrements sont exemptes de bruit parasite.
18. Exécuter un flash test, 0,4 log scot cd.sm ^-2. Une forme d'onde ERG similaire à la figure 2A devrait apparaître. Dans notre laboratoire réponses typiques pour un 0,4 log scot cd.sm ^-2 Flash sont (a-onde: ± 39 mV -474 et b-ondes: 1512 ± 160 mV, n = 11).
19. Laisser animal sombre ré-adapter pendant 10 min. Il est commode d'utiliser ces 10 min pour revérifier la ligne de base.
20. Suite à la confirmation de signal stable commencer l'enregistrement.
21. À la fin de la session d'enregistrement, vérifiez que le corps temperature été maintenue. Retirer électrodes. Appliquez de nouveau polymère carbomère cornées. Permettre à l'animal de récupérer sur un pad thermique jusqu'à ce qu'il soit entièrement mobile et actif, avant de retourner au logement des animaux.

5. ischémie à distance

1. Effectuer une ischémie à distance soit en rongeurs éveillés ou anesthésiés.
2. Si l'animal est anesthésié, le poser sur une plate-forme chauffée (ci-dessus) et glisser le brassard de tensiomètre sur la partie supérieure du membre postérieur, claire du genou.
3. Si les animaux sont habitués à être manipulés, il est possible d'effectuer cette procédure sans anesthésie; cela nécessite deux personnes. Une personne retient l'animal doucement et le second applique le brassard de tensiomètre et exploite le tensiomètre.
4. Pour animaux éveillés, utiliser un morceau de serviette ~ 15 cm x 30-50 cm pour envelopper doucement l'animal, avec l'un des membres postérieurs libre. Couchez l'animal sur le dos sur (par exemple) l'avant-bras gauche, avec sa tête coincée entre le bras et le torse, et la place de titulairele brassard que nous venons de décrire.
5. Dégonfler le brassard et d'assurer la soupape de pression d'air est fermée. Pomper le brassard à 160 mmHg chez les animaux anesthésiés, et à 180 mm Hg chez les animaux éveillés. Cela dépasse la pression systolique (généralement 140 mmHg et 160 mmHg respectivement).
6. Maintenir ces pressions que nécessaire, à l'aide de la pompe à main.
7. Après le temps prévu pour l'ischémie (nous utilisons 2 périodes de 5 minutes séparées par 5 min de reperfusion), dégonfler la pression du brassard en desserrant le robinet de pression d'air.
8. Confirmer l'effet de l'ischémie à distance avec une sonde de température de la peau attachée à la patte. la température de la peau tombe typiquement de 32 à 30 ° C, pendant 5 minutes et récupère sur reperfusion.

6. Light Damage

1. Veiller à ce que les rats sont dans un avant adaptés à l'obscurité la nuit, la procédure de légers dégâts.
2. Au moment opportun, suivant une ischémie des membres (dans nos expériences sans retard), chaque animal est placé seul dans une des boîtes en plexiglas, wie de l'eau et de la nourriture dans des contenants à base de sol.
   Remarque: les dommages induits par la lumière ne peut être effectuée chez les animaux albinos.
3. Allumez une lumière blanche 1000 lux pré-calibré à un temps standard (généralement de 9 h) et maintenir cet état pendant 24 heures.

7. ERG Extraction et analyse des données

1. Acquérir des formes d'ondes moyennes de l'ERG. Si nécessaire, pour corriger un niveau de référence différent de zéro, par soustraction.
2. Mesurer l'amplitude de l'onde-(présenté à moyen et à de fortes intensités de relance), comme la différence de tension entre la base et le premier (<30 ms de latence) bac (Figure 1).
3. Mesurer l'amplitude de l'onde b que la différence de tension entre le pic de l'a-onde et le positif de la vague suivante, survenant généralement à une latence de 80-100 ms (Figure 1).
4. Isoler les potentiels oscillatoires en utilisant une transformée de Fourier pour filtrer des données 60-235 Hz, avec une bande de transition 90 Hz ^{7. Si nécessaire, le signal de potentiel oscillatoire isolé peut ensuite être soustraite de la forme d'onde non filtrée pour confirmer l'identité de l'auge une onde.}
5. Le temps implicite (latence) des A et B-ondes pics peut aussi être une mesure utile (Figure 1). Utilisez les bouffées de jumeaux pour isoler la réponse de la tige. Soustraire la réponse des cônes (flash 2) de la réponse mixte (flash 1) pour isoler la réponse de la tige (Figure 2).
6. Normaliser l'intensité de la lumière individu une onde et des amplitudes b-ondes (post-traitement / post-traitement de base) ou en moyenne pour les groupes de traitement. Courbes intensité-réponse tracer les amplitudes de groupe et l'erreur contre l'énergie flash.

Résultats

Le protocole peut être utilisé pour mesurer la fonction visuelle de la rétine rongeur in vivo. L'un-ondes, une mesure de la fonction des photorécepteurs et le b-ondes, une mesure de la fonction de la rétine interne, sont annotés dans la figure 1.

Les ERG augmentations de signaux de tige-dominé avec le stimulus lumineux croissante, comme le montre la figure 2A. L'un d'onde devient apparente à ~ 0,4 log scot cd.sm ^-2 et ...

Discussion

Le flash méthode adaptée à l'obscurité ERG décrit ci-dessus est une méthode fiable pour évaluer la fonction rétinienne chez les rats. Tant l'un d'onde et b-ondes ont été réduites par des dommages de la lumière. Distance préconditionnement ischémique atténué réductions induit des dommages-légers dans le un-ondes et b-ondes. Cette préservation de la fonction rétinienne suggère que le préconditionnement ischémique à distance a induit la neuroprotection, ressemblant à d'autres formes...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware	AD Instruments	PL 35044	Acquistion of ERG
Animal Bio Amp	AD Instruments	FE 136	Amplifier for ERG
Lab chart	AD Instruments		Signal collection software
Ganzfield	Photometric solutions	FS-250A	Light stimulus
Ganzfield operating system	Photometric solutions
Research Radiometer	International light technologies	ILT-1700	calibrate light series
Lux meter		LX-1010B	check red light illumanation
Excel	Microsoft
Lead wires	AD Instruments		Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator	AD Instruments		ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95%	A&E metals		postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet	SDR	E205	negative electode
26 G needle	BD		ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe	Harvard Appartus	507222F
Atropine 1% w/v	Bausch & Lomb		topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v	Bausch & Lomb		topical anaesthetic
Visco tears eye drops	Novartis		carbomer polymer
Thread			retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive	Blu tac		Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		muscle relaxant
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