إنتاج وتوصيف والمحتملة استخدامات الأنسجة المهندسة-3D الإنسان المريء المخاطي نموذج

Summary

تصف هذه المخطوطة إنتاج وتوصيف والاستخدامات المحتملة لالأنسجة المهندسة 3D بناء المريء المعدة من المريء الطبيعية الأولية الخلايا الليفية والخلايا البشرية الظهارية الحرشفية المصنفة ضمن سقالة دي cellularized الخنازير. أظهرت النتائج وتشكيل ظهارة طبقية ناضجة مماثلة إلى المريء الإنسان العادي.

Abstract

وقوع كل من غدية المريء والسلائف، حؤول باريت، ترتفع بسرعة في العالم الغربي. وعلاوة على ذلك غدية المريء عموما لديها سوء التشخيص، مع تحسن طفيف في معدلات البقاء على قيد الحياة في السنوات الأخيرة. هذه هي ظروف صعبة للدراسة، وكان هناك نقص في منصات التجريبية المناسبة لتحقيق اضطرابات في الغشاء المخاطي المريء.

وقد تم تطوير نموذج الغشاء المخاطي المريء البشري في المختبر ماكنيل الذي، على عكس الأنظمة خلية ثقافة 2D التقليدية، يلخص خلية خلية وخلية مصفوفة التفاعلات الموجودة في الجسم الحي وينتج ناضجة، ظهارة طبقية مماثلة لتلك التي للإنسان العادي المريء. لفترة وجيزة، ونموذج يستخدم خلايا غير طبيعية تحولت الخلايا الليفية المريء الإنسان الأساسية والظهارية نمت داخل ديكي سقالة المريء المشتقة من الخنازير. توصيف المناعى لهذا النموذجبواسطة CK4، CK14، Ki67 وinvolucrin تلطيخ يوضح خلاصة المناسب للأنسجة المخاطية المريء الإنسان العادي.

يوفر هذا النموذج نموذج قوي، بيولوجيا التجريبية من الغشاء المخاطي المريء البشري. يمكن بسهولة أن يتم التلاعب بها لتحقيق عدد من الأسئلة البحثية بما في ذلك فعالية كلاء الدوائية وتأثير التعرض للعوامل البيئية مثل الكحول والسموم، وارتفاع في درجة الحرارة أو مكونات refluxate المعدي المريئي. يسهل هذا النموذج أيضا فترات ممتدة الثقافة لا يمكن تحقيقها مع خلية ثقافة 2D التقليدية، مما يتيح، في جملة أمور، ودراسة تأثير التعرض المتكرر للظهارة ناضجة لوكيل لمصلحة لمدة تصل إلى 20 يوما. وعلاوة على ذلك، ومجموعة متنوعة من خطوط الخلايا، مثل تلك المستمدة من أورام المريء أو حؤول باريت، يمكن إدراجها في النموذج للتحقيق في عمليات مثل غزو الورم وresponsivene المخدراتSS في بيئة أكثر ملاءمة من الناحية البيولوجية.

Introduction

ويتكون الغشاء المخاطي المريء والطبقية، ظهارة الحرشفية فوق طبقة من النسيج الضام، الصفيحة المخصوصة، ويعد واحدا من المواقع الأولى لمواجهة الضغوطات البيئية بلعها. هو متورط التعرض للسموم الغذائية في تطور سرطان المريء الحرشفية، بينما-duodenogastro المريء الجزر هو العامل الحاسم في التسبب في حؤول باريت، الذي يرتبط مع زيادة خطر تطور الى غدية المريء. سرطان المريء هي الورم الخبيث الأكثر شيوعا ^ال 8 في الذكور UK وغدية المريء يتزايد بسرعة في العالم الغربي ^1. وعلاوة على ذلك، كان هناك تحسن طفيف في تشخيص المرض، مع معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات الإجمالي حوالي 15٪. ونتيجة لذلك هناك حاجة لمنصات التجريبية للتحقيق في تأثير التعرض للضغوطات البيئية على هذا ظهارة المريء ومشاركتها المحتملة في development من حؤول أو الأورام.

على الرغم من خطوط الخلايا خلد أو ورم تسمح للباحثين لدراسة استجابة الخلايا الظهارية لهذه الضغوطات في المختبر، إلا أنها تظل التكاثري وتفشل في التمايز إلى خلايا الظهارية ناضجة وجدت على الطبقات العليا من الغشاء المخاطي المريء. وعلاوة على ذلك، وخطوط الخلايا التي خضعت بالفعل تكون الأورام قد توفر معلومات محدودة فقط بشأن الاستجابات الأولية من الخلايا الطبيعية داخل الظهارة إلى العوامل البيئية؛ وهذه هي المرحلة عندما إمكانية التدخل العلاجي قد تكون أعلى. أخيرا، تفشل نظم زراعة الخلايا التقليدية للقبض على التفاعلات المهمة المحتملة بين الخلايا الظهارية والوسيطة وبين هذه الخلايا والمصفوفة المحيطة التي تحدث داخل أنسجة في الجسم الحي.

النماذج الحيوانية توفر المكروية أكثر واقعية لدراسة ردود epitheli المريءأم ويمكن أن تتضمن تحريض الاصطناعي لل-مرض الجزر المعدي المريئي ^(2). لكن يمكن أن يكون أكثر تحديا لمعالجة الضغوطات البيئية في هذه النماذج وأنها قد لا تمثل تماما على رد في غضون المريء البشري.

وقد وضعت نماذج تجريبية المريء الإنسان الأخرى التي تستخدم الخلايا الأولية، وخلايا خلدت أو خطوط الخلايا السرطانية على الكولاجين، أو الجمع بين الكولاجين / Matrigel، سقالة التي تحتوي على الخلايا الليفية ^3،4. أنها أقل كثافة عمالية لتوليد هذه الاطر من سقالة المريء ديكي وصفها في هذه المخطوطة، وهذه النماذج عضوي النمط توفر أداة مفيدة، ولا سيما في دراسة غزو الورم ^5،6، حيث تسلل الخلايا السرطانية في هلام الكولاجين يمكن أن يكون بسهولة لوحظ. ولكن هذه المواد الهلامية الكولاجين لها خصائص ميكانيكية غير الأصلية وتفتقر إلى ميزات معينة من الأنسجة الأصلية، بما في ذلك الغشاء القاعدي محددة وappropriatالبريد تضاريس السطح. هذا يمكن أن تؤثر على سلوك الخلايا الناتجة، على سبيل المثال، التصاق فقرا بين الظهارة وسقالة عند استخدام الكولاجين هلام سقالة ^7. ونتيجة لذلك تم تطوير سقالة المريء الخنازير ديكي، مع ميزة كونها سقالة أكثر واقعية من الناحية البيولوجية، وبالتالي أكثر ملاءمة للاستخدام كمنصة التجريبية. وقد تبين أيضا أنه من الأفضل أن دمج الخلايا الأولية في بنيات المريء من خطوط الخلايا الظهارية خلد المريء، مثل هيت-1A، لأن هذه الخلايا تشكل ظهارة متعددة الطبقات لكنه يفشل في تطبق أو تمييز ^4،7،8 .

ونتيجة لذلك، تم تكييف هذا البروتوكول من طريقة مستخدمة بالفعل في المختبر ماكنيل لصنع الأنسجة المهندسة الجلد والغشاء المخاطي للفم ^9،10 ويشتمل على الخنازير سقالة دي cellularized المريء جنبا إلى جنب مع خلايا المريء الإنسان الأساسية الظهارية والخلايا الليفية. ثيالصورة بروتوكول ينتج ناضجة، ظهارة طبقية، مماثلة لتلك التي من المريء الإنسان العادي كما يتبين من CK4، CK14، Ki67 وinvolucrin تلطيخ. يوفر النموذج الناتج منصة تجريبية لدراسة الردود على الضغوطات البيئية، واستخدمت على نحو فعال لتحقيق تغييرات في التعبير الجيني في الظهارة المريء ردا على refluxate مكونات ^11.

Protocol

ويتم الحصول على خلايا المريء الإنسان من المرضى الذين يخضعون لعملية جراحية في المعدة أو المريء. يتم الحصول على الموافقة المسبقة للأنسجة لاستخدامها لأغراض البحث، والأنسجة المستخدمة مجهول تحت الموافقات الأخلاقية المناسبة (SSREC 165/03، الأنسجة البحوث الإنسانية البنك رخصة 12179).

1. عزل خلايا الإنسان الظهارية المريء

1. العمل في تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة وباستخدام تقنية معقمة، وإعداد مستنبت الظهارية عن طريق خلط المتوسطة Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) وF12 هام في 3: 1 نسبة (ت: ت). إضافة 10٪ (ت / ت) FCS، 10 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة، 0.4 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون، 1.8 × 10 ^-4 M الأدنين، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 2 × 10 ^-7 M ثلاثي يودوثيرونين، 1 × 10 ^-10 M الكوليرا السم، 2 × 10 ^-3 M الجلوتامين، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و0.625 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B.
2. استخدام معيارتقنيات معقمة، ووضع 11 مل من DMEM، و 10٪ FCS، 2 × 10 ^-3 M L-الجلوتامين، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و0.625 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B في قارورة الثقافة الأنسجة T75. إضافة 1 × 10 ⁶ المشع القاتلة الماوس 3T3 الخلايا الليفية ¹² في 1 مل من نفس المتوسطة واحتضان ليلا 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2، جو مرطب. هذا وسوف تنتج طبقة المغذية للثقافة اللاحقة من الخلايا الظهارية.
3. باستخدام مشرط وبناء على توصيات من اختصاصي الهيستوباثولوجيا، تشريح لحوالي 2 سم ² عينة من نسيج المنطقة الخلفية خالية من مرض الغشاء المخاطي الحرشفية المريء تم الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لعملية جراحية في المعدة أو المريء. النقل إلى المختبر في حاوية 50 مل من المتوسط ​​النقل معقم (PBS 100 وحدة دولية / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 0.625 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B) في درجة حرارة الغرفة.
4. في هذه المرحلة، وتخزين الأنسجة في النقلمتوسطة لمدة تصل إلى 12 ساعة (بين عشية وضحاها) في 4 درجات مئوية، لمدة الراحة. ولكن لا تستخدم فترات التخزين لفترات أطول كما أنها تؤدي إلى انخفاض بقاء الخلية.
5. العمل في تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة وباستخدام تقنية معقمة، تعقيم شفرة مشرط عن طريق نقع في الايثانول 70٪ لمدة 5 دقائق. شطف في برنامج تلفزيوني العقيمة.
6. وضع الأنسجة في طبق بتري معقمة واستخدام مشرط لقطع عليه إلى 0.5 سم شرائح. إضافة 5 مل من 0.1٪ (ث / ت) التربسين في برنامج تلفزيوني على طبق بيتري، ووضع غطاء على طبق واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
7. إضافة 5 مل من FCS إلى الأنسجة في طبق بيتري لمنع التربسين. عقد الشريط من الأنسجة مع ملقط معقم، كشط بلطف على سطح الظهارية مع شفرة مشرط لمدة 1-2 دقيقة لكل قطاع لإزالة الخلايا الظهارية في الوسط المحيط. إزالة الأنسجة كشط وتوضع جانبا. تكرار هذه العملية لجميع شرائح الأنسجة.
8. جمع المتوسطة التي تحتوي على الخلايا الظهارية منفصلة في أنبوب الطرد المركزي 15 ملوأجهزة الطرد المركزي (5 دقائق، 200 x ج). تخلصي من طاف و resuspend بيليه في 12 مل من المتوسط ​​الظهارية (موضح في الخطوة 1.1).
9. تخلصي وتجاهل المتوسطة من طبقة الخلايا المغذية في قارورة T75 أعدت في الخطوة 1.2. استخدام ماصة معقمة لإضافة تعليق الخلية التي تحتوي على الخلايا الظهارية المعزولة حديثا إلى القارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2، جو مرطب.
10. بعد 24 ساعة من أجل الخروج والتخلص من ثقافة المتوسط، والتي سوف تحتوي أيضا على الحطام الخلية، واستبدالها مع 12 مل من المتوسط ​​الظهارية الطازجة. مواصلة احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2، جو مرطب. وسوف تبدأ المستعمرات لتظهر مدى 24-48 ساعة القادمة، ويمكن مشاهدتها من خلال وضع قارورة الثقافة تحت المجهر ضوء معيار. تخلصي من مستنبت المستهلك واستبدالها مع حجم مساو من متوسطة جديدة كل 2-3 أيام.
11. مرة واحدة وصلت القارورة 80٪ confluency، والمرور على الخلايا ^13. تقسيم جملتعلمي اللغة اإلنكليزية في نسبة 1: 5 لزيادة أعداد الخلايا لاستخدامها في النموذج. اتبع الخطوة 1.2 لإنشاء طبقات المغذية من المشع 3T3 الخلايا في كل قارورة من شأنها أن تلقي الخلايا الظهارية 24 ساعة قبل الركض الخلايا.
    ملاحظة: استخدام الخلايا الظهارية في نموذج المريء هو موضح أدناه بين المقاطع 1 و 4 فقط.

2. عزل المريء الخلايا الليفية الإنسان

1. العمل في مجلس الوزراء تدفق الصفحي واستخدام تقنية معقمة، واتخاذ الأنسجة جانبا في الخطوة 1.7. وضع في طبق بتري معقمة واللحم المفروم ناعما من قبل تقطيع بشفرة مشرط معقم. إضافة 10 مل من 0.5٪ (ث / ت) كولاجيناز حل ووضع غطاء على طبق بيتري واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل في 5٪ CO _2، جو مرطب.
2. نقل الملخص إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي (10 دقيقة، 200 x ج)، بعناية صب قبالة وتجاهل طاف و resuspend بيليه في 10 مل من ثقافة الخلايا الليفية المتوسطة (DMEM 10٪ FCS، 2 × 10 ^-3 M L-الجلوتامين، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و0.625 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B).
3. ضع تعليق في قارورة T75 واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2، جو مرطب. بعد 24 ساعة تخلصي من المتوسط، والتي سوف تحتوي على الحطام واستبدالها مع 12 مل من المتوسط ​​الخلايا الليفية الطازجة. استبدال الثقافة المتوسطة كل 2-3 أيام وخلايا مرور بمجرد أن وصلت إلى 80٪ confluency ^13، تقسيم الخلايا في نسبة 1: 5 لزيادة أعداد الخلايا.
   ملاحظة: استخدام الخلايا الليفية في النموذج المبين أدناه بين الممرات 4 و 10 فقط.

3. إعداد المريء سقالة دي cellularized-

1. الحصول على حالها الخنازير للمريء في مسلخ من سلالة الخنازير المذبوحة الطازجة التي تستخدم لإنتاج الغذاء. واحد المريء واحد يوفر السقالات كافية لحوالي 30 بنيات منفصلة.
   ملاحظة: نظرا للرئيسين واسعة النطاق والوقتnsuming بروتوكول التعقيم المطلوبة، فمن عادة يستحق الحصول على وتجهيز ما لا يقل عن 10 مريء في وقت واحد.
2. المكان على الفور المريء رفعه حديثا الى 180 مل وعاء العقيمة التي تحتوي على ما يقرب من 150 مل من 10٪ محلول البوفيدون اليود لمدة 5 دقائق للحد من أي الميكروبات الملوثة. نقل المريء إلى وعاء ثان تحتوي على ما يقرب من 100 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على 200 وحدة دولية / مل البنسلين، 200 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 1.25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B.
   1. استبدال الغطاء عن الحاوية ونقل للمريء مرة أخرى إلى المختبر في درجة حرارة الغرفة. يمكن نقلها اثنين أو ثلاثة للمريء في كل حاوية، وهذا يتوقف حجمها.
3. مرة واحدة في المختبر، والتعامل مع الأنسجة في غطاء تدفق الصفحي باستخدام تقنية العقيم للحد من التلوث الميكروبي. تعقيم ملاقط ومقصات وشفرات المشرط عن طريق نقع لمدة 5 دقائق في 70٪ من الإيثانول، والشطف في برنامج تلفزيوني العقيمة.
4. التعامل مع وفاقophagus باستخدام الملقط معقمة. باستخدام مقص، وقطع مفتوحة المريء طوليا. شطف الأنسجة عن طريق وضع المريء إلى 180 مل وعاء العقيمة التي تحتوي على ما يقرب من 100 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة ويهز بلطف لإزالة أي حطام.
5. تنظيف لوحة تشريح الفلين عن طريق رش تحرري مع الايثانول 70٪ والسماح ليجف.
6. إزالة المريء من برنامج تلفزيوني، واستخدام الإبر المعقمة، دبوس من المريء على متن الطائرة، تحتل مركز الصدارة سطح الغشاء المخاطي. فهم سطح الغشاء المخاطي في واحدة من نهاية المريء مع ملاقط معقمة وسحب بعيدا من المجلس. وهذا فصل الغشاء المخاطي من تحت المخاطية الأساسية.
   1. ثم، استخدم شفرة مشرط معقم لتشريح المريء طوليا على امتداد الصفيحة المخصوصة، وإزالة المسامير كما تقدم تشريح للسماح الغشاء المخاطي لأن يرفع بعيدا.
7. الإبقاء على الغشاء المخاطي تشريح وتجاهل مخاطية الأساسية.
8. قطع وتجاهل معظم الداني والقاصي سم 2 رانه الغشاء المخاطي كما أن هناك عدد أكبر من الغدد تحت المخاطية وأكثر سمكا الصفيحة المخصوصة في تلك المناطق، على التوالي ^7.
9. استخدام مشرط لقطع الأنسجة المتبقية إلى 5 سم ^2. إخضاع جميع الأنسجة خفض إلى 180 مل وعاء العقيمة التي تحتوي على ما يقرب من 150 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة وتستنهض الهمم بلطف لشطف الأنسجة. إذا تجهيز أكثر من خمسة مريء في وقت واحد قد يكون من الضروري استخدام الأواني متعددة لهذا والخطوات اللاحقة الثلاثة.
10. استخدام ملاقط معقمة، ونقل الأنسجة قطع في وعاء 180 مل تحتوي على 150 مل من معقم 1 M كلوريد الصوديوم، و 200 وحدة دولية / مل البنسلين، 200 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 1.25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B. احتضان لمدة 72 ساعة على 37 درجة مئوية.
11. وضع النسيج في وعاء 180 مل الطازجة التي تحتوي على 150 مل PBS العقيمة. وبدأت ظهارة لفصل واضح من الأنسجة الكامنة وراءها. قشر بلطف ظهارة فصل من المريء خنزير باستخدام ملقط معقم وتجاهل.
    1. ضع ر المتبقيةالمسألة في وعاء 180 مل جديدة وإضافة 150 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. تستنهض الهمم برفق لمدة 5 دقائق لغسل. تخلصي من برنامج تلفزيوني وتكرار مزيد من مرتين مع برنامج تلفزيوني جديد.
12. إخضاع جميع الأنسجة في زجاجة 500 مل تحتوي على 400 مل من العقيمة 80٪ (V / V) حل الجلسرين لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. نقل إلى 400 مل من العقيمة 90٪ (V / V) حل الجلسرين لمدة 24 ساعة أخرى.
13. تخزين في 400 مل من معقم 100٪ الحل الجلسرين في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 4 أشهر ليذوى وتعقيم الأنسجة مع الحفاظ على سلامة الغشاء القاعدي.

4. إنتاج وسائل الإعلام الثقافة

1. إعداد بالكلاب مصل العجل لاستخدامها في مستنبت.
   1. صب 100 غرام من Chelex 100 إلى L زجاجة 1 وإضافة الماء غير المتأينة. حجم الدقيق ليست حرجة ولكن يجب إضافة ما يكفي من المياه لتغطية مسحوق Chelex. إضافة محرك مغناطيسي وتعقيم بواسطة التعقيم (121 درجة مئوية لمدة15 دقيقة).
   2. السماح للزجاجة لتبرد وChelex لتسوية. في مجلس الوزراء تدفق الصفحي تخلصي من الماء الزائد، إضافة 500 مل من مصل العجل الوليد (NCS) وتترك لاثارة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   3. وقف اثارة والسماح للChelex إلى تسوية، وهذا يمكن أن يستغرق فترة تصل الى 30 دقيقة. في مجلس الوزراء تدفق الصفحي صب المصل بالكلاب باستخدام ماصة معقمة، مع الحرص على عدم تعكير صفو Chelex، وتخزينها في 10 مل aliquots في -20 ° C.
2. إعداد ثلاث وسائل الإعلام المختلفة في مجلس الوزراء تدفق الصفحي، بدءا المؤيدة للالتكاثري وتنتهي مع تركيبات الموالية للdifferentiative.
   1. إعداد المركب المتوسطة I تتألف من DMEM وحماس F12 في نسبة 3: 1 (ت: V)، 4 × 10 ^-3 M L-الجلوتامين، 0.5 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون، 1 × 10 ^-4 M O -phosphorylethanolamine، 2 × 10 ^-12 M ثلاثي يودوثيرونين، 1.8 × 10 ^-4 M الأدنين، 1.88 × 10 ^-3 M CaCl _2، 4 × 10 ^-12 M البروجسترون، 10 ميكروغرام / مل فيsulin، 10 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 10 نانوغرام / مل السيلينيوم، 1 × 10 ^-3 M ايثانول و 0.1٪ (V / V) بالكلاب NCS.
   2. إعداد المركب المتوسطة II كما المركب المتوسطة I باستثناء استبدال المصل بالكلاب بنسبة 0.1٪ (V / V) NCS غير بالكلاب.
   3. إعداد المركب متوسط ​​III كما المركب المتوسطة II باستثناء البروجسترون حذف وزيادة المصل إلى 2٪ (V / V) NCS غير بالكلاب.

5. الإنتاج من المريء الغشاء المخاطي نموذج الإنسان

1. أداء جميع الأعمال في غطاء تدفق الصفحي، وذلك باستخدام تقنية العقيم للحفاظ على بيئة معقمة. تعقيم جميع الأدوات التي تمرغ في الايثانول 70٪ لمدة 5 دقائق، قبل الشطف في برنامج تلفزيوني العقيمة.
2. قبل يوم واحد هو مطلوب منها، ترطيب سقالة المريء الخنازير ديكي. مطلوب قطعة واحدة من سقالة لكل بناء لتكون مستعدة.
   1. لترطيب المكان الأنسجة قطع كافية من سقالة الخنازير في وعاء يحتوي على 100 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة، تستنهض الهمم وينقع لمدة 10 دقيقة. عشاريالإقليم الشمالي في برنامج تلفزيوني واستبدالها مع برنامج تلفزيوني جديد. تكرار عملية غسل خمس مرات لضمان إزالة كل آثار الجلسرين.
3. اختبار العقم السقالة التي يحتضنها الأنسجة ممهى بين عشية وضحاها في 100 مل من DMEM عند 37 درجة مئوية. إذا كان هناك أي تغيير في اللون أو تعكر من مستنبت في نهاية فترة الحضانة يفترض السقالة أن تكون معقمة. مرة واحدة وقد تم تأكيد العقم، ضع 5 سم ² اخلوي السقالة إلى لوحة 6 جيدا، والجانب العلوي تحت المخاطية.
4. وضع معقمة الطبية الصف حلقة من الصلب المقاوم للصدأ (الداخلية قطرها 10 مم، 20 مم القطر الخارجي) على مركز كل سقالة واضغط برفق باستخدام ملقط معقم، لضمان وجود ختم كافية مع الأنسجة.
5. حصاد الخلايا الليفية باستخدام التربسين ^EDTA-13 لإنتاج تعليق خلية. عد الخلايا باستخدام haemocytometer ^14. الطرد المركزي تعليق خلية (10 دقيقة، 200 x ج). resuspend الكرية الخلية إلى appropriaحجم الشركة المصرية للاتصالات من الخلايا الليفية المتوسطة لإنتاج خلايا النهائي من 2.5 × 10 ⁶ خلايا لكل مل.
6. إضافة 0.2 مل من الخلايا الليفية المتوسطة، تحتوي على 5 × 10 ⁵ الخلايا الليفية المريء الإنسان، في كل حلقة. إغراق المنطقة المحيطة خارج الحلبة مع ما يقرب من 2 مل من الخلايا الليفية المتوسطة. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2، جو مرطب.
7. بعد 24 ساعة إزالة الحلقات والخلايا الليفية المتوسطة وإضافة 5 مل على الأقل من المتوسطة الليفية جديدة إلى كل بئر، وضمان أن السقالة ويغرقها في المتوسط. الثقافة ل1 أسبوع، عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2، جو مرطب استبدال المتوسط ​​كل 2-3 أيام.
8. بعد 1 أسبوع إزالة لوحات بشكل جيد 6 تحتوي على السقالات لفيضان هود الصفحي، وإزالة المتوسطة وعكس كل سقالة باستخدام ملقط معقم، وضع على سطح الغشاء المخاطي العلوي. ويشار إلى هذه النقطة الوقت لكما يوم 0.
9. وضع حلقات الصلب على سطح الغشاء المخاطي في وسطالأنسجة كما في الخطوة 5.4.
10. إعداد قوارير T75 من الخلايا الظهارية للtrypsinization ^13. بعد PBS غسل وقبل إضافة محلول التربسين-EDTA، إضافة 2 مل من العقيمة 0.02٪ (وزن / حجم) حل EDTA لكل قارورة. احتضان لمدة 2 دقيقة عند 37 ° C. اضغط على قارورة برفق لفصل انتقائي الطبقة المغذية i3T3 بينما يترك الخلايا الظهارية المرفقة.
    ملاحظة: ومن المسلم به عموما ليس من العملي أو الضروري لمريض تطابق الخلايا الظهارية إلى الخلايا الليفية أدرجت بالفعل في النموذج الأسبوع السابق.
11. تخلصي من حل EDTA تحتوي على طبقة المغذية وإضافة الحل التربسين-EDTA لحصاد الخلايا الظهارية ^13. عد الخلايا باستخدام haemocytometer ^14. الطرد المركزي تعليق خلية (10 دقيقة، 200 x ج). resuspend الكرية الخلية إلى حجم مناسب من المركب المتوسطة 1 لإنتاج خلايا النهائي من 5 × 10 ⁶ خلايا لكل مل.
12. إضافة 0.2 مل من المركب المتوسطة I، التي تحتوي على 1 × 10 ⁶ خلايا الظهارية، داخل الحلبة. إغراق المنطقة المحيطة خارج الحلبة مع ما يقرب من 2 مل من المركب المتوسطة الأول ووضع بنيات في حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2، جو مرطب.
13. بعد 24 ساعة (يوم 1) إزالة حلقات والمتوسطة وإضافة 5 مل على الأقل من جديد مركب متوسط ​​I، وضمان مغمورة تماما السقالات والعودة إلى الحاضنة. بعد 24 ساعة أخرى (اليوم 2) إزالة المتوسطة واستبدالها مع 5 مل على الأقل من مركب متوسط ​​II، مرة أخرى ضمان وغرقت بالكامل السقالات والعودة إلى الحاضنة.
14. في يوم 4 المكان الصف الطبية المعقمة الفولاذ المقاوم للصدأ شبكات سلكية (2 سم × 2 سم × 0.5 سم ارتفاع)، في 6 لوحات جيدا جديدة، واحدة لكل بناء. استخدام ملاقط معقمة لنقل يبني على الجزء العلوي من شبكات الصلب، والغشاء المخاطي العلوي السطح.
    1. إضافة ما يكفي من مركب متوسط ​​III بحيث يصل السائل الجانب السفلي من المركبة، ولكن السطحمعرضة للهواء، وهذا يضمن أن يتم الحفاظ على العينة في واجهة الهواء السائل. حجم الدقيق المتوسطة المطلوبة سوف تختلف تبعا لسمك السقالة، وحجم البئر وارتفاع الدقيق للشبكة الفولاذ المقاوم للصدأ.
15. الحفاظ على المركبة في واجهة الهواء السائل لمدة تتراوح بين 10 و 20 يوما (يوم 14 إلى يوم 24)، تبعا لمتطلبات التجربة. استبدال مركب متوسط ​​III مع متوسطة جديدة كل 2 إلى 3 أيام (الاثنين والأربعاء والجمعة هو نظام سهل الاستعمال).
    ملاحظة: بعد 5 أيام على واجهة الهواء السائل (يوم 9) ويبني لها ظهارة المريء ناضجة بما فيه الكفاية لاستخدامها في تجارب على تأثير العوامل البيئية على ظهارة المريء.
16. في نهاية التجربة، وتحديد بنيات للتحليل النسيجي وتلطيخ المناعى ^7، أو استخراج البروتين ¹⁵ أو RNA ^11،16 من ظهارة لمزيد من ANALYSهو. إذا لزم الأمر، الإبقاء على مستنبت مكيفة لتحليل الخلية الجزيئات يشير ^17.

النتائج

تصف هذه المخطوطة العملية المطلوبة، كما هو موضح في الشكل التخطيطي في الشكل 1، إلى ثقافة 3D نماذج من ظهارة المريء الإنسان بنجاح. لتأكيد مدى ملاءمة هذا النموذج بوصفه اتخذت لالنسيجية منصة تجريبية ودراسات مقارنة المناعى أنسجة مثقف مع العادي البشري مخاطية المريء ?...

Discussion

تصف هذه المخطوطة إنتاج وتوصيف المريء البشري نموذج الغشاء المخاطي بيولوجيا مناسبة لاستخدامها بوصفها منصة تجريبية لدراسة تأثير التعرض للالضغوطات البيئية على ظهارة المريء.

الخطوات الأكثر أهمية لإنتاج الناجح لنموذج الغشاء المخاط...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsin	BD Biosciences	215240	Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use.
DMEM	Labtech	LM-D1112	Warm in 37 °C water bath before use
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37 °C water bath before use
Foetal Calf Serum	Labtech	FB-1090
Epidermal Growth Factor	R+D Systems	236-EG-200	Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone	Sigma-Aldrich	H0396	Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Insulin	Sigma-Aldrich	I2767	Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use
Transferrin	Sigma-Aldrich	T2036	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	Prepare stock solution in water
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Brand name Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize
Collagenase A	Roche	10103578001
Povidone-iodine solution	Ecolab	10830E	Brand name Videne
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Newborn calf serum	Gibco	26010074
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use
O-phosphorylethanolamine	Sigma-Aldrich	P0503	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
ITS (insulin, transferrin, selenium)	Lonza	17-838Z	Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
EDTA 0.02% solution	Sigma-Aldrich	E8008	Warm in 37 °C water bath before use
T75 culture flask	VWR	734-2313
50 ml centrifuge tube	Fisher	11819650
15 ml universal tube	SLS	SLS7504
180 ml pot	VWR	216-2603
Petri dish	SLS	150350
6 well plate	VWR	734-2323
stainless steel rings			Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids			Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clone MM1. Use at 1:100.
CK4	Abcam	ab9004	Clone 6B10. Use at 1:200.
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clone LL002. Use at 1:200.
Involucrin	Novocastra	INV	Clone SY5. Use at 1:100.
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts	ATCC-LGC	CRL-1658	previously growth arrested by irradiation (60 Gy)