生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

要約

この原稿は、生産、特性評価および正常な初代ヒト食道線維芽細胞および脱細胞化ブタの足場内に播種した扁平上皮細胞から調製した組織工学3D食道構造物の潜在的な用途を説明しています。結果は、正常なヒトの食道に似成熟重層上皮の形成を実証します。

要約

食道腺癌およびその前駆体、バレット化生の両方の発生率は、西部の世界で急速に上昇しています。さらに、食道腺癌は、一般的に、近年の生存率にはほとんど改善して、予後不良を持っています。これらは、勉強する困難な状況であり、食道粘膜の障害を調査するために、適切な実験プラットフォームの欠如がありました。

ヒト食道粘膜のモデルは、従来の2D細胞培養系とは異なり、 生体内に存在する細胞-細胞及び細胞-マトリックス相互作用を再現すると、正常なヒトの場合と同様、成熟、重層上皮を生成する、マクニールの研究室で開発されました食道。簡単に言うと、モデルは、ブタ由来の無細胞食道足場内で増殖させた形質転換されていない正常な初代ヒト食道線維芽細胞および上皮細胞を利用します。このモデルの免疫組織化学的特性評価CK4、CK14によって、Ki67のとインボルクリン染色は、正常なヒト食道粘膜の組織学の適切な要約を示しています。

このモデルは、ヒトの食道粘膜の強固な、生物学的に関連する実験モデルを提供します。これは、簡単に薬剤の有効性と、アルコール、毒素、高温または胃食道refluxate部品などの環境要因への曝露の影響を含む研究課題の数を調査するために操作することができます。モデルはまた、最大20日間の関心のある物質に成熟した上皮の反復暴露の影響の研究を、 とりわけ可能、従来の2D細胞培養では達成できない、拡張培養期間を容易にします。さらに、このような食道腫瘍またはバレット化生に由来するものなどの細胞株、種々の、例えば、腫瘍浸潤および薬物responsiveneなどのプロセスを調査するためにモデルに組み込むことができますより生物学的に関連する環境でのSS。

概要

食道粘膜は、結合組織の層の上に層状、扁平上皮、粘膜固有層を含み、摂取環境ストレスに遭遇した最初のサイトの一つです。 duodenogastro食道逆流は、食道腺癌への進行のリスクの増加と関連しているバレット化生、の病因における重要な要因である一方、食物毒素への暴露は、食道扁平上皮癌の発症に関与しています。食道がんは、英国の男性と食道腺癌で8 ^番目の最も一般的な悪性腫瘍が急速に西洋世界¹に増加しています。また、約15％の全5年生存率と疾患の予後でほとんど改善、がありました。したがってdeveloでこの食道上皮の環境ストレスへの曝露の影響とその潜在的な関与を調査するための実験的なプラットフォームが必要とされています化生または新生物のpment。

不死化または腫瘍細胞株は、研究者は、インビトロでこれらのストレスには、上皮細胞の応答を研究することを可能にするが、それらは、増殖性のままであり、食道粘膜の最上層上に見出される成熟上皮細胞に分化することができません。また、既に腫瘍形成を起こした細胞株は、環境要因に上皮内の正常細胞の初期応答に関する限られた情報を提供することができます。これは、治療的介入の可能性が最も高いとすることができるステージがあります。最後に、従来の細胞培養系は、上皮および間葉細胞の間でおよびインビボでの組織内で発生し、これらの細胞と周囲のマトリックスとの間の潜在的に重要な相互作用を捕捉することができません。

動物モデルは食道epitheliの応答を研究するためのより現実的な微小環境を提供しますUMと胃食道逆流症²の人工的誘導を組み込むことができます。しかし、これらのモデルにおける環境ストレスを操作するより困難にすることができ、それらは完全にヒトの食道内に応答を表していない場合があります。

他の実験、ヒト食道モデルは、コラーゲンの一次細胞、不死化細胞または腫瘍細胞株を利用する開発、またはコラーゲン/マトリゲル、足場を含む線維芽細胞^3,4を合わせてきました。なお、この原稿に記載の無細胞食道足場よりもこれらの足場を生成するために少ない労働集約的であり、これらの器官のモデルは、コラーゲンゲル内への腫瘍細胞の浸潤を容易にすることができ、特に腫瘍浸潤^5,6の研究に有用なツールを提供します観察しました。しかしながら、これらのコラーゲンゲルは、非天然の機械的特性を有し、特定の基底膜とappropriat含む元の組織の特定の機能を欠いていますEの表面トポグラフィー。これは、コラーゲンゲル骨組^7を用いて、上皮と足場との間に、例えば、劣った接着をもたらす細胞の挙動に影響を与えることができます。その結果、無細胞ブタ食道足場は、より生物学的に現実的な足場と実験プラットフォームとして使用するための、より適切であるという利点と、開発されました。それはまた、これらの細胞が、多層上皮が形成するので、そのようなHET-1Aと不死化食道上皮細胞株、より食道構築物中に一次細胞を組み込むが、階層化または^4,7,8を区別しない方が良いことが示されています。

したがって、このプロトコルは、組織工学皮膚や口腔粘膜^9,10を製造するためのマクニールの研究室ですでに使用中の方法から適応し、初代ヒト食道上皮細胞および線維芽細胞と組み合わせた脱細胞化ブタ食道足場を内蔵しています。ティSプロトコルはCK4、CK14、Ki67をとインボルクリン染色によって示されるように、正常なヒト食道と同様の成熟した、重層上皮を生成します。得られたモデルは、環境ストレスへの応答を研究するための実験的なプラットフォームを提供し、成分^11を refluxateに応答して食道上皮における遺伝子発現の変化を調査するために効果的に使用されてきました。

プロトコル

ヒト食道細胞は胃や食道の手術を受けた患者から得られます。組織は、研究目的のために使用されるためにインフォームドコンセントを得て、組織が適切な倫理的承認（SSREC 165/03、ヒューマン研究の組織バンクライセンス12179）の下で匿名で使用します。

ヒト食道上皮細胞の単離1。

1. 層流の組織培養フード内で作業し、無菌技術を使用して、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）および3のハムF12混合することにより、上皮培養培地を調製：1の比（V：V）を。 10％の追加（v / v）のFCS、10 ngの/ mlの上皮成長因子、0.4 / mlのヒドロコルチゾン、1.8×10 ^-4 Mのアデニン、5μg/ mlのインスリン、5μg/ mlのトランスフェリン、2×10 ^-7 Mトリヨードサイロニン、1×10 ^-10 Mのコレラ毒素、2×10 ^-3 Mのグルタミン、100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および0.625 / mlのアムホテリシンBを
2. 標準の使用滅菌技術は、T75組織培養フラスコ中に100μg/ mlのストレプトマイシンDMEM 11mlの10％FCS、2×10 ^-3 MのL-グルタミン、100 IU / mlペニシリン、および0.625 / mlのアンホテリシンBを入れます。同じ培地1ml中に1×10 ⁶致死的に照射したマウス3T3線維芽細胞に^12を追加し、5％CO _2、加湿雰囲気中で37℃で一晩インキュベートします。これは、上皮細胞のその後の培養のためのフィーダー層を生成します。
3. メスを使用し、組織病 ​​理学者の勧告に続いて、胃や食道の手術を受けた患者から得られた食道扁平上皮粘膜の無病背景領域からの組織の約2cm ²の試料を分析。室温で無菌輸送培地50mlの容器（PBS 100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび0.625 / mlのアンホテリシンB）研究室への輸送。
4. この時点で、輸送に組織を保存します便宜上4℃で最大12時間（一晩）用培地;彼らは減少し、細胞の生存率をもたらすようにしかし、より長い保存期間を使用しないでください。
5. 層流の組織培養フード内で作業し、無菌技術を用いて、5分間、70％エタノールに浸漬することによって、メスの刃を滅菌します。滅菌PBSですすいでください。
6. 滅菌ペトリ皿に組織を配置し、0.5センチメートルのストリップにカットするためにメスを使用しています。 0.1％、5 mlを加え、ペトリ皿にPBS中のトリプシン（w / v）の皿に蓋を置き、37℃で1時間インキュベートします。
7. トリプシンを阻害するためにペトリ皿に組織を5mlのFCSを加えます。滅菌ピンセットで組織のストリップを持って、静かに周囲の媒体への上皮細胞を除去するためのストリップ当たり1〜2分間のメスの刃で上皮表面をこすり。掻き取った組織を除去し、脇に置きます。すべての組織片のためのプロセスを繰り返します。
8. 15mL遠心管に切り離さ上皮細胞を含む培地を収集遠心分離（5分間、200×gで）。上清を捨て、および上皮培地12mlの中にペレットを再懸濁（ステップ1.1に記載）。
9. 捨て、ステップ1.2で調製したT75フラスコ中のフィーダー細胞層から培地を捨てます。フラスコに新たに単離された上皮細胞を含む細胞懸濁液を追加し、5％CO _2、加湿雰囲気中で37℃でインキュベートし、滅菌ピペットを使用してください。
10. 24時間後にオフ注ぎ、また、細胞の破片が含まれ、培地を、廃棄し、新鮮な上皮培地12mlのと交換してください。 5％CO _2、加湿雰囲気中、37℃でインキュベーションを続け。コロニーは、次の24〜48時間にわたって表示されるように開始され、標準的な光学顕微鏡下で培養フラスコを配置することによって表示することができます。費やされた培地を捨て、新鮮な培地を等量の2〜3日ごとに交換してください。
11. フラスコを80％の密集度、継代細胞^13に達すると。 Cを分割モデルで使用するために細胞数を増加させるために5：1の比率でells。細胞を継代する24時間前に上皮細胞を受信する各フラスコに照射3T3細胞のフィーダー層を確立するために、ステップ1.2に従ってください。
    注：通路1とのみ4との間に、以下に記載の食道モデルで上皮細胞を使用してください。

ヒト食道線維芽細胞の単離2。

1. クリーンベンチでの作業と滅菌技術を使用して、ステップ1.7で確保された組織を取ります。滅菌ペトリ皿に置き、滅菌メスの刃で細断することによって細かく刻みます。 （w / v）の溶液をコラゲナーゼおよびペトリ皿に蓋を置き、5％CO _2、加湿雰囲気中、37℃で一晩インキュベートし、0.5％を10mlを加えます。
2. 慎重に、15mlの遠心管と遠心（10分、200 XG）にダイジェストを移しオフ注ぎ、上清を破棄し、線維芽細胞培養培地（DMEM、10％FCS 10mlにペレットを再懸濁、2×10 ^-3 MのL-グルタミン、100 IU / mlのペニシリン/ mlストレプトマイシン100μgを、0.625 / mlのアンホテリシンB）。
3. T75フラスコに懸濁液を入れ、5％CO _2、加湿雰囲気中、37℃でインキュベートします。 24時間後の破片が含まれており、新鮮な線維芽細胞培地12mlのと交換します媒体を捨てます。細胞数を増加させるために5比：彼らは1のセルを分割、80％の密集度¹³に到達^した後2〜3日ごとに継代細胞培養液を交換してください。
   注：通路4のみ10との間に、以下に記載のモデルに線維芽細胞を使用してください。

脱細胞化食道足場の調製

1. 食糧生産のために使用される、新たに屠殺ランドレース豚から屠殺場で無傷のブタ食道を取得します。一つの食道は、約30別々の構築のために十分な足場を提供します。
   注：これにより大規模で時間共に必要な滅菌プロトコルをnsumingは、一度、通常10食道の最小値を取得し、処理する価値があります。
2. 直ちに汚染微生物負荷を低減するために、5分間、10％ポビドンヨード溶液約150ミリリットルを含む180ミリリットルの滅菌ポットに、新たに切除した食道を配置します。 / mlストレプトマイシン200 IU / mlペニシリン、200μgの、および1.25 / mlのアンホテリシンBを含む滅菌PBSの約100ミリリットルを含む第二のポットに食道を転送
   1. 容器に蓋を交換し、室温に戻って研究室に食道を輸送。二または三食道は、その大きさに応じて、それぞれの容器に搬送することができます。
3. 実験室での後、微生物汚染を最小限にするために、無菌技術を用いて層流フード内で組織を処理します。 70％エタノール中に5分間浸漬し、滅菌PBSでリンスすることにより、ピンセット、はさみとメスの刃を滅菌します。
4. ESを扱います滅菌ピンセットを使用してophagus。はさみを使用して、縦方向に食道を切り開い。滅菌PBS約100 mlを含む180ミリリットルの滅菌ポットに食道を配置し、任意の破片を除去するために穏やかに振とうすることによって組織をすすぎます。
5. 70％エタノールで自由に噴霧することにより、コルク解剖ボードをきれいにし、乾燥させます。
6. PBSから食道を外し、滅菌針を使用して、ボード上に食道をピン、粘膜表面最上。滅菌ピンセットで食道の一端に粘膜表面をつかみ、ボードから引き離します。これは、基礎となる粘膜下組織から粘膜を分離します。
   1. その後、解剖は粘膜が離れて持ち上げることができるようにするために進むにつれて、ピンを除去し、粘膜固有層に沿って長手方向に食道を分析するために、無菌手術用メスの刃を使用しています。
7. 解剖粘膜を保持し、下にある粘膜下層を捨てます。
8. カットオフとtの最も近位および遠位の2センチメートルを破棄それぞれ^、7それらの領域における粘膜下腺より多数の厚い粘膜固有層が存在するように、彼は粘膜。
9. 5cm ^2の中に残った組織を切断するためにメスを使用してください。滅菌PBSの約150 mlを含む180ミリリットルの滅菌ポットにすべて切断組織を置き、組織を洗浄するために穏やかに攪拌します。一度つ以上の食道を処理する場合は、このために、複数のポット三以降の手順を使用する必要があるかもしれません。
10. 滅菌ピンセットを用いて、滅菌1MのNaCl、37℃で72時間、200 IU / mlペニシリン、200 / mlのストレプトマイシンおよび1.25 / mlのアムホテリシンBをインキュベートの150ミリリットルを含む180ミリリットルポットに切断組織を移します。
11. 150ミリリットル滅菌PBSを含む新鮮な180ミリリットルポットに組織を配置します。上皮は目に見えて、下にある組織から分離し始めているだろう。静かに滅菌ピンセットを用いて、豚の食道から切り離し上皮を剥離し、捨てます。
    1. 残りのTを配置新鮮な180ミリリットルの鍋に問題とは、滅菌PBSの150ミリリットルを追加します。洗浄するために5分間穏やかに攪拌します。 PBSを捨て、新鮮なPBSでさらに2回繰り返します。
12. 室温で24時間滅菌し、80％（v / v）のグリセロール溶液400mlを含む500mlのガラス瓶に、すべての組織を置きます。さらに24時間の滅菌90％（v / v）のグリセロール溶液400mlに移します。
13. 脱水と基底膜の完全性を維持しながら、組織を滅菌する4ヶ月以上室温で無菌の100％グリセロール溶液400ml中に保管してください。

培養培地の4生産

1. 培養液中で使用するためにキレート化された新生仔ウシ血清を準備します。
   1. ガラス1 Lボトルにキレックス100の100グラムを注ぎ、脱イオン水を加えます。正確な量は重要ではないが、十分な水がキレックス粉末をカバーするために追加する必要があります。磁気撹拌機を追加し、オートクレーブ処理（121℃で滅菌するための15分）。
   2. ボトルを冷却することを可能にし、キレックスを解決します。クリーンベンチでは、過剰の水を注ぐ新生仔ウシ血清（NCS）の500ミリリットルを追加し、4℃で一晩攪拌したままにします。
   3. 攪拌を停止し、キレックスこれは30分までかかることが、解決することができます。 -20℃のクリーンベンチでキレックスを乱さないように注意しながら、滅菌ピペットを用いてキレート化された血清をデカントし、10ミリリットルの分量を保存します。
2. プロ増殖性およびプロ分化製剤で終わるで始まる、クリーンベンチ内に三つの異なるメディアを準備します。
   1. （V：V）：1の比率、4×10 ^-3 M L-グルタミン、0.5 / mlのヒドロコルチゾン、1×10 ^-4 M Oの -phosphorylethanolamine、2×を私は3にDMEMとハムF12から構成される複合培地を調製10 ^-12 Mのトリヨードサイロニン、1.8×10 ^-4 Mのアデニン、1.88×10 ^-3 MのCaCl _2、4×10 ^-12 Mのプロゲステロン、10μg/ mlの中sulin、を10μg/ mlのトランスフェリン、10 ngの/ mlのセレン、1×10 ^-3 Mのエタノールアミンおよび0.1％（v / v）のキレートNCS。
   2. 0.1％（v / v）の非キレート化NCSとキレート化した血清を置き換える以外はコンポジットミディアム私として複合培地IIを準備します。
   3. オミットプロゲステロン以外複合培地IIとして、コンポジット中IIIを調製し、2％（v / v）の非キレート化NCSに血清を高めます。

ヒト食道粘膜モデルの5生産

1. 無菌環境を維持するために、無菌技術を用いて、層流フード内のすべての作業を実行します。滅菌PBSですすぎの前に、5分間、70％エタノールに浸漬することによって、すべてのツールを殺菌。
2. それが必要になる前の日は、無細胞ブタの食道足場を再水和。各構築物を作製するための足場の一枚が必要とされます。
   1. 滅菌PBS 100mlを含有するポットにブタ足場の組織場所に十分な作品を再水和するために、攪拌し、10分間浸します。デカPBSをNTと新鮮なPBSと交換します。すべてグリセロールトレースの除去を確実にするために洗浄工程を5回繰り返します。
3. 37℃で一晩DMEM 100ml中の再水和組織をインキュベートすることにより、足場の無菌性をテストします。足場は、無菌であることが想定されるインキュベーション期間の終わりに、培養培地の色または濁度の変化がない場合。無菌性が確認された後、最上位の、6ウェルプレートに粘膜下側を5cm ^2の無細胞の足場を置きます。
4. 各足場の中央に滅菌医療グレードのステンレス鋼製のリング（内径10ミリメートル、外径20ミリメートル）を置き、静かに組織との適切なシールを確保するために、滅菌ピンセットを用いて、下に押します。
5. 細胞懸濁液を生成するためにトリプシン-EDTA ^13を用いて線維芽細胞を収穫。血球計数器^14を用いて細胞数^を計測します。細胞懸濁液を遠心分離（10分間、200×gで）。 appropriaに細胞ペレットを再懸濁し1mlあたり2.5×10 ⁶細胞の最終細胞数を産生する線維芽細胞の培地のTE体積。
6. 各環内に5×10 ⁵のヒト食道線維芽細胞を含む、線維芽細胞培地の0.2ミリリットルを追加します。線維芽細胞培地の約2 mlのリングの外側の周りの領域をあふれさせます。 5％CO _2、加湿雰囲気中、37℃でインキュベートします。
7. 24時間後輪および線維芽細胞培地を除去し、各ウェルに、新鮮な線維芽細胞の培地の少なくとも5 mLを加え、足場は完全培地中に浸漬されることを保証します。 5％CO _2、2〜3日毎に培地を交換し、加湿雰囲気中で37℃で1週間培養物。
8. 1週間後、粘膜表面の最上層に配置し、媒体を除去し、滅菌ピンセットを用いて、各足場を反転、層状洪水フードに足場を含む6ウェルプレートを取り外します。この時点を0日と呼びます。
9. 中心部の粘膜表面に鋼リングを配置しますステップ5.4のように組織。
10. トリプシン処理¹³のための上皮細胞のT75フラスコを準備します。 PBSで洗浄し、前のトリプシンEDTA溶液を添加した後、各フラスコに、滅菌0.02％2mlの（w / v）のEDTA溶液を加えます。 37℃で2分間インキュベートします。添付の上皮細胞を残したまま、選択i3T3フィーダー層を分離するために静かにフラスコをタップします。
    注意：一般的に、すでに前の週のモデルに組み込まれた線維芽細胞に上皮細胞と一致している患者に実用的または必要はありません。
11. フィーダー層を含むEDTA溶液を捨ておよび上皮細胞^13を採取するために、トリプシン-EDTA溶液を加えます。血球計数器^14を用いて細胞数^を計測します。細胞懸濁液を遠心分離（10分間、200×gで）。 1mlあたり5×10 ⁶細胞の最終細胞数を産生するために、複合培地1の適切な量に細胞ペレットを再懸濁します。
12. ×1 1を含む、複合メディアIの0.2ミリリットルを追加します。リング内の0 ⁶上皮細胞。複合メディアIの約2 mlのリングの外側の周りの領域を洪水、5％CO _2、加湿雰囲気中、37℃のインキュベーター内に構築物を配置します。
13. 24時間（1日目）の後輪とメディアを除去し、新鮮な複合メディアIの少なくとも5ミリリットルを追加し、足場が完全に水没している確保し、インキュベーターに戻します。さらに24時間（2日目）後、培地を除去し、複合培地IIの少なくとも5mlで置き換え、再度足場を確保し、完全に水没し、インキュベーターに戻すされています。
14. 日に4場所滅菌医療グレードのステンレス鋼製メッシュグリッド新鮮な6ウェルプレートに（2センチ×0.5センチの高ワイド×2センチ）、構造物ごとに1。スチールグリッド、粘膜表面最上の一番上に構築物を転送するために滅菌ピンセットを使用してください。
    1. 液体は、合成の下側に到達するが、表面になるように十分な複合培地IIIを追加空気にさらされる、これは、サンプルが空気 - 液体界面で維持されることを保証します。必要なメディアの正確な量は、足場の厚さ、ウェルの容積とステンレス鋼グリッドの正確な高さに依存して変化します。
15. 実験の要件に応じて、10〜20日（24日目に14日目）のための気液界面での複合体を維持します。新鮮な培地で複合培地IIIを交換するごとに2〜3日（月曜日、水曜日、金曜日は、ユーザーフレンドリーな政権です）。
    注：気液界面（9日目）で5日後、構築物が食道上皮における環境要因の影響の実験に使用されるのに十分に成熟した食道上皮を持っています。
16. 実験の最後に、さらなるanalys用上皮から組織学的分析および免疫組織化学染色^7、または抽出タンパク質¹⁵またはRNA ^11,16のための構築物を修正です。必要に応じて、細胞外シグナル伝達分子¹⁷の分析のための馴化培地を保持します。

結果

この原稿が正常ヒト食道上皮の培養3Dモデルに、 図1に概略的に示され、必要なプロセスについて説明します。実験プラットフォームの組織学的および免疫組織化学的研究として、モデルの適合性を確認するために、正常なヒト食道扁平上皮粘膜との培養組織を比較行われています。

記載の方法により製造上皮の組織学的評価は、細胞の薄い（5〜10層にもか?...

ディスカッション

この原稿は、食道上皮の際に環境ストレスへの暴露の影響を研究するための実験プラットフォームとして使用するのに適した生物学的に関連するヒト食道粘膜モデルの産生および特徴を説明しています。

ヒト食道粘膜モデルの成功の生産のための最も重要なステップは、次のとおりです。上皮細胞の大部分は、増殖のままであり、すでに足場上に播種する前に区別する?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsin	BD Biosciences	215240	Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use.
DMEM	Labtech	LM-D1112	Warm in 37 °C water bath before use
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37 °C water bath before use
Foetal Calf Serum	Labtech	FB-1090
Epidermal Growth Factor	R+D Systems	236-EG-200	Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone	Sigma-Aldrich	H0396	Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Insulin	Sigma-Aldrich	I2767	Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use
Transferrin	Sigma-Aldrich	T2036	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	Prepare stock solution in water
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Brand name Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize
Collagenase A	Roche	10103578001
Povidone-iodine solution	Ecolab	10830E	Brand name Videne
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Newborn calf serum	Gibco	26010074
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use
O-phosphorylethanolamine	Sigma-Aldrich	P0503	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
ITS (insulin, transferrin, selenium)	Lonza	17-838Z	Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
EDTA 0.02% solution	Sigma-Aldrich	E8008	Warm in 37 °C water bath before use
T75 culture flask	VWR	734-2313
50 ml centrifuge tube	Fisher	11819650
15 ml universal tube	SLS	SLS7504
180 ml pot	VWR	216-2603
Petri dish	SLS	150350
6 well plate	VWR	734-2323
stainless steel rings			Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids			Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clone MM1. Use at 1:100.
CK4	Abcam	ab9004	Clone 6B10. Use at 1:200.
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clone LL002. Use at 1:200.
Involucrin	Novocastra	INV	Clone SY5. Use at 1:100.
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts	ATCC-LGC	CRL-1658	previously growth arrested by irradiation (60 Gy)