Pata-Arrastando: a Novel, análise de sensibilidade do mouse cilindro de ensaio

Resumo

Análise forelimb assimetria clássico do teste do cilindro é rotineiramente utilizado para avaliar os déficits comportamentais em ratos após lesão cerebral ou acidente vascular cerebral; no entanto, isso não é possível detectar défices consistentes em ratinhos. Este estudo demonstra que a quantificação comportamento pata-arrastamento é uma análise mais sensíveis de lesão cerebral em camundongos.

Resumo

O teste do cilindro é rotineiramente utilizada para prever dano isquémico focal no córtex motor dos membros anteriores em roedores. Quando colocado no cilindro, roedores explorar de criação e de tocar as paredes do cilindro com as patas forelimb para apoio postural. Após lesão isquêmica ao membro anterior do córtex sensório-motor, os ratos confiar mais pesadamente em sua pata pata dianteira afetada pelo apoio postural, resultando em menos toques com a pata afetada que é denominado forelimb assimetria. Em contraste, dano cerebral isquémico focal no cérebro do rato não resultar em défices coerentes comparáveis ​​no membro anterior assimetria. Embora déficits membro anterior de assimetria são pouco observados, os ratos que demonstram um romance pós comportamento curso denominado "pata-arrastamento". Pata-arrastamento é a tendência para um mouse para arrastar sua pata afetada ao longo da parede do cilindro, em vez de empurrar diretamente fora da parede quando desmontar a partir de uma retaguarda para uma posição de quatro patas. Nós já demonstrou quecomportamento arrastando-pata é altamente sensível a pequenas lesões isquêmicas corticais para o córtex motor dos membros anteriores. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para análise arrastando-pata. Nós definimos que uma pata-de arrasto é e demonstrar como quantificar o comportamento de arrastar pata. O teste do cilindro é um teste simples e barato de administrar e não necessita de pré-formação ou estratégias de privação alimentar. No meio de análise arrastando-pata com o teste do cilindro, ele preenche um nicho para prever lesões isquêmicas corticais como fototrombose e endotelina-1 (ET-1) isquemia induzida - dois modelos que são sempre crescentes em popularidade e produzem lesões focais menores que a oclusão da artéria cerebral média. Finalmente, medindo o comportamento de arrastar pata no teste do cilindro vai permitir estudos de recuperação funcional após a lesão cortical usando uma ampla coorte de linhagens de camundongos transgênicos, onde a análise forelimb assimetria anterior falhou em detectar déficits consistentes.

Introdução

O objetivo das estratégias de regeneração neural é demonstrar tanto reparação tecidual e recuperação funcional. A recuperação funcional é normalmente avaliada com testes comportamentais que medem os défices funcionais, neste caso envolvendo habilidades motoras que estão associadas com danos para as regiões específicas do cérebro. Lesão cerebral traumática ou danos isquémicos para a área do membro anterior do córtex sensorimotor pode ser demonstrada por uma série de testes comportamentais. Um desses testes, o teste do cilindro é usado extensivamente em ratos para avaliar os déficits funcionais na atividade forelimb ^1. O teste tem um baixo custo de set-up exigindo apenas um cilindro, câmara e mesa com um top transparente. É fácil de administrar, uma vez que se baseia no comportamento exploratório natural de roedores, por isso, não são necessários de pré-formação e privação de alimento ou recompensas. Apesar destas inúmeras vantagens, o teste do cilindro é sub-utilizado para avaliar os déficits membros anteriores em ratos após lesões focais para o membro anterior sensorimotor córtex, o que atribuímos à análise do comportamento do mouse no teste do cilindro. Assimetria membro anterior é a medida clássica de análise para o teste do cilindro. Quando colocado no cilindro, roedores naturalmente explorar as paredes do cilindro de elevação em seus membros posteriores e tocar as paredes do cilindro com as patas forelimb para o equilíbrio postural. O número de toques da pata com a parede com cada membro anterior pode ser facilmente quantificado por filmagens roedores durante essa exploração do cilindro. Assimetria dos membros anteriores ocorre quando a pata afectada membro anterior torna menos toques com a parede do que a pata afectada e dos membros anteriores é indicativa de danos para o córtex sensorimotor contralateral. Em ratos, as injecções intra-cortical do vasoconstritor, a endotelina (ET-1), para o córtex sensorimotor membro anterior provoca uma lesão isquémica focal, que resulta em déficits comportamentais No membro contralateral. Déficits em uso forelimb contralateral são facilmente detectados como mudanças na forelimb assimetria no teste do cilindro em ratos ^1-3. Em contraste com os ratos no entanto, as mudanças no membro anterior assimetria são variáveis ​​e menos consistente em ratos após comparáveis ​​ET-1 ^4-6 injecções. Aqui demonstramos um romance análise do comportamento dos membros anteriores no teste do cilindro - análise do comportamento arrastando-pata. Mostrámos previamente que a análise do arrastando pata é uma medida mais sensível de danos no córtex sensorimotor membro anterior em ratos do que a análise dos membros anteriores assimetria clássica e, por conseguinte, é aplicável a uma variedade de modelos de lesão focal cortical.

Exame de como os contatos das patas dianteiras parede do cilindro seguinte lesão isquêmica do córtex sensório-motor forelimb revelou um novo comportamento em camundongos - pata-arrastando ^4. Uma pata-de arrastar ocorre quando um mouse está sobre as patas traseiras para explorar a parede do cilindro, em seguida, arrasta sua pata afetada (contra-lesional) ao longo da parede do cilindro para a sua linha média ou abaixo a parede enquantosua pata dianteira afetado fornece suporte postural contra a parede. Pata-arrasta raramente ocorrem em ratos lesionados, portanto, a aparência de uma pata-de arrasto é um indicador positivo de prejuízo para o membro anterior córtex sensório-motor ^4. Temos anteriormente quantificado comportamento arrastando-pata em ratos após ET-1 lesão isquêmica do córtex sensório-motor dos membros anteriores e demonstraram comportamento arrastando-pata sustentada em ratos até duas semanas pós-AVC ^4. Aqui nós mostramos que o comportamento arrastando-pata é mantida até quatro semanas pós-AVC. Análise do comportamento de arrastar pata proporciona um novo e sensível ferramenta para avaliação do dano isquêmico focal no córtex sensório-motor dos membros anteriores em ratos. Sua barato set-up, facilidade de administração e conseguir fazer esta uma ferramenta simples, mas útil para avaliar rapidamente os déficits comportamentais forelimb em camundongos.

Protocolo

Declaração de ética: Todos os experimentos foram aprovados pelo Memorial University of Comitê de Ética Animal Care de Newfoundland de acordo com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care.

1. Ratos

1. Use camundongos adultos. Neste estudo, foram utilizados ratinhos macho adulto FVBN (n = 10) entre 2-4 meses. Ratos de casa em um hr 12:12 inverter ciclo claro-escuro e fornecer ração padrão para roedores e água ad libitum.

2. Materiais necessários para o teste do cilindro

1. Obter uma mesa com um top transparente para filmar o teste do cilindro. As dimensões da tabela são irrelevantes, a parte superior deve ser plexiglass ou vidro, e deve haver espaço suficiente para posicionar um espelho abaixo da tabela. Isso permite que o rato para ser gravadas em vídeo a partir de baixo. Usar um espelho abaixo da mesa de modo a reflectir a imagem através do cilindro. Como alternativa, use uma câmera de cabeça para baixo, se disponível. As dimensões da tabela utilizadas neste protocolo são 54 x 56 x 66,5 centímetros (CxLxH) com um 51 x 51 centímetros superior (LxC).
2. Obter um espelho. As dimensões do espelho utilizados neste protocolo são 34 x 58 centímetros (LxC).
3. Obter um cilindro transparente / plexiglass para o mouse para executar. As dimensões do cilindro utilizado no presente protocolo são 17,5 centímetros de altura, 8,8 centímetros ID, OD 9,5 centímetros de espessura de parede de 0,35 centímetros. Um cilindro mais alto pode ser necessária para as estirpes mais activas do rato.
4. Coloque o cilindro sobre a mesa e filmar o reflexo no espelho abaixo.
5. Um vídeo câmera e tripé são obrigatórios. Gravar vídeos em cerca de 650kb / s, que é de aproximadamente 190MB por 5 min de vídeo cilindro. Assegure-se que a câmara tem uma funcionalidade de zoom para garantir que o cilindro abrange todo o campo de vista.
   NOTA: O vídeo câmera utilizada neste protocolo é um Sony DCR-SR42, zoom óptico de 40x, zoom digital 2,000x, 680kpix que usa a definição padrão, NTSC de vídeo entrelaçado).
6. Obter software para análise - um pl mídiaayer com suporte a vídeo e modulação velocidade de reprodução. O reprodutor de mídia utilizada neste protocolo é a v2.1.2 VLC Media Player.
7. Obter um computador com um sistema operacional capaz de executar o media player e um monitor.
8. Armazenamento eletrônico para vídeos é necessário. Baixe vídeos para um disco rígido externo ou copiá-lo para DVDs para o armazenamento de longo prazo.
   NOTA: No 190MB por vídeo, 84 sessões irão caber em um cartão SD GB 16 e 168 sessões irão caber em um cartão SD de 32 GB. Devido à inexpensiveness relativa de meios SD e a incerteza quanto tempo em alguns ratos exigem para completar as partes traseiras 20, recomenda-se uma placa de 32 GB. No estudo atual, os vídeos foram copiadas da câmera para um disco rígido externo de 2TB e, em seguida, novamente copiados em DVDs como backup.

3. Configuração experimental do teste do cilindro

1. Apertem espelho abaixo da tabela em um ângulo de 45 graus para a mesa. Faça isso usando dois suportes de apoio ligados às pernas de mesa para support a parte superior e na parte inferior do espelho, respectivamente. Locais de suporte são anotados em uma vista lateral da mesa (Figura 1A) e uma vista de face-a da mesa (Figura 1B).
2. Colocar cilindro no centro da mesa. Desenhar quatro linhas equidistantes onde o cilindro senta-se na mesa com um marcador preto (Sharpe), de modo que o cilindro pode ser levantado e devolvido para a mesma posição (Figura 2). Desenhando-los no lado inferior do tampo da mesa transparente permite que o tampo da mesa para ser limpos entre testes em animais sem dissolver o marcador de tinta.
3. Fixe a câmara e tripé. Aponte a câmera para o espelho para que a imagem está olhando diretamente através do barril do cilindro. Assegure-se que o total da parede interna do cilindro é visível e desobstruída por a base (Figura 3). Ver uma vista de lado-a da configuração, incluindo o ângulo relativo da configuração da câmara e do espelho, de cima (Figura 4A) e a partir danível da mesa, incluindo uma criação de ratinho (Figura 4B).
4. Prepare placas de sinalização para identificar cada rato antes das filmagens. Certifique-se de que os cartões tipicamente incluem um número de identificação para cada rato, o ponto de tempo do ensaio (por exemplo., 3 ​​dias após o tratamento) e a data da sessão de filmagens. Não inclua o grupo de tratamento na placa de sinalização para garantir o experimentador é cego.
5. Filme em condições de iluminação interior padrão como este nível de luz é necessário para ver claramente os movimentos do mouse ao redor do cilindro.
   NOTA: Se estiver disponível a filmar no escuro com uma câmera de luz vermelha pode ser suficiente, no entanto, uma precisaria primeiro testar se a toques da pata e arrastos são claramente visíveis para a quantificação.

4. Execução

1. Começar a filmar. Mostrar a placa de sinalização do mouse apropriado na frente da lente da câmera.
2. Abaixe o mouse para dentro do cilindro de cima aberta imediatamente depois de filmar a placa de sinalização.
3. Começar a filmar o mouse. Minimizar o ruído durante este tempo, como os ratos podem perder o interesse em explorar se assustou.
4. Observe a traseira ratos para explorar o cilindro. Capturar o vídeo até que o mouse executa um mínimo de vinte partes traseiras.
   NOTA: A parte traseira ocorre quando ambas as patas dianteiras perdem o contato com o chão eo mouse está sobre as patas traseiras.
5. Limpe tabletop e cilindro com uma solução de limpeza adequada entre cada rato para desinfetar e remover odores do mouse.
6. O congelamento é quando os ratos parar de explorar e manter-se em silêncio sentado em todos os fours por aproximadamente 5 min. Se os ratos congelar antes de ocorrer vinte partes traseiras, pode ser necessário eliminá-los a partir do cilindro durante 10-20 minutos, antes de retomar o teste. Se os ratos não realizar vinte partes traseiras, eles são removidos do estudo.
   NOTA: Em nossa experiência, os ratos nunca precisou ser excluído devido a uma falha de explorar o cilindro.

5. Avaliação do teste do cilindro usando Pata-ArrastandoAnálise

1. Reproduzir o vídeo a uma taxa de entre 0,25x e 0.67x velocidade normal dependendo da rapidez com o mouse explora o cilindro. Use um player de mídia que oferece velocidades de reprodução mais lentas.
2. Quantificar o número total de toques da pata. Toques pata ocorrer quando as partes traseiras de rato (Figura 5A), toca o lado do cilindro (Figura 5B), subsequentemente desmonta com ambas as patas simultaneamente (Figura 5C) e terras (Figura 5D). A pata pode ou não entre em contato com a parede do cilindro com uma mão cheia, mas algum contacto com a parede do cilindro tem de ocorrer. Avaliar toques pata pela contagem do número de vezes que o rato faz contato (não importa o quão breve) com a parede do cilindro com uma ou ambas as patas dianteiras ao estar em seus membros posteriores durante uma traseira.
   Note-se que o contacto com a parede do cilindro só é contado como uma "pata toque" ou "pata-arrastar" se o mouse está em uma posição traseira - em péem seus membros traseiros com ambas as patas dianteiras fora da mesa. Se o mouse permanece em uma posição de 3 pontos - ambos os membros posteriores e uma pata dianteira sobre a mesa e começa a tocar a parede com a pata livre - este não é contado como um toque da pata. Ratos podem traseira e tocar a parede do cilindro com uma única pata dianteira e isso é contado como um toque da pata. Nota: um rato pode também mover seu corpo em torno do cilindro durante uma traseira, tornando mais de dois contatos. Estes contactos são computados - um para cada pata dianteira esquerda toque e um para cada toque pata dianteira direita.
3. Quantificar o número de pata-drags. Comportamento arrastando-Paw é distinto de toques normais da pata.
   1. Se os contatos da pata parede do cilindro com uma palma aberta completo (Figura 6B), ele vai lentamente cair para longe da parede, muitas vezes com um ligeiro tremor. O movimento começa com os dígitos arrastando contra a parede do cilindro ou em uma direção medial ou para baixo, (Figura 6C) antes de cair afastado completely (Figura 6D). O rato irá então desmontar com sua pata afetada (Figura 6E) antes de aterrar em todos os fours (Figura 6F). Esta é considerada uma pata-de arrastar e deve ser contada em um registro.
   2. Se a pata não entre em contato com a parede do cilindro com uma palma totalmente aberto, ele vai pastar parede do cilindro com seus dígitos antes de cair distante da parede do cilindro. Da mesma forma, um mouse pode arrastar sua pata contra a parede do cilindro, mas não liberá-lo completamente antes de desmontar. Estes são ambos considerados pata-arrasta, bem como toques e deve ser contado como dois em um registro.
   3. A pata também pode arrastar ao longo da parede do cilindro, enquanto um rato explora o cilindro. Neste caso, a pata seguirá a torção do tronco do rato uma vez que explora esquerda ou para a direita da sua posição original (Figura 7A-D) antes de desmontar (Figura 7E). Isto não é considerado uma pata-de arrasto, uma vez que depende o mouse escolhendo aleatoriamentenuma direcção para explorar e não depende de qual hemisfério cortical foi danificado.
4. Pata-arrasta são expressos como uma percentagem da pata-arrasta por número total de toques da pata durante uma sessão. Expresse o número de pata-drags como uma porcentagem do total de contatos pata para cada membro anterior separadamente.
5. Toques, resultando em uma pata-de arrastar contam como uma pata-de arrasto e um toque simultaneamente. Assim, se um rato arrasta sua pata cada tempo os seus contactos pata parede do cilindro, a percentagem arrastando-pata é expressa como 100%.

6. adicionais Sugestões delineamento experimental

1. Para minimizar variáveis ​​externas:
   1. Teste a ratinhos, ao mesmo tempo em cada dia de teste. Teste os ratos durante seu ciclo vigília. Mantendo ratos num ciclo de 12 hr luz reversa facilita o desempenho.
   2. Ratos podem estar relutantes em explorar o cilindro se destacou tanto pelo ruído ou um ambiente de romance. Testando ratos em seu animal sala de espera ou um quarto que têm been familiarizado com reduz o estresse. Isso pode ocorrer se o quarto é barulhento, se o mouse foi empurrado antes de entrar no cilindro ou devido a habituação.
      NOTA: O teste deve ser realizado uma vez antes da manipulação experimental para servir como uma leitura da linha de base. Após manipulação, dias de teste são a critério do experimentador, embora seja aconselhada a evitar um número excessivo de exposições ao cilindro durante um curto período de tempo.
   3. Ratos podem tornar-se relutantes em parte traseira após 6-7 exposições ao cilindro. Para o presente estudo, os ratinhos foram testados no cilindro para um total de sete vezes, antes de isquemia e nos dias 1, 3, 7, 14, 21 e 28 pós-cirurgia.
      NOTA: Neste estudo foi utilizada a estirpe FVBN mouse. Nós já testado ratinhos C57BL / 6 no cilindro e comportamento-arrastando pata observados após uma lesão isquémica ET-1 (dados não mostrados). Ratinhos C57BL / 6 foram mais activos do que os ratos FVBN quando criada e frequentemente saltou para o aro do cilindroantes de subir para fora. Cilindros mais altos devem ser usados ​​se camundongos tenta fugir pulando.

7. A endotelina-1 Cirurgia e Enfarte Desconto Medições

1. Executar A endotelina-1 a cirurgia e as medições de volume de enfarte de acordo com protocolos anteriormente publicados ^4. Para atingir o córtex motor dos membros anteriores anterior, cada rato deve receber três injecções de ET-1 com os seguintes coordenadas: (i) 0,7 ântero-posterior (AP) /1.5 medial-lateral (ml) / - 1,2 dorsal-ventral (DV), ( ii) 0,4 AP / 1,25 ml / - 1,2 DV e (iii) 0,1 AP / 1,75 ml / -1.2 DV ^4.

8. Análise Estatística

1. Uma análise de duas vias para medidas repetidas de variância (ANOVA), é recomendado para analisar a percentagem de para as patas afectadas e não afectadas em diferentes pontos de tempo-arrastando pata.

Resultados

Temos anteriormente demonstrado que o comportamento arrastando-pata aparece após uma lesão isquêmica focal para o córtex sensório-motor dos membros anteriores e é um indicador positivo de danos ^4. Injecções intra-corticais de ET-1 para o córtex sensorimotor membro anterior foram usadas para induzir lesão isquémica (Figura 8A, B). Este estudo examinou se o comportamento arrastando-pata prorrogado por mais de 14 dias pós-lesão para a sua utilização potencial para avaliar a recupe...

Discussão

Os pontos-chave para estabelecer ao quantificar o comportamento de arrastar pata no teste do cilindro são os seguintes: i) quantificar o número de pata-arrasta contra totais toques pata para cada pata antes da lesão cerebral para estabelecer uma linha de base; ii) quantificar o número de pata-drags contra totais toques pata para cada pata após a lesão isquêmica; e iii) discriminar entre uma pata-de arrastar e o movimento lateral da pata ao longo da parede do cilindro durante a rotação lateral do tronco do mouse...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plexi-glass cylinder			17.5 cm high, 9.5 cm outer diameter, 8.8 cm inner diameter, wall thickness 0.35 cm (or 3.5 mm)
viewing table			54x56x66.5 cm (width x length x height), top of table is a 51x51 cm sheet of plexiglass.
mirror			34x58 cm mirror
video camera	Sony	DCR-SR42	Video camera with onboard storage, SD functionality, 40x optical zoom
computer	Dell	Optiplex 760	Processor: Intel, 3.0 GHz, Memory 4.00GB (RAM)
computer monitor	Samsung	S22C350H
Excel (Microsoft Office Professional Plus)	Microsoft	v14.0.7106.5003
VLC Media Player	Video LAN	v2.1.2	Media player with playback speed modulation and video support
External Hard Drive	Western Digital	WDBAAU0020HBK-01	2 TB