مخلب السحب: رواية، والتحليل الحساسة للماوس اختبار اسطوانة

Summary

يستخدم الكلاسيكية تحليل forelimb التماثل للاسطوانة الاختبار بشكل روتيني لتقييم العجز السلوكية في الفئران بعد إصابات الدماغ أو السكتة الدماغية. ومع ذلك، فإنه فشل في الكشف عن العجز المستمر في الفئران. توضح هذه الدراسة أن قياس السلوك مخلب-السحب هو تحليل أكثر حساسية للإصابة المخ في الفئران.

Abstract

يتم استخدام اسطوانة الاختبار بشكل روتيني للتنبؤ الأضرار الدماغية البؤري إلى القشرة الحركية forelimb في القوارض. عندما وضعت في الاسطوانة والقوارض تستكشف من قبل تربية ولمس جدران الاسطوانة مع الكفوف forelimb من أجل دعم الوضعي. بعد الإصابة الدماغية إلى القشرة الحسية forelimb، الجرذان تعتمد بشكل أكبر على من لم يتأثر forelimb مخلب لدعم الوضعي مما أدى إلى اللمسات أقل مع مخلب المتضررين والذي يسمى forelimb التباين. في المقابل، فشل الأضرار الدماغية البؤري في مخ الفأر أن يؤدي إلى العجز مقارنة ثابتة في forelimb التباين. في حين عجز forelimb التباين لوحظ بشكل غير منتظم، والفئران لا يبرهن على وجود وظيفة السلوك رواية السكتة الدماغية تسمى "سحب-باو". مخلب-السحب هو الميل عن الماوس لسحب مخلب المتضررين على طول جدار الاسطوانة بدلا من دفع مباشرة من خارج الجدار عند الترجل من الخلف إلى موقف أربعة أرجل. لقد سبق أثبتت أنمخلب-سحب السلوك حساس جدا للإصابات الدماغية القشرية الصغيرة إلى القشرة الحركية forelimb. نحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لتحليل سحب مخلب. نحدد ما هو مخلب السحب وشرح كيفية تحديد سلوك سحب مخلب. اختبار اسطوانة هو اختبار بسيط وغير مكلف لإدارة ولا يتطلب التدريب قبل أو استراتيجيات الحرمان من الطعام. في استخدام تحليل سحب مخلب مع اختبار اسطوانة، يملأ مكانا للتنبؤ الإصابات الدماغية القشرية مثل photothrombosis وEndothelin-1 (ET-1) نقص التروية يسببها - نموذجين التي تزيد على الإطلاق في شعبية وتنتج إصابات التنسيق أصغر من وسط انسداد الشريان الدماغي. أخيرا، وقياس السلوك سحب مخلب في اسطوانة الاختبار سيسمح دراسات الانتعاش وظيفية بعد الاصابة القشرية باستخدام فوج واسعة من سلالات الفئران المعدلة وراثيا حيث فشلت السابق تحليل forelimb التماثل للكشف عن عجز متسقة.

Introduction

هدف استراتيجيات تجديد العصبية هو تثبت كل إصلاح الأنسجة والانتعاش وظيفية. وعادة ما يتم تقييم الانتعاش وظيفية مع الاختبارات السلوكية التي تقيس عجز وظيفي، في هذه الحالة التي تنطوي على المهارات الحركية التي ترتبط مع الأضرار التي لحقت مناطق محددة في الدماغ. إصابات في الدماغ أو ضرر نقص تروية إلى منطقة forelimb الحسية من القشرة يمكن البرهنة من قبل عدد من الاختبارات السلوكية. واحدة من هذه التجارب، يتم استخدام اسطوانة الاختبار على نطاق واسع في الفئران لتقييم عجز وظيفي في نشاط forelimb ^1. اختبار لديه منخفضة التكلفة انشاء تتطلب سوى اسطوانة، وكاميرا والجدول مع كبار شفافة. فمن السهل أن إدارة لأنه يقوم على السلوك الاستكشافي الطبيعية من القوارض، لذلك ليس هناك حاجة للتدريب قبل والحرمان من الطعام أو المكافآت. وعلى الرغم من هذه المزايا العديدة، ويستخدم تحت الاختبار اسطوانة لتقييم العجز forelimb في الفئران بعد اصابات التنسيق إلى الصورة forelimbensorimotor القشرة، التي نوليها لتحليل سلوك الماوس في اختبار اسطوانة. التباين Forelimb هو المقياس التقليدي للتحليل لاختبار اسطوانة. عندما وضعت في الاسطوانة والقوارض بشكل طبيعي استكشاف جدران الاسطوانة تربية على أطرافهم الخلفية ولمس جدران الاسطوانة مع الكفوف forelimb لتحقيق التوازن الوضعي. يمكن تقدير عدد من اللمسات مخلب مع الجدار مع كل forelimb بسهولة عن طريق تصوير القوارض خلال هذا الاستكشاف للاسطوانة. يحدث عدم تناسق Forelimb عندما يجعل مخلب forelimb المتضررة أقل اللمسات مع الجدار من forelimb مخلب تتأثر ويدل على الأضرار التي لحقت الحسية القشرة المقابل. في الفئران، والحقن داخل القشرية من وكيل مضيق للأوعية، Endothelin (ET-1)، إلى القشرة الحسية forelimb يسبب آفة الدماغية التنسيق مما يؤدي إلى العجز السلوكية في forelimb المقابل. تم الكشف عن العجز في استخدام forelimb المقابل بسهولة عن التغيرات في وorelimb عدم التماثل في اختبار اسطوانة في الفئران ^1-3. وعلى النقيض من الفئران ومع ذلك، والتغيرات في forelimb التباين متغيرة وأقل ثباتا في الفئران التالية مقارنة ET-1 حقن ^4-6. نحن هنا يبرهن على وجود تحليل رواية السلوك forelimb في اختبار اسطوانة - تحليل السلوك سحب مخلب. لقد أظهرنا سابقا أن تحليل سحب مخلب هو مقياس أكثر حساسية من الأضرار التي لحقت الحسية القشرة forelimb في الفئران من تحليل التباين forelimb الكلاسيكية، وبالتالي ينطبق على مجموعة متنوعة من نماذج التنسيق إصابة القشرية.

بحث كيفية الاتصال forepaw جدار الاسطوانة التالية الأضرار الناجمة عن فقر الدم إلى القشرة الحسية forelimb كشف سلوك الرواية في الفئران - مخلب-سحب ^4. يحدث مخلب السحب عندما يقف الماوس على سيقانه الخلفية لاستكشاف جدار الاسطوانة ثم تستمر في المتضررين (مضاد التقرحي) مخلب على طول جدار الاسطوانة نحو خط الوسط، أو إلى أسفل بينما الحائطيوفر forepaw لها تتأثر دعم الوضعي ضد الجدار. مخلب-تستمر نادرا ما تحدث في الفئران لم يصب بالتالي ظهور مخلب السحب هو مؤشر إيجابي من إصابة في forelimb الحسية القشرة ^4. لقد كميا سابقا السلوك سحب مخلب في الفئران التالية ET-1 الأضرار الدماغية إلى forelimb الحسية القشرة وأظهرت سلوك سحب مخلب المستمر في الفئران تصل إلى أسبوعين بعد السكتة الدماغية ^4. نحن هنا تشير إلى أن يستمر السلوك سحب مخلب تصل إلى أربعة أسابيع بعد السكتة الدماغية. تحليل سلوك سحب مخلب يوفر أداة جديدة وحساسة لتقييم الأضرار الناجمة عن فقر الدم البؤري إلى القشرة الحسية forelimb في الفئران. به غير مكلفة الاعداد، وسهولة الإدارة ويحرز جعل هذا بسيط، وأداة ولكنها مفيدة لتقييم بسرعة العجز السلوكية forelimb في الفئران.

Protocol

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على جميع التجارب التي كتبها جامعة ميموريال لجنة أخلاقيات رعاية الحيوان نيوفاوندلاند وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي للرعاية الحيوان.

1. الفئران

1. استخدام فئران بالغة. في هذه الدراسة، تم استخدام الذكور البالغين FVBN الفئران (ن = 10) بين 2-4 أشهر. الفئران منزل على ساعة 12:12 عكس دورة ضوء الظلام وتوفر القياسية طعام القوارض والمياه الإعلانية libitum.

2. المواد المطلوبة لاختبار اسطوانة

1. الحصول على الجدول مع كبار شفافة لتصوير اسطوانة الاختبار. أبعاد الجدول ليست ذات صلة، يجب أن يكون أعلى شبكي أو الزجاج، ويجب أن يكون هناك مساحة كافية لوضع مرآة أسفل الجدول. وهذا يسمح للفأر أن شريط فيديو من الأسفل. استخدام مرآة أسفل الجدول لتعكس الصورة من خلال الاسطوانة. وكبديل لذلك، استخدام الكاميرا رأسا على عقب إذا كانت متوفرة. أبعاد الجدول المستخدمة في هذا البروتوكول هي 54 × 56 × 66.5CM (wxlxh) مع 51 × 51CM أعلى (wxl).
2. الحصول على المرآة. أبعاد المرآة المستخدمة في هذا البروتوكول هي 34 X 58CM (wxl).
3. الحصول على الشفافية / شبكي اسطوانة لالماوس لأداء في. أبعاد الاسطوانة المستخدمة في هذا البروتوكول هي 17.5CM عالية، 8.8cm ID، 9.5CM OD مع سمك جدار 0.35cm. قد تكون هناك حاجة لاسطوانة أطول لسلالات الفئران أكثر نشاطا.
4. وضع الاسطوانة على الطاولة وتصوير انعكاس في المرآة أدناه.
5. وثمة حاجة إلى فيديو وترايبود. تسجيل الفيديو في حوالي 650Kb / s، والذي 190MB لكل 5 دقائق من اسطوانة فيديو تقريبا. تأكد من أن الكاميرا لديه وظيفة التكبير للتأكد من أن اسطوانة تشمل كامل مجال الرأي.
   ملاحظة: فيديو المستخدمة في هذا البروتوكول هو سوني DCR-SR42، 40X زووم بصري، تقريب رقمي 2،000x، 680kpix الذي يستخدم تعريف موحد، NTSC الفيديو المتداخلة).
6. الحصول على برنامج لتحليل - رر وسائل الإعلامآير مع دعم الفيديو وسرعة التشغيل التشكيل. مشغل الوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول هو v2.1.2 VLC ميديا ​​بلاير.
7. الحصول على جهاز كمبيوتر مع نظام التشغيل قادرة على تشغيل مشغل الوسائط وجهاز العرض.
8. مطلوب التخزين الالكتروني للفيديو. تحميل ملفات الفيديو إلى قرص صلب خارجي أو نسخها على أقراص الفيديو الرقمية للتخزين على المدى الطويل.
   ملاحظة: في 190MB في الفيديو، و84 جلسات تناسب على بطاقة SD 16 GB وسوف 168 جلسات تناسب على بطاقة SD 32GB. بسبب الرخص النسبي للSD وسائل الإعلام، وعدم اليقين في كم من الوقت تتطلب بعض الفئران لاستكمال 20 المؤخرات، فمن المستحسن بطاقة 32 GB. في الدراسة الحالية، تم نسخ ملفات الفيديو من الكاميرا إلى قرص صلب خارجي 2TB ثم منسوخ على أقراص الفيديو الرقمية كما احتياطية.

3. إعداد التجريبي لاختبار اسطوانة

1. ربط مرآة تحت طاولة في زاوية 45 درجة إلى الطاولة. هل هذا باستخدام اثنين من الأقواس دعم تعلق على أرجل الطاولة لsupporر الجزء العلوي والسفلي من مرآة، على التوالي. وأشار مواقع القوس في-عرض الجانب من الجدول (الشكل 1A) ورؤية وجه في الجدول (الشكل 1B).
2. وضع اسطوانة في وسط الجدول. رسم أربعة خطوط مسافة واحدة حيث يجلس الاسطوانة على الطاولة مع علامة سوداء (Sharpie) بحيث يمكن رفع الاسطوانة، وعاد إلى نفس الموقف (الشكل 2). رسم لهم على الجانب السفلي من سطح الطاولة شفافة تسمح الطاولة لتنظيفها بين التجارب على الحيوانات دون حل الحبر علامة.
3. نعلق الكاميرا وترايبود. تهدف الكاميرا في المرآة بحيث الصورة تتطلع مباشرة من خلال فوهة الاسطوانة. تأكد من أن الجدار الداخلي الكامل للاسطوانة مرئيا ودون عائق من قبل القاعدة (الشكل 3). مشاهدة عرض جنب على من الإعداد، بما في ذلك زاوية النسبية للكاميرا ومرآة الإعداد، من فوق (الشكل 4A) ومنمستوى الطاولة، بما في ذلك تربية الماوس (الشكل 4B).
4. إعداد بطاقات جديلة لتعريف كل الماوس قبل التصوير. تأكد من أن بطاقات وعادة ما تشمل رقم هوية لكل الماوس، ونقطة وقت الاختبار (على سبيل المثال، وبعد 3 أيام العلاج) وتاريخ الدورة التصوير. لا تشمل مجموعة العلاج على بطاقة جديلة لضمان أعمى المجرب.
5. مطلوب الفيلم في ظروف الإضاءة في الأماكن المغلقة القياسية حيث أن هذا المستوى من الضوء لرؤية واضحة حركات الماوس حول الاسطوانة.
   ملاحظة: إذا كان متوفرا تصوير في الظلام مع كاميرا الضوء الأحمر قد يكون كافيا، ولكن يمكن لأحد أن تحتاج أولا لاختبار ما إذا اللمسات مخلب والمؤثرات السلبية بشكل واضح لتقدير مرئية.

4. تنفيذ

1. بدء التصوير. عرض الماوس بطاقة جديلة المناسبة أمام عدسة الكاميرا.
2. خفض الماوس في الاسطوانة من الأعلى مفتوح مباشرة بعد تصوير بطاقة جديلة.
3. يبدأ تصوير الفيلم الماوس. تقليل الضوضاء أثناء هذا الوقت، كما الفئران قد يفقد الاهتمام في استكشاف إذا الدهشة.
4. مراقبة الفئران الخلفي لاستكشاف الاسطوانة. التقاط الفيديو حتى ينفذ الماوس ما لا يقل عن عشرين المؤخرات.
   ملاحظة: الخلفية يحدث عند كل الأرجل الأمامية تفقد الاتصال مع الأرض، والماوس يقف على رجليه الخلفيتين.
5. مسح الطاولة واسطوانة مع محلول التنظيف المناسب بين كل فأر لتطهير وإزالة الروائح الماوس.
6. تجميد هو عندما تتوقف الفئران استكشاف وتظل جالسة بهدوء على أربع لمدة 5 دقائق تقريبا. إذا الفئران تجميد قبل حدوث عشرين المؤخرات، قد يكون من الضروري إزالتها من الاسطوانة لمدة 10-20 دقيقة قبل استئناف الاختبار. إذا الفئران لا يؤدون عشرين المؤخرات، تتم إزالتها من الدراسة.
   ملاحظة: في تجربتنا، وهناك حاجة الفئران أبدا أن تكون مستبعدة نظرا لعدم استكشاف الاسطوانة.

5. تقييم اختبار اسطوانة باستخدام باو-بجرتحليل

1. تشغيل الفيديو بمعدل يتراوح بين 0.25X و0.67X السرعة العادية اعتمادا على كيفية بسرعة الماوس يستكشف الاسطوانة. استخدام لاعب وسائل الاعلام التي توفر سرعات تشغيل أبطأ.
2. تحديد عدد من اللمسات مخلب. تحدث اللمسات مخلب عندما المؤخرات الماوس (الشكل 5A)، يمس الجانب من الاسطوانة (الشكل 5B)، يترجل في وقت لاحق مع كل الكفوف في وقت واحد (الشكل 5C) والأراضي (الشكل 5D). يجوز للمخلب أو قد لا الاتصال جدار الاسطوانة مع النخيل الكامل، ولكن بعض الاتصالات مع جدار الأسطوانة يجب أن يحدث. تقييم اللمسات مخلب عن طريق حساب عدد المرات الماوس يجعل الاتصال (مهما كان قصيرا) مع جدار الاسطوانة مع أحدهما أو كليهما الأرجل الأمامية بينما كان واقفا على أطرافه الخلفية خلال العمق.
   لاحظ أن الاتصال مع جدار الاسطوانة يعد فقط باعتباره "لمسة مخلب" أو "مخلب السحب" إذا كان الفأر هو في المقعد الخلفي - مكانةعلى أطرافه الخلفية مع كل من الأرجل الأمامية الخروج من الطاولة. إذا بقي الماوس في موقف 3 نقاط - كل من أطرافه الخلفية وforepaw واحد على الطاولة وتستمر للمس الجدار مع مخلب الحرة - وهذا لا يعد لمسة مخلب. قد الفئران الخلفي وتلمس جدار الاسطوانة مع forepaw واحد ويحسب هذا كما لمسة مخلب. ملاحظة: قد ماوس أيضا نقل جسمها حول اسطوانة خلال الخلفي، مما يجعل أكثر من اثنين من الاتصالات. وأحصت هذه الاتصالات - واحد لكل لمسة forepaw الأيسر واحد لكل لمسة forepaw الصحيح.
3. تحديد عدد مخلب-المؤثرات السلبية. مخلب-سحب السلوك يختلف من اللمسات مخلب العادية.
   1. إذا كانت الأسماء مخلب جدار الاسطوانة مع راحة اليد المفتوحة الكامل (الشكل 6B)، فإنه سيسقط ببطء بعيدا عن الجدار، في كثير من الأحيان مع بهزة خفيفة. حركة تبدأ مع الأرقام سحب ضد جدار الاسطوانة إما في اتجاه وسطي أو هبوطا، (الشكل 6C) قبل أن يسقط بعيدا الإنشائيةاعل (الشكل 6D). سوف الماوس ثم إلغاء تحميل مع مخلب يتأثر بها (الشكل 6E) قبل أن تهبط على أربع (الشكل 6F). ويعتبر هذا مخلب السحب ويجب أن تحسب في رصيده.
   2. إذا لم مخلب الاتصال جدار الاسطوانة مع النخيل مفتوحة بالكامل، وسوف ترعى جدار الاسطوانة مع ارقام اعمالها قبل أن يسقط بعيدا عن جدار الاسطوانة. وبالمثل، فإن الماوس قد سحب مخلب ضد جدار الاسطوانة ولكن ليس الإفراج عنها تماما قبل الترجل. وتعتبر هذه كلا مخلب-تستمر كذلك لمسات وينبغي أن يحسب على حد سواء في رصيده.
   3. مخلب قد سحب أيضا على طول جدار الاسطوانة في حين ماوس يستكشف الاسطوانة. في هذه الحالة، فإن مخلب يتبع التواء الجذع الماوس، كما يستكشف اليسار أو اليمين من موقعها الأصلي (الشكل 7A-D) قبل الترجل (الشكل 7E). ولا يعتبر هذا مخلب السحب، لأنها تعتمد على الماوس اختيار عشوائياتجاه لاستكشاف ولا يعتمد على الذي تضرر نصف الكرة القشرية.
4. يتم التعبير عن المؤثرات السلبية مخلب كنسبة مئوية من مخلب-تستمر في عدد من اللمسات مخلب خلال الدورة. تعبير عن عدد من مخلب-المؤثرات السلبية كنسبة مئوية من إجمالي الاتصالات مخلب لكل forelimb على حدة.
5. اللمسات مما أدى إلى مخلب السحب عد بمثابة مخلب السحب ولمسة في نفس الوقت. وبالتالي، إذا كان الماوس تستمر مخلب لها في كل مرة الاتصالات مخلب لها جدار الاسطوانة، وأعرب مئوية سحب مخلب الى 100٪.

6. اقتراحات تصميم التجارب إضافية

1. لتقليل المتغيرات الدخيلة:
   1. اختبار الفئران في نفس الوقت في كل يوم الاختبار. اختبار الفئران خلال دورة أعقابها. حفظ الفئران على دورة ضوء الاتجاه المعاكس 12 ساعة يسهل الأداء.
   2. قد تكون الفئران مترددة في استكشاف الاسطوانة إذا أكد إما عن طريق الضوضاء أو بيئة جديدة. اختبار الفئران في غرفهم عقد الحيوان أو غرفة قاموا باطلع التابعين مع يقلل من الإجهاد. يمكن أن يحدث هذا إذا كانت الغرفة صاخبة، إذا تم تزاحم الماوس قبل دخول الاسطوانة أو بسبب التعود.
      يجب أن يتم تنفيذ اختبار مرة واحدة قبل التلاعب التجريبية لتكون بمثابة الأساس القراءة: ملاحظة. بعد التلاعب، واختبار الأيام وفقا لتقدير المجرب، على الرغم من أن ينصح لتجنب عدد كبير من التعرض للاسطوانة خلال فترة قصيرة من الزمن.
   3. قد تصبح الفئران مترددة في العمق بعد 6-7 التعرض للاسطوانة. للدراسة الحالية، تم اختبار الفئران في اسطوانة لما مجموعه سبع مرات، قبل التروية وعلى أيام 1 و 3 و 7 و 14 و 21 و 28 بعد الجراحة.
      ملاحظة: في هذه الدراسة استخدمنا سلالة FVBN الماوس. لقد اختبرنا سابقا C57BL / 6 الفئران في الاسطوانة والملاحظ سلوك سحب مخلب بعد ET-1 الإصابة الدماغية (لا تظهر البيانات). وكانت C57BL / 6 الفئران أكثر نشاطا من FVBN الفئران عندما تربية وكثيرا ما قفزت على حافة الاسطوانةقبل التسلق للخروج. وينبغي أن تستخدم اسطوانات أطول إذا محاولة للهروب الفئران من خلال القفز.

7. Endothelin-1 جراحة وعائق حجم القياسات

1. أداء Endothelin-1 جراحة وقياسات حجم احتشاء وفقا لبروتوكولات المنشورة سابقا ^(4). استهداف الأمامية القشرة forelimb السيارات، ويجب على كل الماوس يتلقى ثلاثة ET-1 حقن في الإحداثيات التالية: (أ) +0.7 anteriorposterior (AP) /1.5 سطي الاطراف (مل) / - 1.2 الظهري-البطني (DV)، ( ب) +0.4 AP / 1.25 مل / - 1.2 DV و (ج) +0.1 AP / 1.75 مل / -1.2 DV ^4.

8. التحليل الإحصائي

1. ينصح اتجاهين تحليل التدابير المتكررة التباين (ANOVA) لتحليل المئة من لالكفوف المتضررة وغير المتضررة عبر نقاط زمنية مختلفة، سحب مخلب.

النتائج

لقد أثبتنا سابقا يبدو أن سلوك سحب مخلب بعد الإصابة الدماغية التنسيق إلى forelimb الحسية القشرة، وهو مؤشر إيجابي من الضرر ^4. استخدمت الحقن داخل القشرية من ET-1 في القشرة الحسية forelimb للحث على آفة الدماغية (الشكل 8A، B). وبحثت هذه الدراسة ما إذا كان سلوك سحب مخلب ت?...

Discussion

النقاط الرئيسية لإقامة عند قياس سلوك سحب مخلب في اسطوانة الاختبار ما يلي: أ) تحديد عدد مخلب-تستمر مقابل إجمالي اللمسات مخلب لكل مخلب قبل إصابات الدماغ لإنشاء خط الأساس. ب) تحديد عدد من مخلب-المؤثرات السلبية مقابل إجمالي اللمسات مخلب لكل مخلب بعد الإصابة الدماغية. والث...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plexi-glass cylinder			17.5 cm high, 9.5 cm outer diameter, 8.8 cm inner diameter, wall thickness 0.35 cm (or 3.5 mm)
viewing table			54x56x66.5 cm (width x length x height), top of table is a 51x51 cm sheet of plexiglass.
mirror			34x58 cm mirror
video camera	Sony	DCR-SR42	Video camera with onboard storage, SD functionality, 40x optical zoom
computer	Dell	Optiplex 760	Processor: Intel, 3.0 GHz, Memory 4.00GB (RAM)
computer monitor	Samsung	S22C350H
Excel (Microsoft Office Professional Plus)	Microsoft	v14.0.7106.5003
VLC Media Player	Video LAN	v2.1.2	Media player with playback speed modulation and video support
External Hard Drive	Western Digital	WDBAAU0020HBK-01	2 TB