Производственные, характеристики и потенциальные возможности использования в 3D тканевой инженерии человека пищевода слизистой модели

Резюме

Эта рукопись описывает производства, характеристика и возможности использования ткани инженерии 3D пищевода конструкта, полученного из нормальной первичной пищевода фибробластов человека и клеток плоского эпителия, посеянных в свиной эшафот де-cellularized. Полученные результаты показывают, формирование зрелого стратифицированного эпителия подобна нормальной человеческой пищевода.

Аннотация

Заболеваемость как аденокарциномы пищевода и его предшественник, метаплазия Барретта, быстро растет в западном мире. Кроме того аденокарциномы пищевода, как правило, имеет плохой прогноз, с небольшим улучшением выживаемости в последние годы. Это трудные условия для изучения и было отсутствие подходящих экспериментальных площадок по расследованию нарушений слизистой оболочки пищевода.

Модель слизистой оболочки пищевода человека был разработан в лаборатории Макнил, который, в отличие от обычных систем 2D клеточной культуры, повторяет клетке-клетка и клетка-матрица взаимодействий, присутствующих в естественных условиях, и производит зрелый многослойный эпителий, аналогичной той, что нормального человека пищевода. Вкратце, эта модель использует нетрансформированные нормальные первичные фибробласты человека пищевода и эпителиальные клетки, выращенные в бесклеточной пищевода помост свиного происхождения. Иммуногистохимическое характеристика этой моделипо CK4, CK14, Ki67 и инволюкрина окрашивание демонстрирует соответствующий суммировании гистологии нормальной слизистой оболочки пищевода человека.

Эта модель обеспечивает надежную, биологически соответствующий экспериментальную модель слизистой оболочки пищевода человека. Это может быть легко манипулировать, чтобы исследовать ряд исследовательских вопросов, включая эффективности фармакологических агентов и последствий воздействия факторов окружающей среды, таких как алкоголь, токсины, высокая температура или желудочно-пищеводного компонентов рефлюксата. Модель также способствует длительные периоды не достижимые с обычным 2D культуры клеток, позволяя, в частности культуры, изучение влияния многократного воздействия зрелой эпителия агента интерес на срок до 20 дней. Кроме того, различные клеточные линии, такие как соли, полученные из опухолей или пищевода Барретта метаплазии, могут быть включены в модель, чтобы исследовать процессы, такие как инвазии опухоли и наркотиков responsiveneсс в более биологически соответствующий среде.

Введение

Слизистой оболочки пищевода включает слоистую, плоскоклеточный эпителий выше слоя соединительной ткани, в собственной пластинке, и является одним из первых сайтов, сталкиваются попадании экологических стрессоров. Воздействие диетических токсинов участвует в развитии плоскоклеточного рака пищевода, в то время как duodenogastro-пищеводного рефлюкса является критическим фактором в патогенезе метаплазии Барретта, который связан с повышенным риском прогрессирования аденокарциномы пищевода. Пищевода карцином ^8-й наиболее частой злокачественной опухоли в Великобритании мужчин и аденокарциномы пищевода быстро растет в западном мире ^1. Кроме того, было небольшое улучшение прогноза заболевания в, с общим уровнем 5-летняя выживаемость составляет около 15%. Следовательно, существует потребность в экспериментальных площадок для расследования последствий воздействия экологического стресса на этом эпителия пищевода и их возможного участия в Develoмат ветствующую защитную эк метаплазии или неоплазии.

Несмотря на то, иммортализованных или опухолевых клеточных линий позволяют исследователей изучать реакцию эпителиальных клеток в этих стресса в пробирке, они остаются пролиферативной и не дифференцируются в зрелых эпителиальных клеток, найденных на самых верхних слоев слизистой оболочки пищевода. Кроме того, клеточные линии, которые уже подверглись туморогенез может обеспечить только ограниченную информацию о начальных ответов нормальных клеток в эпителии экологических факторов; и это этап, когда потенциал для терапевтического вмешательства может быть высокой. Наконец, обычные системы для культивирования клеток не в состоянии захватить потенциально важные взаимодействия между эпителиальных и мезенхимальных клеток и между этими клетками и окружающей матрицы, которые происходят в тканях в естественных условиях.

Животные модели обеспечивают более реалистичное микросреду для изучения реакции пищевода epitheliмкм и может включать искусственный индукцию желудочно-пищеводного рефлюкса ^2. Однако он может быть более сложным, чтобы манипулировать экологических стрессоров в этих моделях, и они не могут в полной мере представлять ответ в человеческом пищевода.

Другие экспериментальные модели человека пищевода были разработаны, которые используют первичные клетки, иммортализованных клеток или клеточных линий опухоли на коллаген, коллаген или в сочетании / Матригель, содержащие каркас фибробласты ^3,4. Это менее трудоемким, чтобы генерировать эти каркасы, чем бесклеточной пищевода помост, описанной в этой рукописи, и эти модели обеспечивают органотипической полезный инструмент, особенно при исследовании опухолевой инвазии ^5,6, где опухоль клеточной инфильтрации в гель коллагена может быть легко наблюдается. Однако эти гели коллагена неродного механические свойства и не имеют определенные функции исходной ткани, в том числе конкретного базальной мембраны и appropriatе топографии поверхности. Это может влиять на поведение клеток, в результате, например, хуже адгезии между эпителием и строительные леса при использовании гель каркас коллагена ^7. Как следствие был разработан бесклеточной свиного пищевода каркас, с тем преимуществом, что более реалистично биологически каркас и, таким образом, более подходящим для использования в качестве экспериментальной площадки. Кроме того, было показано, что лучше включать первичных клеток в пищеводе конструкций, чем иммортализованных пищевода эпителиальных клеточных линий, таких как Het-1A, так как эти клетки образуют многослойный эпителий, но не для стратификации или дифференциации ^4,7,8 ,

Следовательно, этот протокол был адаптирован из метода уже используются в лаборатории Макнил для принятия тканей инженерии кожи и слизистой оболочки полости рта ^9,10 и включает в себя свиной пищевода эшафот де-cellularized сочетании с первичных человеческих клетках эпителия пищевода и фибробластов. Тхис протоколом производит зрелый, стратифицированного эпителия, подобную нормальной человеческой пищевода, как продемонстрировано CK4, CK14, Ki67 и инволюкрина окрашивания. Полученная модель обеспечивает экспериментальную площадку для изучения ответов на экологический стресс, и был эффективно использован для исследования изменений в экспрессии генов в эпителии пищевода в ответ на рефлюксата компоненты ^11.

протокол

Пищевода клетки человека получают из пациентов желудка или пищевода хирургии. Информированное согласие получено для ткани, которые будут использоваться для исследовательских целей, и ткань используется анонимно под соответствующими этическими согласований (SSREC 165/03, человека Исследование тканей Банк Лицензия 12179).

1. Выделение человека пищевода эпителиальных клеток

1. Работа в ламинарного потока капот культуры ткани и с использованием стерильной техники, подготовить эпителиальных культуральную среду путем смешивания среды Игла в модификации Игла (DMEM) и F12 Хэма в соотношении 3: 1 (по объему). Добавить 10% (об / об) ФТС, 10 нг / мл эпидермального фактора роста, 0,4 мкг / мл гидрокортизона, 1,8 х 10 ^-4 М аденин, 5 мкг / мл инсулина, 5 мкг / мл трансферрина, 2 х 10 ^-7 М трийодтиронин, 1 х 10 ^-10 М холерного токсина, 2 × 10 ^-3 М глутамина, 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, и 0,625 мкг / мл амфотерицина В.
2. Использование стандартастерильные методы, поместить 11 мл DMEM, 10% FCS, 2 х 10 ^-3 М L-глутамина, 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,625 мкг / мл амфотерицина В в культуральную колбу Т75 ткани. Добавить 1 × 10 ⁶ летально облученных мышей 3T3 фибробластов ¹² в 1 мл той же среды и инкубируют в течение ночи при 37 ° С в 5% СО _2, увлажненной атмосфере. Это даст фидерного слоя для последующей культуры эпителиальных клеток.
3. Использование скальпеля и в соответствии с рекомендациями в histopathologist, рассекают приблизительно 2 см ² образца ткани из безрецидивной фоновой области пищевода плоскоклеточный слизистой, полученной от пациентов желудка или пищевода хирургии. Транспортировки в лабораторию в 50 мл стерильного контейнера транспортной среды (PBS 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,625 мкг / мл амфотерицина В) при комнатной температуре.
4. В этот момент, хранить ткани в транспортесредний до 12 часов (на ночь) при 4 ° С, для удобства; Однако не использовать более длинные периоды хранения, как они приводят к снижению жизнеспособности клеток.
5. Работа в ламинарного потока капот культуры ткани и с помощью метода стерилизации, стерилизовать лезвие скальпеля путем замачивания в 70% этаноле в течение 5 мин. Промыть в стерильной PBS.
6. Поместите ткань в стерильную чашку Петри и использовать скальпель, чтобы разрезать его на 0,5 см полоски. Добавляют 5 мл 0,1% (вес / объем) трипсина в PBS в чашке Петри, поместите крышку на блюдо и инкубировать в течение 1 часа при 37 ° С.
7. Добавляют 5 мл FCS в ткани в чашке Петри, чтобы ингибировать трипсин. Проведение полоску ткани с стерильным пинцетом, осторожно очистить поверхности эпителиальных с скальпелем в течение 1-2 мин на полосе, чтобы удалить эпителиальные клетки в окружающую среду. Удалить Царапины ткани и отложите в сторону. Повторите процедуру для всех тканей полос.
8. Собирают среды, содержащей отдельные эпителиальные клетки в 15 мл центрифужную пробиркуи центрифугируют (5 мин, 200 мкг). Слейте надосадочную и ресуспендируют осадок в 12 мл эпителиального среды (описано в шаге 1.1).
9. Вылейте и выбросьте среду от подачи слоя клеток в T75 колбу, полученного на стадии 1.2. Использование стерильной пипетки для добавления клеточной суспензии, содержащей свежеизолированных эпителиальные клетки в колбу и инкубируют при 37 ° С в 5% СО _2, увлажненной атмосфере.
10. Через 24 часа слейте и отбросить культуральную среду, что также будет содержать остатков клеток, и заменить 12 мл свежего эпителиальной среды. Продолжить инкубации при 37 ° С в 5% СО _2, увлажненной атмосфере. Колонии начнут появляться в течение следующего 24 до 48 часов и может быть просмотрен путем размещения культуральной колбы в стандартном оптическом микроскопе. Вылейте отработанное культуральной среды и заменить с равным объемом свежей среды каждые 2 до 3 дней.
11. После того, как колбу достигла 80% слияния, пассаж клеток ^13. Сплит Cлоктей в соотношении 1: 5 для увеличения количества клеток для использования в модели. Выполните шаг 1.2, чтобы установить фидерных слоев, облученных 3T3 клеток в каждой колбе, что будет получать эпителиальные клетки 24 ч до пересева клеток.
    Примечание: Используйте эпителиальные клетки в пищеводе модели, описанной ниже между проходами 1 и только 4.

2. Выделение человека Пищеводные фибробластов

1. Работа в шкафу с ламинарным потоком и использованием стерильной техники, взять ткань отмененного в шаге 1.7. Место в стерильную чашку Петри и фарш мелко путем измельчения со стерильным скальпелем. Добавить 10 мл 0,5% (вес / объем) коллагеназы решение и поместите крышку на чашке Петри и инкубировать при 37 ° С в течение ночи в 5% CO _2, увлажненной атмосфере.
2. Передача сводки 15 мл центрифужную пробирку и центрифугируют (10 мин, 200 мкг), тщательно слейте и отбросить супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл культуральной среды фибробластов (DMEM 10% FCS, 2 × 10 ^-3 М L-глутамина, 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, и 0,625 мкг / мл амфотерицина В).
3. Поместите суспензии в Т75 колбы и инкубируют при 37 ° С в 5% СО _2, увлажненной атмосфере. После 24 часов слить среду, которая будет содержать мусор и заменить 12 мл свежего фибробластов среды. Заменить культуральной среды через каждые 2 до 3 дней и прохождение клетки, когда они достигли 80% слияния ^13, расщепление клеток в соотношении 1: 5 для увеличения количества клеток.
   Примечание: Используйте фибробластов в модели, описанной ниже между проходами 4 и только 10.

3. Подготовка Де-cellularized пищевода строительные леса

1. Получить нетронутыми свиной esophagi на бойне от свежезабитых ландрас свиней, которые используются для производства пищевых продуктов. Один единственный пищевода обеспечит достаточные каркасов примерно на 30 отдельных конструкций.
   Примечание: Из-за обширного и времени соnsuming необходимости протокола стерилизации, это, как правило, стоит получения и обработки минимум 10 esophagi в одно время.
2. Сразу же место свеже вырезали в пищевод 180 мл стерильной горшок, содержащей приблизительно 150 мл 10% повидон-йода в течение 5 мин, чтобы уменьшить любое загрязняющих микробную нагрузку. Передача пищевод на второй горшок, содержащей приблизительно 100 мл стерильного PBS, содержащим 200 МЕ / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина и 1,25 мкг / мл амфотерицина B.
   1. Замените крышку контейнера и транспортировать esophagi назад в лабораторию при комнатной температуре. Два или три esophagi можно перевозить в каждом контейнере, в зависимости от их размера.
3. Однажды в лаборатории, обрабатывать ткань в ламинарном боксе в асептических условиях с использованием, чтобы минимизировать микробного загрязнения. Стерилизовать пинцет, ножницы и лезвий скальпеля путем замачивания в течение 5 мин в 70% -ном этаноле, и промывки в стерильной PBS.
4. Обращайтесь с ESophagus использованием стерильных пинцетов. Используя ножницы, разрезать пищевод в продольном направлении. Промойте ткань путем размещения пищевод в 180 мл стерильной банке, содержащей около 100 мл стерильной PBS и встряхивая осторожно, чтобы удалить любой мусор.
5. Очистите пробковую доску рассечение путем распыления либерально 70% этанола и дайте высохнуть.
6. Удалить пищевод от PBS и с использованием стерильных игл, по контактам пищевод на борту, слизистой поверхности вверх. Возьмитесь за поверхность слизистой оболочки на одном конце пищевода с стерильных пинцетов и отстраниться от доски. Это отделить слизистую оболочку от подслизистой основной.
   1. Затем, используя стерильный скальпель лезвием рассекать пищевод в продольном направлении вдоль собственной пластинки, удаление контактов, как рассечение прогрессирует, чтобы слизистая быть сняты прочь.
7. Сохраните расчлененный слизистую оболочку и выбросьте основной подслизистой.
8. Отрежьте и выбросите наиболее проксимальных и дистальных 2 см Тон слизистой оболочке есть большее количество подслизистых желез и толще собственной пластинки в этих областях, соответственно ^7.
9. Используйте скальпель, чтобы вырезать оставшиеся ткани в 5 см ^2. Поместите все вырезать ткань в 180 мл стерильной банке, содержащей приблизительно 150 мл стерильного PBS и агитировать мягко промойте ткань. Если обработка более чем в пять esophagi в одно время может быть необходимо использовать несколько горшков для этого и трех последующих шагов.
10. Используя стерильные пинцет, передача разреза ткани в 180 мл горшок, содержащий 150 мл стерильного 1 М NaCl, 200 МЕ / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина и 1,25 мкг / мл амфотерицина B. инкубируют в течение 72 ч при 37 ° С.
11. Поместите ткань в свежем 180 мл горшок, содержащий 150 мл стерильного PBS. Эпителий будет начали заметно отделены от основной ткани. Аккуратно отделите снятие эпителий от свиного пищевода с помощью стерильного пинцета и отбросить.
    1. Поместите оставшиеся тВопрос в свежем 180 мл горшок и добавить 150 мл стерильного PBS. Перемешайте осторожно в течение 5 мин, чтобы вымыть. Вылейте PBS и повторить еще два раза со свежим PBS.
12. Поместите все ткани в стеклянный флакон 500 мл, содержащую 400 мл стерильной 80% (об / об) растворе глицерина в течение 24 ч при комнатной температуре. Переход к 400 мл стерильной 90% (об / об) растворе глицерина в течение 24 ч.
13. Хранить в 400 мл стерильной 100% раствора глицерина при комнатной температуре в течение не менее 4 месяцев для обезвоживания и стерилизации ткани при сохранении целостности базальной мембраны.

4. Производство медиакультуры

1. Подготовьте хелатного сыворотки новорожденного теленка для использования в культуральной среде.
   1. Залить 100 г Chelex 100 в стеклянной бутылке 1 л и добавить де-ионизированной воды. Точный объем не является критическим, но достаточное количество воды должно быть добавлено, чтобы покрыть порошок Chelex. Добавить магнитную мешалку и стерилизовать автоклавированием (121 ° С в течение15 мин).
   2. Разрешить бутылки, чтобы охладить и Chelex урегулировать. В кабинете потока ламинарного слить лишнюю воду, добавляют 500 мл сыворотки новорожденного теленка (NCS) и оставить в течение ночи при 4 ° С.
   3. Остановить перемешивание и позволяют Chelex урегулировать, это может занять до 30 мин. В кабинете ламинарного потока переливать хелатированное сыворотки с помощью стерильной пипетки, заботясь, чтобы не нарушить Chelex и магазин в 10 мл аликвоты при -20 ° С.
2. Подготовьте три разных средств массовой информации в шкафу с ламинарным потоком, начиная с про-пролиферации и заканчивая про-differentiative составов.
   1. Подготовьте композитной среды я состоит из DMEM и F12 Хэма в соотношении 3: 1 (по объему), 4 × 10 ^-3 М L-глутамина, 0,5 мкг / мл гидрокортизона, 1 х 10 ^-4 М О -phosphorylethanolamine, 2 х 10 ^-12 М трийодтиронина, 1,8 х 10 ^-4 М аденина, 1,88 × 10 ^-3 М CaCl _2, 4 х 10 ^-12 М прогестерон, 10 мкг / мл вSulin, 10 мкг / мл трансферрина, 10 нг / мл селена, 1 × 10 ^-3 М этаноламина и 0,1% (об / об) хелатные NCS.
   2. Подготовка композитной среды II в композитной среды I, за исключением замены хелатированное сыворотки с 0,1% (об / об), не хелатного NCS.
   3. Подготовка композитной среды III в качестве композитной среды II, за исключением опустить прогестерона и увеличение сыворотки до 2% (об / об), не хелатного NCS.

5. Производство по человеческому слизистой оболочки пищевода модели

1. Выполните все работы в капюшоне ламинарного потока, используя асептической техники для поддержания стерильности. Стерилизовать все инструменты путем замачивания в 70% этаноле в течение 5 мин, до промывки в стерильной PBS.
2. Накануне он требуется, увлажняет ацеллюлярную свиной пищевода эшафот. Одна часть эшафот требуется для каждой конструкции, чтобы быть готовым.
   1. Для увлажняет ткань место достаточно куски свиного эшафот в кастрюлю, содержащую 100 мл стерильного PBS, агитировать и выдержите в течение 10 мин. Декант в PBS и заменить свежим PBS. Повторите процесс стирки пять раз, чтобы убедиться удаление всех следов глицерина.
3. Испытание строительных лесов стерильность путем инкубации разведенной ткани в течение ночи в 100 мл DMEM при 37 ° С. Если нет никаких изменений в цвете или мутности культуральной среде по окончании инкубационного периода предполагается каркас быть стерильными. После того, как бесплодие было подтверждено, поместите 5 см ² ацеллюлярную эшафот в 6-луночного планшета в, подслизистого сторону вверх.
4. Поместите стерильную медицинскую класса кольцо из нержавеющей стали (внутренний диаметр 10 мм, внешний диаметр 20 мм) на центре каждой эшафот и осторожно надавите с помощью стерильного пинцета, чтобы обеспечить адекватную печать с ткани.
5. Урожай фибробласты с помощью трипсин-EDTA ¹³ для получения суспензии клеток. Граф клеток с использованием гемоцитометра ^14. Центрифуга клеточной суспензии (10 мин, 200 XG). Ресуспендируют осадок клеток в appropriaте объемы фибробластов среды для получения конечного количества клеток 2,5 × 10 ⁶ клеток на мл.
6. Добавить 0,2 мл фибробластов среды, содержащие 5 х 10 ⁵ пищевода фибробласты человека, в каждом кольце. Наводнение область вокруг внешней стороны кольца приблизительно 2 мл фибробластов среды. Выдержите при 37 ° С в 5% СО _2, увлажненной атмосфере.
7. После 24 часов удалить кольца и фибробластов среды и добавить по крайней мере 5 мл свежей среды фибробластов в каждую лунку, убедившись, что каркас полностью погружен в среду. Культура в течение 1 недели, при 37 ° С в 5% СО _2, влажной атмосфере замены среды каждые 2 до 3 дней.
8. После 1 недели удалить также пластин 6, содержащие каркасов для ламинарного наводнений капотом, снимите среду и инвертировать каждый эшафот с помощью стерильного пинцета, помещая поверхность слизистой оболочки вверх. На этот раз точка упоминается как день 0.
9. Поместите стальные кольца на поверхности слизистой оболочки в центреткани, как на шаге 5.4.
10. Подготовка T75 колб эпителиальных клеток для трипсинизации ^13. После PBS мыть и перед добавлением трипсина-ЭДТА, добавляют 2 мл стерильного 0,02% (вес / объем) раствора ЭДТА в каждую колбу. Инкубируют в течение 2 мин при 37 ° С. Нажмите колбу осторожно, чтобы избирательно отделить подачи слой i3T3 оставляя эпителиальные клетки прилагается.
    Примечание: Как правило, не практично или необходимо пациенту соответствовать эпителиальные клетки фибробластов уже включены в модели предыдущей неделе.
11. Вылейте раствор, содержащий EDTA фидерного слоя и добавить трипсин-ЭДТА решение для сбора эпителиальные клетки ^13. Граф клеток с использованием гемоцитометра ^14. Центрифуга клеточной суспензии (10 мин, 200 XG). Ресуспендируют осадок клеток в соответствующий объем композитной среды 1 до получения конечного количества клеток 5 × 10 ⁶ клеток на мл.
12. Добавить 0,2 мл композитной среды I, содержащий 1 х 10 ⁶ эпителиальные клетки, в кольце. Flood область вокруг внешней стороны кольца с примерно 2 мл композитной среды I и поместить конструкции в инкубаторе при 37 ° С в 5% СО _2, увлажненной атмосфере.
13. Через 24 ч (день 1) удалить кольца и среду и добавить по крайней мере, 5 мл свежего композитной среды I, обеспечивая каркасы полностью погружен и вернуться в инкубатор. После еще 24 ч (день 2) удалить носитель и заменены по крайней мере, 5 мл композитной среды II, снова обеспечения каркасы полностью погружен и вернуться в инкубатор.
14. В день 4 место стерильной медицинской нержавеющей стали сетки сетки (2 см в ширину 2 см высокие длинные х 0,5 см), в свежих 6 чашек, один за конструкции. Используйте стерильные пинцеты для передачи конструкции на верхней части стальной арматурой, слизистой поверхности вверх.
    1. Добавить достаточное композитной среды III, так что жидкость достигает нижней композита, но поверхностьна воздухе, это гарантирует, что образец выдерживают при воздушной и жидкой фаз. Точный объем среды, необходимой будет варьироваться в зависимости от толщины каркасом, объем скважины и точной высоты сетки из нержавеющей стали.
15. Поддержание композитов на воздухе и жидкой фаз в течение от 10 до 20 дней (день 14 до дня 24), в зависимости от требований эксперимента. Замените композитной среды III свежей средой каждые 2 до 3 дней (понедельник, среда, пятница удобно режим).
    Примечание: После 5 дней в интерфейсе воздух-жидкость (День 9) конструкты имеют достаточно зрелый эпителий пищевода, который будет использоваться в экспериментах с воздействием экологических факторов на эпителия пищевода.
16. В конце эксперимента, зафиксировать конструкции для гистологического анализа и иммуногистохимического окрашивания ^7, или экстракта белка или РНК ^{15 11,16} из эпителия для дальнейших Analysесть. При необходимости, сохранить кондиционированной культуральной среды для анализа внеклеточных сигнальных молекул ^17.

Результаты

Эта рукопись описывает процесс, необходимый, как показано на схематическом виде на рисунке 1, чтобы культура 3D моделей эпителия пищевода человека успешно. Для подтверждения пригодности модели, как экспериментальная платформа гистологическое и иммуногистохимическое исследо?...

Обсуждение

Эта рукопись описывает производство и характеристика биологически соответствующего модели человеческого пищевода слизистой подходящей для использования в качестве экспериментальной площадки для изучения последствий воздействия экологического стресса на эпителия пищевода.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsin	BD Biosciences	215240	Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use.
DMEM	Labtech	LM-D1112	Warm in 37 °C water bath before use
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37 °C water bath before use
Foetal Calf Serum	Labtech	FB-1090
Epidermal Growth Factor	R+D Systems	236-EG-200	Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone	Sigma-Aldrich	H0396	Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Insulin	Sigma-Aldrich	I2767	Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use
Transferrin	Sigma-Aldrich	T2036	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	Prepare stock solution in water
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Brand name Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize
Collagenase A	Roche	10103578001
Povidone-iodine solution	Ecolab	10830E	Brand name Videne
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Newborn calf serum	Gibco	26010074
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use
O-phosphorylethanolamine	Sigma-Aldrich	P0503	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
ITS (insulin, transferrin, selenium)	Lonza	17-838Z	Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
EDTA 0.02% solution	Sigma-Aldrich	E8008	Warm in 37 °C water bath before use
T75 culture flask	VWR	734-2313
50 ml centrifuge tube	Fisher	11819650
15 ml universal tube	SLS	SLS7504
180 ml pot	VWR	216-2603
Petri dish	SLS	150350
6 well plate	VWR	734-2323
stainless steel rings			Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids			Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clone MM1. Use at 1:100.
CK4	Abcam	ab9004	Clone 6B10. Use at 1:200.
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clone LL002. Use at 1:200.
Involucrin	Novocastra	INV	Clone SY5. Use at 1:100.
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts	ATCC-LGC	CRL-1658	previously growth arrested by irradiation (60 Gy)