3 차원 조직 공학 인간의 식도 점막 모델의 제조, 특성 및 사용 가능성

요약

이 원고는 생산, 특성화 및 일반 차 인간의 식도 섬유 아세포와 드 cellularized 돼지 비계 내에서 시드 편평 상피 세포로부터 제조 된 조직 설계 3D 식도 구조의 사용 가능성에 대해 설명합니다. 결과 정상적인 인간 식도 유사한 성숙한 상피 성층의 형성을 입증한다.

초록

식도 선암과 그 전구체, 바렛 화생 모두의 발생 빈도는 서구 세계에 급속하게 증가하고있다. 또한 식도 선암은 일반적으로 최근 몇 년 동안 생존율에 약간의 개선 불량한 예후를 가진다. 이러한 연구하기 어려운 조건이며, 식도 점막의 질환을 연구에 적합한 실험 플랫폼의 부족이었다.

인간 식도 점막의 모델은 종래의 2 차원 세포 배양 시스템과 달리, 생체 내에 존재하는 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용을 정확하게 되풀이하고 정상인과 동일한 성숙 성층 상피를 생산 맥닐 실험실에서 개발 된 식도. 간략하게, 모델은 돼지 유래의 무 세포 골격 식도 내에 성장 비 형질 전환 인간 식도 차 정상 섬유 아세포 및 상피 세포를 이용한다. 이 모델의 면역 조직 화학적 특성CK4, CK14, 사료된다 의해 involucrin 염색은 정상적인 인간의 식도 점막의 조직 학적 적절한 재현부을 보여줍니다.

이 모델은 인간의 식도 점막의 강력한 생물학적 관련 실험 모델을 제공합니다. 그것은 쉽게되는 약물의 유효성과 같은 알코올, 독소, 고온 또는 위식 refluxate 성분으로서 환경 인자에 대한 노출의 영향을 포함한 연구 문제의 수를 조사하기 위해 조작 될 수있다. 모델도 가능 기존의 2 차원 세포 배양, 특히와 달성하지 확장 문화 기간을 촉진, 최대 20 일 동안 관심의 에이전트에 성숙한 상피의 반복 노출의 영향에 대한 연구. 또한, 이러한 식도 종양인지 바렛 화생로부터 유도 된 것과 같은 세포주의 다양한, 종양 침윤 및 약물 responsivene 같은 과정을 조사하기 위해 모델에 통합 될 수있다더 생물학적으로 관련 환경에서 SS.

서문

식도 점막은 결합 조직, 점막 고유 층 위의 층상 편평 상피 세포를 포함하고, 섭취 한 환경 스트레스가 발생하는 최초의 사이트 중 하나입니다. duodenogastro - 식도 역류 식도 선암종으로 진행 위험의 증가와 연관되어 바레트 화생의 발병 기전에 중요한 요소 인 반면,식이 성 독소 노출이 식도 편평 세포 암종의 발달에 관여한다. 식도 암은 영국 남성과 식도 선암에서 8 ^번째 가장 일반적인 악성 종양이 빠르게 서방 세계 ¹ 증가하고 있습니다. 또한, 약 15 %의 5 년 생존율과 질환 예후 작은 개선이 있었다. 결과적으로이 develo의 식도 상피의 환경 스트레스에 대한 노출의 영향과 잠재적 관련을 조사하는 실험 플랫폼에 대한 필요성이 존재상피화 생 또는 신 생물의 pment.

불멸화 또는 종양 세포주가 시험 관내 연구는 이러한 스트레스에 대한 상피 세포의 반응을 연구 할 수 있지만, 이들은 증식 남아 식도 점막의 최상층에있는 성숙한 상피 세포로 분화하는 데 실패한다. 또한, 이미 종양을받은 세포 라인은 환경 요인 상피 내에 정상 세포의 초기 반응에 관한 제한된 정보를 제공 할 수있다; 이는 치료 적 개입 가능성이 가장 높을 수도 단계이다. 마지막으로, 통상의 세포 배양 시스템은 상피 및 간엽 세포와 생체 내에서의 조직 내에서 발생하는 이들 세포와 주변 매트릭스 사이의 중요한 상호 작용을 잠재적으로 캡처하지 못한다.

동물 모델은 식도 epitheli의 반응을 연구보다 현실적인 미세 환경을 제공 할UM 및 위식도 역류 질환 ^(2)의 인공 유도를 포함 할 수있다. 그러나이 모델에서 환경 스트레스를 조작하는 것이 더 어려울 수 있습니다 그들은 완전히 인간의 식도 내에서 응답을 대표하지 않을 수 있습니다.

다른 실험 인간 식도 모델은 콜라겐에 일차 세포, 불멸화 세포 또는 종양 세포주를 이용하는이 개발, 또는 콜라겐 / 마트 리겔, 골격 함유 섬유 아세포 ^3,4- 결합되었다. 그것은이 원고에 기재된 무 세포 식도 지지체보다 이들 골격을 생성 덜 노동 집약적이며, 이들의 Organotypic 모델은 특히 콜라겐 겔에 종양 세포 침투를 용이하게 할 수있다 종양 침윤 ^5,6의 연구에 유용한 도구를 제공한다 관찰했다. 그러나 이러한 콜라겐 겔 비원 기계적 특성을 가지고 특정 기저막 및 appropriat 포함한 원래 조직의 특정 기능을 결여전자 표면 지형. 콜라겐 겔 지지체 ^(7)를 사용할 때, 예를 들면, 상피와 지지체 간의 열악한 부착을 초래 셀들의 동작에 영향을 미칠 수있다. 결과적으로 무 세포 돼지 식도 비계 더 생물학적으로 실제와 비계 실험 플랫폼으로서 사용하기에 따라서 더 적절하다는 장점과 함께 개발되었다. 그것은 또한 이들 세포는 다층 상피를 형성하기 때문에, 이러한 헷-1A와 같은 불멸화 식도 상피 세포주보다 식도 제물로 일차 전지를 포함하지만, 계층화 또는 ^{4,7,8 차별화} 실패 좋다고 보여왔다 .

따라서,이 프로토콜은 이미 조직 설계 피부와 구강 점막 ^9,10를 만들기위한 맥닐 실험실에서 사용하는 방법에서 적응 및 기본 인간의 식도 상피 세포와 섬유 아세포와 함께 드 cellularized 돼지 식도 발판을 통합하고있다. 티CK4, CK14, 사료된다 의해 염색 involucrin 있듯이 S 프로토콜은 정상적인 인간 식도 유사한 성숙 성층 상피 세포를 생성한다. 결과 모델은 환경 스트레스에 대한 반응을 연구하는 실험 플랫폼을 제공하고, 구성 요소 ^(11)에 응답 refluxate 식도 상피 세포에서의 유전자 발현의 변화를 조사하기 위해 효과적으로 사용되어왔다.

프로토콜

인간의 식도 세포는 위 또는 식도 수술을받은 환자에서 얻을 수 있습니다. 조직은 연구 목적을 위해 사용될 수 있도록 동의 수득하고, 조직은 적절한 윤리적 승인 (SSREC 165/03, 인간 연구 조직 은행 라이선스 12,179)하에 익명 사용.

인간의 식도 상피 세포의 분리 (1)

1. : 1 비율 층류 조직 문화 후드에서 작업 및 무균 기술을 사용하여, 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM)과 3 햄의 F12 혼합하여 상피 세포 배양 배지를 준비 (절 : V). 10 % 추가 (v / v)의 FCS, 10 ng / ml의 상피 세포 성장 인자, 0.4 μg의 / ㎖ 하이드로 코르티손, 1.8 × ^10-4 M 아데닌, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 5 μg의 / ㎖ 트랜스페린, 2 × ^10-7 M 트리 요오 도티 로닌, 1 × 10 ^-10 M 콜레라 독소, 2 × 10 ^-3 M 글루타민, 100 IU / ml의 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 및 0.625 μg의 / ㎖ 암포 테리 신 B를
2. 표준을 사용하여무균 기법, T75 조직 배양 플라스크에 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 DMEM 11 ㎖, 10 % FCS, 2 × ^10-3 M L- 글루타민, 100 IU / ml의 페니실린, 및 0.625 μg의 / ml의 암포 테리 신 B 넣어. 동일한 배지 1 ㎖를 1 × ¹⁰⁶ 치사량 조사 마우스 3T3 섬유 아세포 ^(12)를 추가하고, 5 % CO _2의 가습 분위기에서 37 ℃에서 밤새 배양한다. 이 상피 세포의 후속 문화에 대한 피더 레이어를 생성합니다.
3. 메스를 사용하고 histopathologist의 권고에 따라, 위 또는 식도 수술을받은 환자에서 얻은 식도 편평 상피 점막의 무병 배경 영역에서 조직의 약 2cm ² 샘플을 해부하다. 멸균 전송 매체의 50 mL의 용기에 실험실에 전송 (PBS 100 IU / ml의 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 0.625 μg의 / ml의 암포 테리 신 B)을 실온에서.
4. 이 시점에서, 전송에서 티슈를 저장할4 ° C에서 (밤새) 최대 12 시간 동안 매체의 편의를 위해; 그들은 감소 세포 생존을 초래할 그러나 더 이상 저장 기간을 사용하지 마십시오.
5. 층류 조직 배양 후드에서 작업 무균 기술을 사용하여, 5 분 동안 70 % 에탄올에 담가 메스 블레이드 살균. 멸균 PBS로 씻어.
6. 멸균 페트리 접시에 조직을두고 0.5 cm의 스트립으로 잘라 메스를 사용합니다. 0.1 %의 5 ML을 추가 페트리 접시에 PBS에 트립신 (/ V W), 접시에 뚜껑을 배치하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
7. 트립신을 억제하는 페트리 접시에 조직에 FCS 5 mL를 추가합니다. 스트립 당 1 ~ 2 분 주변 매질로 상피 세포를 제거하는 살균 집게로 조직의 스트립을 잡고 조심스럽게 메스 블레이드와 상피 표면을 긁어. 스크랩 한 조직을 제거하고 따로 설정합니다. 모든 조직 스트립의 과정을 반복합니다.
8. 15 mL의 원심 분리 튜브에 상피 세포를 포함하는 배지를 수집원심 분리 (5 분, 200 XG). 상층 액을 붓고 상피 매체의 12 ml의에서 펠렛을 재현 탁 (단계 1.1에서 설명).
9. 붓고 단계 1.2에서 제조 한 T75 플라스크에 피더 세포층에서 매체를 폐기. 5 % CO _2의 가습 분위기에서 37 ℃에서 플라스크에 갓 절연 상피 세포를 포함하는 세포 현탁액을 추가 배양 멸균 피펫을 사용한다.
10. 24 시간 후 부어도 세포 파편을 포함 배지를 버리고, 신선한 상피 매체의 12 ㎖로 대체합니다. 5 % CO _2의 가습 분위기에서 37 ℃에서 배양을 계속. 식민지는 다음 24-48 시간에 걸쳐 나타날 시작하고 표준 광 현미경 문화 플라스크를 배치하여 볼 수 있습니다. 폐 배지를 붓고 신선한 매체의 동일한 볼륨 모든 2~3일로 교체.
11. 플라스크를 80 % 컨 플루, 통로 ^(13)를 세포에 도달하면. C 분할(1)의 비율의 ELL : 5 모델에서 사용하기 위해 세포 수를 증가한다. 세포를 계대에 24 시간 이전에 상피 세포를 수신 할 각 플라스크에 조사 3T3 세포의 피더 층을 설정하는 단계 1.2를 따릅니다.
    참고 : 통로 1 만 4 사이에 아래에 설명 된 식도 모델에서 상피 세포를 사용합니다.

인간의 식도 섬유 아세포 2. 분리

1. 층류 캐비닛 작업과 멸균 기술을 이용하여, 단계 1.7에 따로 조직을 가지고. 멸균 페트리 접시에 넣고 멸균 메스 블레이드 도마에 의해 미세하게 말하다. (V / W) 솔루션을 콜라와 페트리 접시에 뚜껑을 배치하고 5 % CO _2, 가습 분위기에서 하룻밤 37 ℃에서 부화 0.5 %의 10 ML을 추가합니다.
2. 조심스럽게, 15 mL의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 (10 분, 200 XG)에 다이제스트를 전송 부어 상층 액을 버리고 섬유 아세포 배양 배지 (DMEM 10 % FCS 10ml에 펠렛을 재현 탁, 2 × ^10-3 M의 L 글루타민 / ㎖ 페니실린 100 IU, 100 μg의 / ml의 스트렙토 마이신, 및 0.625 μg의 / ml의 암포 테리 신 B).
3. T75 플라스크에 현탁액을 놓고 5 % CO _2, 가습 분위기에서 37 ° C에서 품어. 24 시간 후 파편을 포함하고 신선한 섬유 아세포 매체의 12 ㎖로 대체 할 매체를 부어. 세포 수를 증가시키기 위해 5 비율 : 그들은 하나의 셀을 분할, 80 % 컨 플루 ^{(13)에 도달} 한 후 배양 배지마다 2~3일 및 통로 세포를 교체합니다.
   주 : 통로 4와 10 사이 후술 모델에서 섬유 아세포를 사용한다.

드 - cellularized 식도 비계 3. 준비

1. 식량 생산에 사용되는 갓 도살 랜드 레이스 돼지에서 도살장에서 그대로 돼지의 esophagi를 얻습니다. 하나의 단일 식도는 약 30 별도의 구조에 대한 충분한 발판을 제공 할 것입니다.
   참고 : 인해 광범위하고 시간이 공동으로멸균 프로토콜이 필요 nsuming, 그것을 획득하고 한번에 10 esophagi의 최소 처리 통상 가치가있다.
2. 즉시 임의의 미생물 오염 부하를 줄이기 위해 5 분 동안 10 % 포비돈 - 요오드 용액을 약 150 ㎖을 함유하는 180 ㎖의 멸균 냄비에 갓 절제 식도를 배치했다. / ㎖ 스트렙토 마이신 200 IU / ml의 페니실린, 200 μg의 및 1.25 μg의 / ml의 암포 테리 신 B를 포함하는 멸균 PBS 약 100 ㎖를 함유하는 제 냄비 식도 전송
   1. 용기에 뚜껑을 교체하고, 실온에서 다시 실험실로 esophagi을 운반 할 것. 두 개 또는 세 개의 esophagi는 자신의 크기에 따라, 각각의 용기에 이송 할 수있다.
3. 실험실 한번에, 미생물 오염을 최소화하기 위해 무균 기술을 사용하여 층류 후드에서 조직을 처리한다. 70 % 에탄올에 5 분간 침지하고, 멸균 PBS에 세척하여 핀셋, 가위와 메스 블레이드를 소독.
4. ES를 처리ophagus 멸균 핀셋을 사용하여. 가위를 사용하여, 길이 방향으로 식도를 오픈. 멸균 PBS 약 100 ㎖을 함유하는 180 ㎖의 멸균 냄비에 식도를 배치하고 이물질을 제거하기 위해 부드럽게 흔들어 조직을 헹군다.
5. 자유주의와 70 % 에탄올을 분사하여 코르크 해부 보드를 깨끗하고 건조하게 할 수 있습니다.
6. 보드, 점막 표면의 최상부에 식도를 핀, PBS에서 식도를 제거하고 멸균 된 바늘을 사용. 멸균 핀셋 식도의 한쪽 끝에서 점막 표면을 잡고 멀리 보드에서 빼냅니다. 이 기본 점막하에서 점막을 분리합니다.
   1. 그리고,이 점막 해부 떨어져 상승 될 수 있도록 진행에 따라 핀을 제거하는, 점막 고유 따라 길이 방향 식도 해부 멸균 메스 블레이드를 사용한다.
7. 해부 점막을 유지하고 기본 점막하을 폐기합니다.
8. 잘라 및 T의 가장 근위부와 원위부 2cm를 폐기각각 ⁷ 그 지역에서 점막하 동맥의 큰 번호와 두꺼운 점막 고유 층이있는 한 그는 점막.
9. 5cm ^(2)에 남아있는 조직을 잘라 메스를 사용합니다. 멸균 PBS의 약 150 ㎖를 포함하는 180 ml의 멸균 냄비에 모든 컷 조직을두고 조직을 씻어 부드럽게 교반. 한 번에 둘 이상의 다섯 esophagi 처리하면이 여러 냄비와 세 후속 단계를 사용하는 것이 필요할 수있다.
10. 무균 핀셋을 사용하여, 37 ° C에서 72 시간 동안 150 멸균 1 M의 NaCl ㎖, 200 IU / ml의 페니실린, 200 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 1.25 μg의 / ml의 암포 테리 B. 인큐베이션을 함유하는 180 mL의 냄비로 절단 조직을 전송.
11. 150 ml의 멸균 PBS를 포함하는 신선한 180 ml의 냄비에 조직을 놓습니다. 상피는 눈에 띄게 기본 조직에서 분리하기 시작합니다. 조심스럽게 돼지 식도에서 분리 상피 멸균 집게를 사용하고 폐기 껍질.
    1. 나머지 T를 배치신선한 180 ML의 냄비에 문제 및 멸균 PBS 150 ㎖를 추가합니다. 5 분 세척을 위해 부드럽게 저어. PBS를 붓고 신선한 PBS로 추가 두 번 반복합니다.
12. 실온에서 24 시간 동안 살균 한 80 %의 400 ㎖ (v / v)의 글리세린을 함유하는 용액 500 ml의 유리 병에 모든 조직을 놓는다. 추가 24 시간 동안 멸균 90 % (V / V) 글리세롤 용액 400ml를 갈아.
13. 탈수 및 기저막의 무결성을 유지하면서 조직을 멸균 4 개월 이상 상온에서 살균을 100 % 글리세롤 용액 400 ㎖에 보관.

문화 미디어 4. 생산

1. 배양 배지에 사용하기 위해 킬레이트 신생아 송아지 혈청을 준비한다.
   1. 유리 1 리터 병에 Chelex (100) 100g을 붓고 탈 이온수를 추가합니다. 정확한 부피는 중요하지 않지만 충분한 물 Chelex 분말을 덮도록 첨가되어야한다. 자석 교반기를 추가하고 고압 증기 멸균 (121 ° C의에 의해 소독15 분).
   2. 병을 식히와 Chelex가 정착. 층류 캐비닛, 여분의 물을 부어 신생아 혈청 (NCS)의 500 mL로 추가하고 4 ℃에서 밤새 교반 둡니다.
   3. 교반 중지하고 Chelex이 30 분까지 걸릴 수 있습니다, 정착 할 수 있습니다. 층류 캐비닛에 -20 ℃에서 10 ㎖ 분량 씩 Chelex 및 저장을 방해하지 않도록주의하면서, 멸균 피펫을 사용하여 킬레이트 혈청 캔트.
2. 프로 증식으로 시작하여 프로 differentiative 제제로 끝나는, 층류 캐비닛에 세 가지 다른 미디어를 준비합니다.
   1. 1 비율 (V : V), 4 × ^10-3 M의 L- 글루타민, 0.5 μg의 / ㎖ 하이드로 코르티손, 1 × 10 ^-4 M O를 -phosphorylethanolamine, 2 × 복합 미디어를 준비 나는 3 DMEM과 햄 F12 구성 10 ^-12 M의 트리 요오 도티 로닌, 1.8 × 10 ^-4 M 아데닌, 1.88 × 10 ^-3 M 염화칼슘 _2, 4 × 10 ^-12 M 프로게스테론, 10 ㎍ / ㎖의에sulin, 10 μg의 / ㎖ 트랜스페린, 10 NG / ㎖ 셀레늄, 1 × 10 ^-3 M 에탄올 아민과 0.1 % (v / v)의 킬레이트 NCS.
   2. 0.1 % (v / v)의 비 킬레이트 NCS와 킬레이트 혈청 교체를 제외하고 복합 매체 나 같은 복합 중간 II를 준비합니다.
   3. 2 % (v / v)의 비 킬레이트 NCS에 생략 프로게스테론과 증가 혈청을 제외하고 복합 중간 II와 같은 복합 매체 III를 준비합니다.

인간의 식도 점막 모델 5. 생산

1. 멸균 환경을 유지하기 위해 무균 기술을 사용하여, 층류 후드에서 모든 작업을 수행한다. 멸균 PBS로 세척하기 전에 5 분 동안 70 % 에탄올에 담가 모든 도구를 소독.
2. 이 요구되기 전에 날, 무 세포 돼지 식도 발판을 재수. 각각의 구조가 준비하는 발판의 한 조각이 필요합니다.
   1. 멸균 PBS 100 ㎖을 함유하는 냄비에 돼지 지지체의 조직 장소 충분한 개 재수, 교반하고 10 분 동안 담가. 데카PBS를 NT 및 신선한 PBS로 교체합니다. 모든 글리세롤 흔적의 제거를 보장하기 위해 세척 과정을 다섯 번 반복한다.
3. 37 ℃에서 하룻밤 DMEM 100 mL에 재수 조직을 배양하여 발판 불임을 테스트합니다. 지지체는 멸균 것으로 가정 배양 종료 시점 배지 색깔 또는 탁도에 아무런 변화가 없다면. 불임이 확인되면, 맨, 6 웰 플레이트에 점막하 측 5cm ² 무 세포 지지체를 배치합니다.
4. 각 발판의 중심에 멸균 의료용 스테인레스 스틸 링 (내경 10mm, 외경 20mm)를 놓고 부드럽게 조직과 적절한 밀봉을 보장하기 위해, 멸균 집게를 사용 누르십시오.
5. 세포 현탁액을 제조 트립신 ^EDTA-13을 사용하여 섬유 아세포 수확. 혈구 ^(14)를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포 현탁액 (10 분, 200 XG)를 원심 분리기. appropria으로 세포 펠렛을 재현 탁섬유 아세포 배지의 부피는 TE 용액 당 2.5 × ¹⁰⁶ 세포의 최종 세포 수를 생성한다.
6. 각각의 링에서, 5 × 10 ⁵ 인간의 식도 섬유 아 세포를 포함하는 섬유 아세포 매체의 0.2 ml에 추가합니다. 섬유 아세포 배지의 약 2 ㎖로 링의 외부 주위 영역 홍수. 5 % CO _2의 가습 분위기에서 37 ℃에서 인큐베이션.
7. 24 시간 후 고리와 섬유 아세포 배지를 제거하고 지지체 완전히 매질에 침지 보장 각 웰에 신선한 아세포 매체의 적어도 5 mL를 추가한다. 5 % CO _2에서 37 ℃에서 1 주간 배양, 매체마다 2~3일 교체 가습 분위기.
8. 일주 후 맨 점막 표면을 배치, 층류 홍수 후드에 비계를 포함하는 6 웰 플레이트를 제거 매체를 제거하고 살균 집게를 사용하여 각 발판을 반전. 이 시점은 0 일째로 지칭된다.
9. 중앙의 점막 표면에 스틸 링을 배치단계 5.4에서와 같이 조직.
10. 트립신 ¹³ 상피 세포의 T75 플라스크를 준비합니다. PBS 세척 전에 트립신 EDTA 용액을 첨가 한 후, 각각의 플라스크에 멸균 0.02 %의 2 ㎖ (w / v)의 EDTA 용액을 추가한다. 37 ℃에서 2 분 동안 품어. 첨부 된 상피 세포를 유지하면서 선택적으로 i3T3 세포층을 분리 부드럽게 플라스크를 누릅니다.
    참고 : 일반적으로 이미 지난 주 모델에 통합 된 섬유 아세포에 상피 세포와 일치하는 환자에게 실제적인 또는 필요가 없습니다.
11. 세포층을 함유 EDTA 용액을 붓고 ¹³ 상피 세포 ^수확 트립신 EDTA 용액을 추가한다. 혈구 ^(14)를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포 현탁액 (10 분, 200 XG)를 원심 분리기. 용액 당 5 × ¹⁰⁶ 세포의 최종 세포 수를 생산하는 복합 매체 (1)의 적절한 양으로 세포 펠렛을 재현 탁.
12. 포함하는 복합 중간 나는 0.2 ML을 추가 1 × 1링 내에서 0 ~ ⁶ 상피 세포. 복합 중간 나는 약 2 mL를 링의 외부 주변 지역 홍수와 5 % CO _2, 가습 분위기에서 37 ° C에서 인큐베이터에 구조를 놓습니다.
13. 24 시간 (1 일) 후 링과 매체를 제거하고 신선한 복합 중간 나는 적어도 5 mL를 추가, 비계가 완전히 침수되는 보장하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 또 24 시간 (2 일) 후 매체를 제거하고 다시 비계가 완전히 침수 및 인큐베이터로 돌아된다 보장, 복합 매체 II의 적어도 5 ㎖로 대체했다.
14. 날 4 곳 멸균 의료용 스테인레스 스틸 메쉬 그리드 신선한 6 웰 플레이트에 (2cm 길이 X 0.5 cm 높이 x 세로 2cm), 구조 당 하나. 강철 격자, 점막 표면 맨의 상단에 구조를 전송하는 멸균 핀셋을 사용합니다.
    1. 복합 액체의 아래쪽에 도달하지만, 표면이되도록 충분한 중간 복합 III 추가공기에 노출, 이것은 샘플이 공기 - 액체 계면에서 유지되는 것을 보장한다. 지지체, 웰의 부피 및 스테인레스 그리드의 정확한 높이의 두께에 따라 달라질 필요 매체의 정확한 볼륨.
15. 실험의 조건에 따라, 10 및 20 일 사이에 (주 24 주 14)에 대한 공기 - 액체 계면에서 합성을 유지한다. 신선한 매체와 복합 매체 III를 교체 모든 2~3일 (월요일, 수요일, 금요일 사용자 친화적 인 정권이다).
    주 : 공기 - 액체 계면 (9 일)에서 5 일 후 구조물이 식도 상피의 환경 적 요인의 영향을 실험에 사용하기에 충분히 성숙 식도 상피있다.
16. 실험의 끝에, 상기 분석가 대한 상피에서 조직 학적 분석 및 면역 조직 화학 염색 ⁷ 또는 추출물 단백질 ¹⁵ 또는 RNA ^11,16위한 구조를 해결이다. 필요한 경우 세포 외 신호 전달 분자 ^(17)의 분석 조건 배지를 유지한다.

결과

이 원고 성공적 인간 식도 상피의 배양 3D 모델로,도 1에 개략적 인 형태로 도시 필요한 프로세스를 설명한다. 실험 플랫폼 조직 학적 및 면역 조직 화학적 연구는 정상적인 인간의 식도 편평 점막으로 배양 조직을 비교 수행 된 같은 모델의 적합성을 확인합니다.

기재된 방법에 의해 제조 된 상피 조직 학적 평가는 세포의 더 얇은 (5 내지 10 층이라도 성숙, 다층, ?...

토론

이 원고는 식도 상피시의 환경 스트레스에 대한 노출의 영향을 연구하는 실험 플랫폼으로 사용하기에 적합한, 생물학적으로 중요한 인간 식도 점막 모델의 제조 및 특성을 설명한다.

인간 식도 점막 모델의 성공적인 제조를위한 가장 중요한 단계는 다음과 상피 세포의 대부분이 남아 증식 이미 지지체에이를 파종하기 전에 구별하기 시작되지 않았 음을 보장; 합성을 위해 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsin	BD Biosciences	215240	Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use.
DMEM	Labtech	LM-D1112	Warm in 37 °C water bath before use
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37 °C water bath before use
Foetal Calf Serum	Labtech	FB-1090
Epidermal Growth Factor	R+D Systems	236-EG-200	Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone	Sigma-Aldrich	H0396	Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Insulin	Sigma-Aldrich	I2767	Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use
Transferrin	Sigma-Aldrich	T2036	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	Prepare stock solution in water
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Brand name Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize
Collagenase A	Roche	10103578001
Povidone-iodine solution	Ecolab	10830E	Brand name Videne
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Newborn calf serum	Gibco	26010074
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use
O-phosphorylethanolamine	Sigma-Aldrich	P0503	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
ITS (insulin, transferrin, selenium)	Lonza	17-838Z	Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
EDTA 0.02% solution	Sigma-Aldrich	E8008	Warm in 37 °C water bath before use
T75 culture flask	VWR	734-2313
50 ml centrifuge tube	Fisher	11819650
15 ml universal tube	SLS	SLS7504
180 ml pot	VWR	216-2603
Petri dish	SLS	150350
6 well plate	VWR	734-2323
stainless steel rings			Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids			Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clone MM1. Use at 1:100.
CK4	Abcam	ab9004	Clone 6B10. Use at 1:200.
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clone LL002. Use at 1:200.
Involucrin	Novocastra	INV	Clone SY5. Use at 1:100.
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts	ATCC-LGC	CRL-1658	previously growth arrested by irradiation (60 Gy)