Paw-sürükleme: Bir Roman, Fare Silindir Test Hassas Analizi

Özet

Silindir testi Klasik ön ayakları asimetri analizleri rutin beyin hasarı veya inme aşağıdaki sıçanlarda davranışsal açıkları değerlendirmek için kullanılır; Bununla birlikte, bu farelerin tutarlı açıkları tespit etmek için başarısız olur. Bu çalışma pençe-sürükleme davranışını miktarının farelerde beyin hasarının daha duyarlı bir analiz olduğunu göstermektedir.

Özet

Silindir testi rutin olarak kemirgenlerde ön ayakları motor korteks fokal iskemik hasarı tahmin etmek için kullanılır. Silindire yerleştirildiğinde, kemirgenler yetiştirme ve postural destek için onların ön ayakları pençeleri ile silindir duvarlarını dokunarak keşfedebilirsiniz. Ön ayakları sensorimotor korteks iskemik hasarı takiben, sıçanlar ön ayakları asimetri denir onların etkilenen pençe ile daha az dokunur sonuçlanan postural destek için etkilenmemiş ön ayakları pençe daha ağır güveniyor. Buna karşılık, fare beyninde fokal iskemik hasar ön ayakları asimetri karşılaştırılabilir tutarlı açıkları neden başarısız olur. Ön ayakları asimetri açıkları seyrek görülürken, fareler "pençe-sürükleme" olarak adlandırılan yeni bir davranış sonrası inme göstermek yok. Paw-sürükleme, bir dört ayaklı duruş bir arkadan sökülmesi sırasında doğrudan duvardan defol ziyade silindir duvar boyunca onun etkilenen pençe sürüklemek için fare eğilimidir. Daha önce olduğunu göstermiştirPençe-sürükleyerek davranış ön ayakları motor korteks küçük kortikal iskemik yaralanmalara oldukça duyarlıdır. Burada pençe-sürükleyerek analizi için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bir pençe-drag ne olduğunu tanımlamak ve pençe-sürükleyerek davranışını ölçmek için nasıl gösterilmektedir. Silindir testi yönetmek için basit ve ucuz bir testtir ve ön eğitim veya gıda yoksunluk stratejileri gerektirmez. Daha küçük odak yaralanmaları popülaritesi artan ve üretirler iki model - silindir testi ile pençe-sürükleyerek analizini kullanarak, böyle Fototromboz ve Endotelin-1 (ET-1) teşvikli iskemi gibi kortikal iskemik yaralanma tahmin etmek için bir boşluğu doldurmaktadır Orta serebral arter tıkanıklığı daha. Son olarak, silindir testinde pençe-sürükleyerek davranışını ölçen önceki ön ayakları asimetri analizleri tutarlı açıklarını tespit etmek için başarısız oldu transgenik fare suşlarının geniş kohort kullanarak kortikal yaralanma sonrası fonksiyonel iyileşme çalışmalarını sağlayacaktır.

Giriş

Nöral rejenerasyon stratejileri hedefi doku onarımı ve fonksiyonel iyileşmeyi hem göstermektir. Fonksiyonel iyileşme genellikle spesifik beyin bölgelerinde hasar ile ilişkili motor becerileri kapsayan bu durumda, fonksiyon kaybı ölçmek davranış testleri ile değerlendirilir. Travmatik beyin yaralanması ya da korteksin sensorimotor ön ayakları bölgesinde bir iskemik hasarı davranış testleri bir dizi ile ispat edilebilir. Böyle bir testi, silindir testi ön ayakları faaliyeti ¹ işlev bozukluklarını değerlendirmek için sıçanlarda yaygın olarak kullanılır. Test şeffaf bir üst sadece bir silindir, kamera ve masa gerektiren düşük kurulum maliyeti vardır. O kemirgenler doğal keşif davranışı dayalı olarak yönetmek kolaydır, bu nedenle egzersiz öncesi ve gıda yoksunluğu veya ödülleri gerekli değildir. Bu sayısız avantajlara rağmen, silindir testi ön ayakları s odak yaralanmalar aşağıdaki farelerde ön ayakları açıklarını değerlendirmek altında kullanılmaktadırBiz silindir testi fare davranış analizine özellik korteksi, ensorimotor. Ön ayakları asimetri silindir testi için analiz klasik ölçüsüdür. Silindire yerleştirildiğinde, kemirgenler doğal olarak arka bacaklarda üzerine yetiştirme ve postural denge için kendi ön ayakları pençeleri ile silindir duvarları dokunarak silindirin duvarları keşfedebilirsiniz. Her ön ayakları ile duvar pençe dokunur sayısı kolaylıkla silindirin bu keşif sırasında kemirgenler filme ile ölçülür. Etkilenen ön ayakları pençe etkilenmeyen ön ayakları pençe daha duvar az dokunur yapar ve karşı sensorimotor korteks hasar gösterdiğinde ön ayakları asimetri oluşur. Sıçanlarda, damar daraltıcı madde intra-kortikal enjeksiyonlar, Endotelin ön ayakları sensorimotor kortekse (ET-1), karşı ön ayakları davranışsal hasarları ile sonuçlanan bir fokal iskemi lezyon neden olur. Karşı ön ayakları kullanımda Açıkları kolaylıkla f değişiklikler olarak tespit edilirSıçanlarda ^1-3 silindir test asimetri orelimb. Ancak sıçanlar aksine, ön ayakları asimetri değişiklikler değişir ve karşılaştırılabilir ET-1 enjeksiyonu ^4-6 ardından farelerde daha az uyumludur. Burada silindir testinde ön ayakları davranış yeni bir analizini göstermektedir - pençe-sürükleyerek davranışının analizi. Daha önce bu pençe sürükleyerek analizi, klasik ön ayakları asimetri analizine göre farelerde ön ayakları sensorimotor korteks hasar daha duyarlı bir ölçüdür ve bu nedenle fokal kortikal yaralanma modellerinin çeşitli uygulanabilir olduğunu göstermiştir.

⁴ pençe-sürükleyerek - nasıl forepaw temasların incelenmesi ön ayakları sensorimotor korteks iskemik hasar aşağıdaki silindir duvar farelerde yeni davranış ortaya koymuştur. Fare sonra kendi orta hatta doğru veya duvar süre aşağı silindir duvar boyunca onun etkilenen (-kontra lezyonal) pençe sürükler silindir duvarını keşfetmek için arka ayakları üzerinde duruyor zaman bir pençe sürükleme oluşuronun etkilenmemiş forepaw duvara postural destek sağlar. Paw-sürükler nadiren bu nedenle pençe-drag görünümü ön ayakları sensorimotor korteks ⁴ yaralanma olumlu bir göstergedir yaralanmamış farelere meydana gelir. Biz daha önce ön ayakları sensorimotor korteks ET-1 iskemik hasarı aşağıdaki farelerde pençe-sürükleyerek davranışını sayısal ve inme sonrası ⁴ iki haftaya kadar farelerde sürekli pençe-sürükleyerek davranışı göstermiştir. Burada pençe-sürükleyerek davranışı dört hafta sonrası inme kadar sürekli olduğunu göstermektedir. Pençe-sürükleyerek davranış analizi farelerde ön ayakları sensorimotor korteks fokal iskemik hasarı değerlendirmek için yeni ve duyarlı bir araç sağlar. Onun ucuz set-up, yönetim kolaylığı ve bu hızla farelerde ön ayakları davranış açıklarını değerlendirmek için basit ama kullanışlı bir araç haline puanlama.

Protokol

Etik bildirimi: Bütün deneyler Hayvan Bakımı Kanada Konseyi kurallarına göre Newfoundland Hayvan Bakım Etik Kurulu Memorial Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Fare

1. Yetişkin fareler kullanın. Bu çalışmada, yetişkin erkek FVBN fare (n = 10) arasında 2-4 ay kullanılmıştır. 12:12 hr ev fareleri aydınlık-karanlık döngüsü ters ve standart kemirgen yemi ve su ad libitum sağlar.

Silindir Testi İçin Gerekli Malzemeler 2.

1. Silindir testin filme alınmasında şeffaf üst bir tablo elde etmek. Tablonun boyutları üst pleksiglas veya cam olmalı, ve masanın altına bir ayna konumlandırmak için yeterli yer olmalıdır, alakasız. Fare aşağıdan videoya edilmesi için bu izin verir. Silindir boyunca görüntü yansıtmak için aşağıdaki tabloda bir ayna kullanın. Varsa bir alternatif olarak, baş aşağı kamera kullanımı. Bu protokolde kullanılan tablonun boyutları 54 x 56 x 66.5cm 51 x 51cm üst (WXL) ile (ExBxY).
2. Bir ayna alın. Bu protokolde kullanılan ayna boyutları 34 x 58cm (WXL) bulunmaktadır.
3. Fare gerçekleştirmek için şeffaf / pleksiglas silindiri edinin. Bu protokolde kullanılan silindirin boyutları yüksek 17.5cm, 8,8 cm ID, 0.35cm bir duvar kalınlığı ile 9.5cm OD vardır. Bir uzun silindir daha aktif fare türü için de gerekli olabilir.
4. Masa üzerindeki silindir yerleştirin ve aşağıdaki aynada yansıması filme.
5. Bir video kamera ve tripod gereklidir. Yaklaşık silindir video 5 dakika başına 190MB yaklaşık 650KB / s Video kaydetme. Kamera silindir görüş tüm alanı kapsar emin olmak için bir yakınlaştırma işlevi olduğundan emin olun.
   NOT: Bu protokolde kullanılan video kamera standart tanımı, NTSC geçmeli videoyu kullanan bir Sony DCR-SR42, 40x optik zoom, 2,000x dijital zoom, 680kpix) olduğunu.
6. Analiz yazılımı edinin - Bir medya plvideo desteği ve oynatma hızı modülasyonu ile ayer. Bu protokolde kullanılan medya oynatıcı VLC Media Player v2.1.2 olduğunu.
7. Medya oynatıcı ve monitör çalıştırabilen bir işletim sistemine sahip bir bilgisayar edinin.
8. Videolar için elektronik depolama gereklidir. Harici bir sabit disk videoları indirin ya da uzun süreli saklama için DVD'lere kopyalayın.
   NOT: Video başına 190MB anda, 84 seans, 16 GB SD karta uyacak ve 168 seans 32GB SD karta uyacaktır. Nedeniyle, SD medya göreceli ucuzluk ve bazı fareler 20 rears tamamlamak için ihtiyaç ne kadar zaman içinde belirsizlik, 32 GB kart önerilir. Bu çalışmada, videolar 2TB harici sabit disk kameradan kopyalanan ve daha sonra yedek olarak DVD'lere recopied.

Silindir Testi 3. Deneysel Kurulum

1. Masa bir 45 derecelik açıyla aşağıdaki tabloda ayna sabitleyin. Masa ayakları bağlanmış bu kullanarak iki destek braketleri suppor için musunuzsırasıyla, aynanın alt ve üst t. Parantez yerleri tablosu (Şekil 1A) bir yan görünümü ve tablosu (Şekil 1B) bir yüzü üzerine görünümünde not edilir.
2. Masanın ortasına silindiri yerleştirin. Silindir siyah işaretleyici (Sharpie) silindir kaldırdı ve aynı pozisyona iade edilebilir ve böylece (Şekil 2) ile masaya oturur dört eşit uzaklıktaki çizgiler çizin. Şeffaf masa alt onları Çizim masa işaretleyici mürekkep eriterek olmadan hayvan testler arasında temizlenmelidir sağlar.
3. Kamera ve tripod takın. Resim silindir namlu doğrudan bakıyor böylece aynaya kamerayı yöneltin. Silindirin tam bir iç duvar tabanı (Şekil 3) ile görünür ve engelsiz olduğundan emin olun. , Kamera ve ayna ayarı göreli açısı dahil, kurulum yan görünüşe bakınız yukarıdaki (Şekil 4A) dan ve gelenFare yetiştirme (Şekil 4B) de dahil olmak üzere Tablo seviyesi.
4. Çekimlerin öncesinde her fare tanımlamak için işaret kartlarını hazırlayın. Kartlar tipik olarak, her bir fare için bir kimlik numarası, test zaman noktası (örn., 3 gün tedaviden sonra) ve film oturumu tarihini de emin olun. Deneyci kör sağlamak için işaret kartında tedavi grubunu dahil etmeyin.
5. Işığın bu seviyede gibi standart iç mekan aydınlatma koşullarında Film açıkça silindirin etrafına fare hareketlerini görmek için gereklidir.
   NOT: yeterli olabilir bir kırmızı ışık kamera ile karanlıkta filme Varsa, ancak bir ilk pençe dokunur ve Sürüyor açıkça ölçümü görebilir olup olmadığını test etmek gerekir.

4. Yürütme

1. Filme başlayın. Kamera lensinin önünde uygun fare işaret kartını görüntüler.
2. Hemen işaret kartı filme sonra açık üstten silindir içine fare indirin.
3. Fareyi filme başlayın. Fareler startled eğer keşfetmek ilgi kaybedebilir olarak, bu süre boyunca gürültüyü en aza indirir.
4. Silindir keşfetmek için fareler arka gözlemleyin. Fare yirmi rears en az gerçekleştirene kadar video yakalama.
   NOT: Her iki forepaws zeminle temas kaybetmek ve fare arka ayakları üzerinde duruyor BIR arka oluşur.
5. Dezenfekte ve fare kokuları uzaklaştırmak için her fare arasında uygun bir temizleme solüsyonu ile masanın üzerinde ve silindir silin.
6. Fareler keşfetmek durdurmak ve sessizce yaklaşık 5 dakika boyunca dört ayak üzerinde oturan kalır zaman dondurma. Yirmi rears oluşmadan önce fareler dondurmak, bu testi başlamadan önce 10-20 dakika süreyle silindirden bunları kaldırmak için gerekli olabilir. Fareler yirmi rears yapmazsanız, onlar çalışmaya kaldırılır.
   NOT: Bizim tecrübelerimize göre, fareler yüzünden silindir keşfetmek için başarısızlık hariç gereken asla.

Paw sürükleyerek kullanarak Silindir Testinin 5. DeğerlendirmeAnaliz

1. Fare silindir araştırıyor ne kadar hızlı bağlı olarak 0.25X arasında 0.67x normal hızda hızında videoyu oynatın. Yavaş oynatma hızları sunan bir medya oynatıcı kullanın.
2. Pençe dokunur toplam sayısını ölçmek. Fare rears (Şekil 5A), silindir (Şekil 5B) yan dokunduğunda Paw dokunur sonra her ikisi de aynı anda pençeleri (Şekil 5C) ve arazilerin (Şekil 5D) ile kaldırır, ortaya çıkar. pençe olabilir veya tam hurma ile silindir duvara temas olmayabilir, ama silindir duvarı ile bazı temas gerçekleşmesi gerekir. Bir arka sırasında arka bacaklarda üzerinde dururken her iki forepaws ya da silindir duvarına (ne kadar kısa) fare temas ettiği sayısını sayarak pençe dokunur değerlendirin.
   Silindir duvarı ile temasın Not sadece bir "pençe dokunuş" veya "pençe-drag" fare bir arka pozisyonda ise sayılır - ayaktamasa kapalı hem forepaws ile arka bacaklarda üzerinde. Masa üzerine arka bacaklarda ve bir forepaw hem de ücretsiz pençe ile duvara dokunmak gelirleri - - fare 3 nokta duruşu kalırsa bu pençe dokunuş olarak sayılmaz. Fareler arka olabilir ve tek bir forepaw ile silindir duvara dokunun ve bu pençe dokunuş olarak sayılır. Not: Bir fare de ikiden fazla kişi yapıyor, bir arka sırasında silindir etrafında bedenini hareket edebilir. Her sol forepaw touch için bir ve her doğru forepaw touch için tek - Bu kişiler sayımı.
3. Pençe-drags sayısını ölçmek. Paw-sürükleyerek davranışı, normal pençe dokunur farklıdır.
   1. Pençe kişileri tam açık avuç (Şekil 6B) ile silindir duvarı varsa, yavaş yavaş hafif bir titreme ile sık sık, duvardan uzağa düşecek. Hareket complet uzak düşmeden önce silindir duvara ya medial veya aşağı yönde (Şekil 6C) sürükleyerek hane ile başlayanely (Şekil 6D). Fare sonra tüm ayak (Şekil 6F) açılış öncesi etkilenmeyen pençe (Şekil 6E) ile bağlantısını kesmek olacak. Bu pençe sürükleme olarak kabul edilir ve bir taksitli olarak sayılmalıdır.
   2. Pençe tamamen açık hurma ile silindir duvara temas etmezse, silindir duvarından uzağa düşen öncesi hane ile silindir duvarını otlatmak olacaktır. Benzer şekilde, bir fare silindir duvara pençesini sürükleyip ama sökmek önce tamamen serbest olmayabilir. Bunlar hem dokunur yanı sıra pençe-sürükler ve taksitli hem olarak kabul edilmelidir kabul edilir.
   3. Bir fare silindiri araştırıyor iken pençe da silindir duvar boyunca sürükleyebilirsiniz. O (Şekil 7E) sökme önce orijinal konumuna (Şekil 7A-D) sol veya sağ araştırıyor Bu durumda, pençe farenin gövde büküm takip edecektir. Rastgele seçerek fare bağlı olarak bu, bir pençe-sürükleyin kabul edilmezbir yönde keşfetmek ve kortikal hemisfer zarar gördüğü bağlı değildir.
4. Paw-Sürüyor bir yüzdesi olarak ifade edilir bir oturum sırasında pençe dokunur toplam sayısı başına pençe-sürükler. Ayrı ayrı ön ayakları için toplam pençe rehber bir yüzdesi olarak pençe-drags sayısını ifade eder.
5. Bir pençe-drag sonuçlanan Dokunuşlar bir pençe-sürükle ve aynı zamanda bir dokunuş olarak sayılır. Fare onun pençe temas her defasında silindir duvarı pençesini sürükler Böylece, eğer pençe-sürükleyerek yüzdesi% 100 olarak ifade edilir.

6. Ek Deney Tasarımı Öneriler

1. Yabancı değişkenleri en aza indirmek için:
   1. Her test gününde aynı anda fareler test edin. Onların uyanma döngüsü sırasında fareler test edin. 12 saat ters ışık döngüsü farelerin tutulması performansı kolaylaştırır.
   2. Fareler gürültü veya yeni bir çevre yoluyla stresli ise silindir keşfetmek için isteksiz olabilir. Onların hayvan tutma oda veya bir odada fareler test onlar b vareen stresi azaltır aşina. Fare öncesinde silindir girmeden ya da alışma nedeniyle jostled olması durumunda oda, gürültülü, bu durum oluşabilir.
      NOT: Sınav bazal okuma olarak hizmet deneysel manipülasyon önce bir kez yapılmalıdır. O zaman kısa bir süre içinde silindire poz aşırı sayıda önlemek için tavsiye edilir olsa da manipülasyon sonra, test günleri, deneycinin takdirindedir.
   3. Fareler silindire 6-7 maruz kalmalarından sonra arka isteksiz olabilir. Bu çalışmada, fareler iskemiden önce ve 1, 3, 7, 14, 21 ve 28, cerrahi sonrasında yedi kez, toplam silindir içinde test edildi.
      NOT: Bu çalışmada FVBN fare suşu kullanıldı. Daha önce, bir ET-1, iskemik yaralanma sonrası silindir ve gözlenen pençe sürükleyerek davranış C57BL / 6 fareleri test ettik (veriler gösterilmemiştir). C57BL / 6 fareleri yetiştirme sırasında FVBN farelere göre daha aktif ve sık silindirin jant üzerine arttıdışarı tırmanma önce. Fareler atlayarak kaçmaya çalışırsanız uzun silindir kullanılmalıdır.

7. Endotelin-1 Cerrahi ve Enfarktüs Hacim Ölçümleri

1. Daha önce yayınlanmış protokollere ^4'e göre Endotelin-1 cerrahi ve enfarktüs hacmi ölçümleri yapın. Ön ön ayakları, motor korteks hedeflemek için, her bir fare, aşağıdaki koordinat üç ET-1 enjeksiyonu yapılır: (i) 0,7 arterior (AP) için 1,5 medial-yanal (mi) / - 1.2 dorsal-ventral (DV), ( ii) 0,4 AP / 1.25 ml / - 1.2 DV ve (iii) 0,1 AP / 1.75 ml / -1.2 DV ^4.

8. İstatistiksel Analiz

1. Varyans iki yönlü tekrarlı ölçümler analizi (ANOVA) pençe-sürükleyerek farklı zaman noktalarında karşısında etkilenen ve etkilenmeyen pençelerinin için yüzde analiz etmek önerilir.

Sonuçlar

Biz daha önce bu pençe-sürükleyerek davranış ön ayakları sensorimotor korteks fokal iskemik yaralanma takip belirir ve hasar ⁴ olumlu bir gösterge olduğunu göstermiştir. Ön ayakları sensorimotor kortekse ET-1 intra-kortikal enjeksiyonlar bir iskemik bir lezyon (Şekil 8A, B) ikna etmek için kullanıldı. Potansiyel kullanım fonksiyonel iyileşmeyi değerlendirmek için pençe-sürükleyerek davranış daha uzun 14 gün sonrası yaralanma uzatıldı olup olmadığını bu çal?...

Tartışmalar

şunlardır silindir testinde pençe-sürükleyerek davranışı ölçülmesi sırasında kilit noktaları kurmak: i) sayısını ölçmek bir temel oluşturmak için beyin hasarı önce her pençe için toplam pençe dokunur karşı pençe-sürükler; ii) iskemik yaralanma sonrası her pençe için toplam pençe dokunur karşı pençe-drags sayısını ölçmek; ve iii) pençe-sürükle ve farenin gövde yanal dönüşü sırasında silindir duvar boyunca pençe lateral hareketi arasında ayrım.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plexi-glass cylinder	N/A	N/A	17.5cm high, 9.5cm outer diameter, 8.8cm inner diameter, wall thickness 0.35cm (or 3.5 mm)
viewing table	N/A	N/A	54x56x66.5cm (width x length x height), top of table is a 51x51cm sheet of plexiglass.
mirror	N/A	N/A	34x58cm mirror
video camera	Sony	DCR-SR42	Video camera with onboard storage, SD functionality, 40x optical zoom
computer	Dell	Optiplex 760	Processor: Intel, 3.0 GHz, Memory 4.00GB (RAM)
computer monitor	Samsung	S22C350H
Excel (Microsoft Office Professional Plus)	Microsoft	v14.0.7106.5003
VLC Media Player	Video LAN	v2.1.2	Media player with playback speed modulation and video support
External Hard Drive	Western Digital	WDBAAU0020HBK-01	2 TB