Paw-Ziehen: a Novel, sensitive Analyse des Maus-Zylinder-Test

Zusammenfassung

Klassische forelimb Asymmetrie Analyse des Zylindertest wird routinemäßig verwendet, um Verhaltensdefizite in Ratten nach Hirnverletzung oder Schlaganfall zu bewerten; jedoch fehlt es an konsistenten Defizite in Mäusen zu erkennen. Diese Studie zeigt, dass die Quantifizierung paw-Ziehen Verhalten ist ein empfindlicher Analyse der Hirnverletzung bei Mäusen.

Zusammenfassung

Der Zylinder-Test wird routinemäßig zur fokalen ischämischen Schäden an der Vordergliedmaße motorischen Kortex bei Nagern vorherzusagen. Wenn in dem Zylinder angeordnet, Nager erkunden von Aufzucht und berühren die Wände des Zylinders mit ihren Vorderbein Pfoten für Haltungsunterstützung. Nach ischämische Schädigung der Vordergliedmaße sensomotorischen Kortex, verlassen Ratten stärker auf ihre unberührt forelimb Pfote für Haltungsunterstützung was zu weniger Berührungen mit ihren betroffenen Pfote, die Vordergliedmaße Asymmetrie bezeichnet wird. Demgegenüber fokalen ischämischen Schädigung des Gehirns der Maus irgendwie in vergleichbaren konsistent Defizite forelimb Asymmetrie führen. Während forelimb Asymmetrie Defizite sind selten beobachtet, weiß Mäuse zeigen ein neuartiges Verhalten nach Schlaganfall als "Tatze-Ziehen". Paw-Ziehen ist die Tendenz für eine Maus, seine betroffenen Pfote entlang der Zylinderwand und nicht direkt zu drücken von der Wand bei der Demontage von einem hinteren zu einem vierbeinigen Haltung ziehen. Wir haben zuvor gezeigt, dasspaw-Ziehen Verhalten ist sehr empfindlich auf kleine kortikale ischämische Verletzungen an der Vordergliedmaße motorischen Kortex. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für paw-Ziehen-Analyse. Wir definieren, was eine Pfote ziehen ist und zeigen, wie man paw-Ziehen Verhalten quantifizieren. Der Zylinder-Test ist ein einfaches und kostengünstiges Test zu verwalten und nicht vor dem Training oder Nahrungsentzug Strategien erfordern. Bei der Verwendung von paw-Ziehen-Analyse mit dem Zylinder-Test, füllt es eine Nische für die Vorhersage von kortikalen ischämische Verletzungen wie photothrombosis und Endothelin-1 (ET-1) induzierte Ischämie - zwei Modelle, die immer größer werden immer beliebter und produzieren kleinere Brenn Verletzungen als mittleren Hirnarterie Okklusion. Schließlich messen paw-Ziehen Verhalten im Zylindertest Studien der funktionellen Erholung nach kortikalen Verletzung mit einer breiten Gruppe von transgenen Mausstämmen, wo frühere forelimb Asymmetrie-Analyse hat es versäumt, im Einklang Defizite erkennen lassen.

Einleitung

Das Ziel der neuronalen Regenerationsstrategien ist es, sowohl die Reparatur von Gewebe und funktionelle Wiederherstellung zu demonstrieren. Funktionelle Wiederherstellung wird typischerweise mit Verhaltenstests, die funktionelle Defizite zu messen, in diesem Fall, der motorischen Fähigkeiten, die mit einer Schädigung des spezifischen Hirnregionen zugeordnet sind, ausgewertet. Traumatischer Hirnverletzung oder ischämische Schädigung sensomotorischen forelimb Bereich des Cortex kann durch eine Reihe von Verhaltenstests demonstriert werden. Ein solcher Test ist der Zylinder-Test ausgiebig an Ratten verwendet, um funktionelle Defizite in forelimb Aktivität ¹ zu bewerten. Der Test hat eine geringe Einrichtungskosten nur einen Zylinder, Kamera und Tisch mit einer transparenten Deck erfordern. Es ist einfach zu verwalten, wie sie auf der natürlichen Erkundungsverhalten von Nagern basiert, so dass vor dem Training und Nahrungsentzug oder Belohnungen sind nicht erforderlich. Trotz dieser zahlreichen Vorteile wird der Zylindertest nicht ausreichend genutzt, um forelimb Defizite bei Mäusen beurteilt folgenden Schwer Verletzungen des forelimb sensorimotor Kortex, was wir auf die Analyse von Mausverhalten im Zylindertest. Vorderbein Asymmetrie ist das klassische Maß der Analyse für den Zylinder-Test. Wenn in dem Zylinder angeordnet, Nagetiere natürlich erkunden Sie die Wände des Zylinders durch die Aufzucht auf ihre Hinterbeine und die Berührung der Zylinderwände mit ihren Vorderbein Pfoten für Haltungsgleichgewicht. Die Anzahl der Pfote berührt mit der Wand mit jedem Vorderbein ist leicht durch die Dreharbeiten Nagetiere während dieser Explorations des Zylinders quantifiziert. Vorderbein Asymmetrie tritt auf, wenn der betroffene forelimb paw macht weniger Berührungen mit der Wand als die unberührt forelimb Pfote und ist ein Hinweis auf eine Beschädigung des kontralateralen sensomotorischen Kortex. Bei Ratten, intra-kortikalen Injektionen des vasokonstriktorischen Mittel, Endothelin (ET-1), in das Vorderbein sensomotorischen Kortex verursacht einen fokalen ischämischen Läsion, die in Verhaltensdefizite in der kontralateralen Vorderbein führt. Defizite in der kontralateralen Vorderbein Verwendung leicht Veränderungen in f erkanntorelimb Asymmetrie in der Zylindertest bei Ratten ^1-3. Im Gegensatz zu Ratten sind jedoch Änderungen in forelimb Asymmetrie variabel und weniger konsequent in Mäusen nach vergleichbaren ET-1-Injektionen ^4-6. Hier zeigen wir eine neue Analyse der Vordergliedmaße Verhalten im Zylindertest - Analyse der Tatze-Ziehen Verhalten. Wir haben zuvor gezeigt, dass Pfoten verschieben Analyse ist ein empfindlicheres Maß der Beschädigung der Vordergliedmaßen sensomotorischen Cortex von Mäusen als die klassische forelimb Asymmetrie Analyse und ist daher für eine Vielzahl von fokalen kortikalen Verletzung Modellen.

Zu prüfen, wie die Vorderpfote Kontakte der Zylinderwand nach ischämischer Schäden an der Vordergliedmaße sensomotorischen Kortex ergab eine neuartige Verhalten bei Mäusen - paw-Ziehen ^4. Eine Pfote ziehen tritt auf, wenn eine Maus steht auf seinen Hinterbeinen, die Zylinderwand zu erkunden dann schleppt seine betroffenen (Kontra läsionaler) paw entlang der Zylinderwand in Richtung seiner Mittellinie oder auf der Wand, währendseine Vorderpfote unberührt bietet Haltungsunterstützung gegen die Wand. Paw-schleppt selten in unverletzten Mäusen treten daher das Auftreten einer Pfote ziehen ist ein positiver Indikator der Schädigung des forelimb sensomotorischen Kortex ^4. Wir haben vorher quantifiziert paw-Ziehen Verhalten bei Mäusen nach ET-1 ischämische Schädigung des forelimb sensomotorischen Kortex und haben nachhaltig paw-Ziehen Verhalten bei Mäusen bis zu zwei Wochen nach Schlaganfall. ⁴ gezeigt Hier zeigen wir, dass paw-Ziehen Verhalten wird bis zu vier Wochen nach Schlaganfall erlitten. Analyse von paw-Ziehen Verhalten stellt eine neuartige und empfindliche Instrument zur Bewertung fokalen ischämischen Schäden am Vorderbein sensomotorischen Kortex bei Mäusen. Seine preiswerten Aufbau, einfache Verwaltung und Scoring machen dies zu einem einfachen, aber nützliches Werkzeug, um schnell beurteilen forelimb Verhaltensdefizite in Mäusen.

Protokoll

Ethics Statement: Alle Experimente wurden von Memorial University of Animal Care Ethikkommission Neufundlands nach den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care genehmigt.

1. Mäuse

1. Verwenden erwachsenen Mäusen. In dieser Untersuchung wurden erwachsene männliche FVBN Mäusen (n = 10), die zwischen 2-4 Monaten verwendet. Hausmäuse auf einem 12:12 h Rückwärts Hell-Dunkel-Zyklus und bieten Standard-Nagetierfutter und Wasser ad libitum.

2. Materialien für die Zylindertest erforderlich

1. Besorgen Sie sich eine Tabelle mit einer transparenten top, um den Zylinder Testfilm. Die Abmessungen der Tabelle sind irrelevant, die Besten müssen Plexiglas oder Glas sein, und es muss genug Platz, um einen Spiegel unterhalb der Tabelle zu positionieren. Dies ermöglicht die Maus, um von unten gefilmt werden. Verwenden Sie einen Spiegel unterhalb der Tabelle, um das Bild durch den Zylinder zu reflektieren. Alternativ verwenden Sie eine Upside-Down-Kamera, sofern verfügbar. Die Abmessungen der Tabelle in diesem Protokoll verwendet werden 54 x 56 x 66,5 cm (BxTxH) mit einer 51 x 51 cm nach oben (B x L).
2. Besorgen Sie sich einen Spiegel. Die Abmessungen des Spiegels in diesem Protokoll verwendet werden, sind 34 x 58 cm (B x L).
3. Besorgen Sie sich eine transparente / Plexiglaszylinder für die Maus, um in durchzuführen. Die Abmessungen des Zylinders in diesem Protokoll verwendet werden, sind 17,5 cm hoch, 8,8 cm ID, 9,5 cm OD mit einer Wandstärke von 0.35cm. A größer Zylinder kann für mehr aktive Mausstämmen erforderlich.
4. Setzen Sie den Zylinder auf der Tischplatte und filmen die Reflexion im Spiegel unten.
5. Eine Videokamera und Stativ sind erforderlich. Nehmen Sie Videos auf etwa 650KB / s, was etwa 190 MB pro 5 min von Zylinder Video. Sicherzustellen, dass die Kamera eine Zoom-Funktion, um sicherzustellen, dass der Zylinder umfasst das gesamte Gesichtsfeld.
   HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Videokamera ist eine Sony DCR-SR42, 40x optischer Zoom, 2,000x Digitalzoom, 680kpix die Standard-Definition, NTSC Interlaced-Video verwendet).
6. Software zur Analyse zu erhalten - eine Medien player mit Video-Unterstützung und die Wiedergabegeschwindigkeit-Modulation. Der Media-Player in diesem Protokoll verwendet ist der VLC Media Player v2.1.2.
7. Besorgen Sie sich einen Computer mit einem Betriebssystem lauffähig den Media Player und einen Monitor.
8. Elektronischen Speicher für Videos benötigt. Laden Sie Videos auf eine externe Festplatte oder kopieren Sie sie auf DVDs für langfristige Lagerung.
   HINWEIS: Bei 190 MB pro Video, werden 84 Sitzungen auf einem 16 GB SD-Karte passen und 168 Sitzungen werden auf einer 32 GB SD-Karte passen. Aufgrund der relativen Billigkeit von SD-Medien, und der Unsicherheit in wie viel Zeit benötigen, um einige Mäuse 20 Hinterreifen zu vervollständigen, wird eine 32-GB-Karte empfohlen. In der aktuellen Studie wurden die Videos von der Kamera auf einen 2 TB externe Festplatte kopiert und dann auf DVDs als Backup erneut kopiert.

3. Experimenteller Aufbau der Zylinder-Test

1. Befestigen Spiegel unterhalb des Tisches in einem 45 Grad-Winkel zu der Tischplatte. Tun Sie dies mit Hilfe von zwei Halterungen an den Tischbeinen befestigt, um support die Oberseite und Unterseite des Spiegels sind. Halterung Standorte sind in einer Seitenansicht des Tisches (1A) und ein Gesichts auf Ansicht des Tisches (1B) angegeben ist.
2. Platzieren Zylinder auf der Mitte des Tisches. Zeichnen vier äquidistante Linien, wo der Zylinder sitzt auf dem Tisch mit einem schwarzen Filzstift (Sharpie), so dass der Zylinder angehoben und wieder in derselben Position (Abbildung 2). Ziehen derselben auf der Unterseite der transparenten Platte ermöglicht die Tischplatte zwischen Tierversuchen ohne Auflösen der Markertinte zu reinigen.
3. Befestigen Sie die Kamera und Stativ. Die Kamera auf den Spiegel, so daß das Bild direkt durch das Gehäuse des Zylinders suchen. Sicherzustellen, dass der ganze innere Wand des Zylinders sichtbar ist und unbehindert durch den Boden (Figur 3). Sehen eine Seitenansicht auf der Setup, einschließlich der relativen Winkel der Kamera und Spiegelaufbau von oben (Figur 4A) und dasPegel der Tabelle, einschließlich einer Maus Aufzucht (4B).
4. Bereiten Cue Cards, jede Maus vor den Dreharbeiten zu identifizieren. Stellen Sie sicher, dass die Karten enthalten in der Regel eine Identifikationsnummer für jede Maus, die Zeitpunkt des Tests (z. B. 3 Tage nach der Behandlung) und das Datum der Dreharbeiten Sitzung. Sie die Behandlung Gruppe auf der Cue-Karte nicht enthalten, um sicherzustellen, der Experimentator wird geblendet.
5. Film in Standard-Innenbeleuchtung Bedingungen, wie dieser Ebene von Licht benötigt, um die Mausbewegungen um den Zylinder klar zu sehen.
   HINWEIS: Wenn die Dreharbeiten zur Verfügung in der Dunkelheit mit einer Rotlichtkamera genügen jedoch einer ersten müssten, um zu testen, ob Pfote berührt und zieht deutlich zur Quantifizierung sichtbar.

4. Ausführung

1. Dreharbeiten beginnen. Zeigen Sie den entsprechenden Maus Cue Karte vor Kameralinse.
2. Senken Sie die Maus in den Zylinder von der offenen Oberseite unmittelbar nach Dreharbeiten für den Cue-Karte.
3. Beginnen die Dreharbeiten mit der Maus. Minimieren Sie Rauschen während dieser Zeit, wie Mäuse können Interesse an der Erforschung, wenn aufgeschreckt zu verlieren.
4. Beachten Sie die Mäuse hinten, um den Zylinder zu erkunden. Nehmen Sie das Video, bis die Maus führt eine mindestens zwanzig bäumt.
   HINWEIS: Eine Rück tritt auf, wenn beide Vorderpfoten zu verlieren Kontakt mit dem Boden und die Maus steht auf den Hinterbeinen.
5. Wischen Tischplatte und Zylinder mit einem geeigneten Reinigungslösung zwischen jeder Maus zu desinfizieren und zu entfernen Maus Düften.
6. Das Einfrieren ist, wenn Mäuse stoppen Erforschung und bleiben ruhig auf allen Vieren sitzen für ca. 5 min. Wenn Mäuse einfrieren vor zwanzig rears auftreten, kann es erforderlich sein, um sie aus dem Zylinder zu entfernen für 10-20 min vor der Wiederaufnahme des Tests. Wenn Mäuse nicht zwanzig Rückseiten durchzuführen, die sie von der Studie entfernt.
   HINWEIS: Nach unserer Erfahrung Mäusen noch nie benötigt, um auszuschließen, wegen des Ausfalls, den Zylinder zu erkunden.

5. Bewertung des Zylinder-Test unter Verwendung von Paw schleppAnalyse

1. Spielen Sie den Video mit einer Rate von zwischen 0,25x und 0.67x normaler Geschwindigkeit je nachdem, wie schnell die Maus untersucht die Zylinder. Verwenden Sie einen Media-Player, die langsamer Wiedergabegeschwindigkeiten bietet.
2. Quantifizierung der Gesamtzahl der Pfote berührt. Pfote Berührungen auftreten, wenn die Rückseiten der Maus (5A), berührt die Seite des Zylinders (5B), danach steigt ab mit beiden Pfoten gleichzeitig (5C) und Stegen (Figur 5D). Die Pfote kann oder kann nicht mit einem vollen Handfläche an die Zylinderwand, aber einige Kontakt mit der Zylinderwand auftreten müssen. Beurteilen Pfote berührt durch Zählen der Anzahl von Malen, die Maus berührt (egal wie kurze) mit der Zylinderwand mit einer oder beiden Vorderpfoten, während man auf seine Hinterbeine bei einem Heck.
   Beachten Sie, dass der Kontakt mit der Zylinderwand wird nur als "paw touch" oder "Pfote ziehen", wenn sich der Mauszeiger in eine hintere Position gezählt - stehendauf seine Hinterbeine mit beiden Vorderpfoten aus der Tischplatte. Wenn die Maus bleibt in einem 3-Punkt-Haltung - beide Hinterbeine und eine Vorderpfote auf der Tischplatte und geht, um die Wand mit dem kostenlosen Pfote berühren - ist dies nicht als eine Pfote berühren gezählt. Mäuse können hinten und berühren Sie die Zylinderwand mit einem einzigen Vorderpfote und dies wird als einer Pfote berühren gezählt. Hinweis: eine Maus kann auch seinen Körper um den Zylinder zu bewegen während einer hinten, so dass mehr als zwei Kontakte. Diese Kontakte werden gezählt - eine für jede linke Vorderpfote Note und eine für jede rechte Vorderpfote touch.
3. Quantifizierung der Anzahl von paw-Drags. Paw-Ziehen Verhalten unterscheidet sich von normalen Pfote berührt.
   1. Wenn der Pfote berührt die Zylinderwand mit einem vollen Handfläche (6B), wird es langsam zu fallen von der Wand weg, oft mit einem leichten Zittern. Die Bewegung beginnt mit den Ziffern Ziehen gegen die Zylinderwand entweder in einer medialen oder Abwärtsrichtung (6C), bevor der Abfall completEly (6D). Die Maus wird dann demontieren mit seiner Pfote unberührt (6E) vor der Landung auf allen Vieren (6F). Dies wird als eine Pfote ziehen und sollte in einer Strichliste angerechnet werden.
   2. Wenn die Pfote nicht mit einer vollständig offenen Handfläche an die Zylinderwand, wird die Zylinderwand mit seinen Ziffern vor dem Fallen weg von der Zylinderwand grasen. In ähnlicher Weise kann eine Maus ihre Pfote gegen die Zylinderwand ziehen, aber nicht loslassen vollständig vor der Demontage. Diese werden sowohl als Pfoten schleppt sowie Berührungen und sollte als beide in einer Strichliste angerechnet werden.
   3. Die Pfote können auch entlang der Zylinderwand ziehen, während eine Maus untersucht die Zylinder. In diesem Fall wird die Pfote die Verdrehung der Maus Torso folgen, wie es links oder rechts von seiner ursprünglichen Position (7A-D) untersucht vor der Demontage (7E). Dies wird nicht als eine Pfote ziehen, da sie abhängig von der Maus nach dem Zufallsprinzip wähleneine Richtung zu erkunden und nicht davon abhängen, welche kortikalen Hemisphäre beschädigt.
4. Paw-schleppt werden als Prozentsatz von ausgedrückt paw-schleppt per Gesamtzahl der Pfote berührt während einer Sitzung. Express die Anzahl der Tatze-Drags als Prozentsatz der gesamten Pfote Kontakte für jedes Vorderbein getrennt.
5. Touches was zu einer Pfote ziehen als Pfote ziehen und einen Hauch gleichzeitig zu zählen. Wenn also eine Maus schleppt seine Tatze jedesmal die Pfote berührt die Zylinderwand, die Pfote-Ziehen Prozentsatz wird als 100% ausgedrückt.

6. Zusätzliche Experimentelles Design Suggestions

1. Um Störvariablen zu minimieren:
   1. Testen Sie die Maus zur gleichen Zeit an jedem Testtag. Testen Sie die Mäuse während der Wach-Zyklus. Keeping Mäuse auf einer 12 Stunden umgekehrter Lichtzyklus erleichtert Leistung.
   2. Mäuse nur ungern, um den Zylinder, wenn entweder durch Rauschen oder einer neuen Umgebung gestresst zu erkunden. Testen Mäuse in ihren Tierhaltezimmer oder ein Zimmer sie b habeneen vertraut mit reduziert Stress. Dies kann auftreten, wenn der Raum ist laut, wenn die Maus vor dem Eintritt in den Zylinder oder durch Gewöhnung angerempelt worden.
      Hinweis: Der Test sollte einmal experimentelle Manipulation durchgeführt werden, um als Grundlage dienen Lesung. Nach der Manipulation, sind Testtage im Ermessen des Experimentators, obwohl es ratsam, eine übermäßige Anzahl von Forderungen an den Zylinder über einen kurzen Zeitraum zu vermeiden.
   3. Mäuse können sich nur ungern hinten nach 6-7 Forderungen an den Zylinder. Für die vorliegende Studie wurden die Mäuse in den Zylinder für insgesamt sieben Mal, vor der Ischämie und an den Tagen 1, 3, 7, 14, 21 und 28 nach der Operation getestet.
      HINWEIS: In dieser Studie verwendeten wir die FVBN Mausstamm. Wir haben zuvor getestet C57BL / 6-Mäuse im Zylinder und beobachteten Pfoten verschieben Verhalten nach einer ET-1-ischämische Verletzung (Daten nicht gezeigt). C57BL / 6-Mäuse waren aktiver als FVBN Mäusen der Aufzucht und häufig sprang auf dem Rand des Zylindervor dem Aufstieg aus. Taller Zylinder sollte verwendet werden, wenn Mäuse versuchen, durch einen Sprung zu entgehen.

7. Endothelin-1 Chirurgie und Infarktvolumen Maße

1. Führen Endothelin-1-Chirurgie und Infarktvolumen Messungen nach früher veröffentlichten Protokolle ^4. Um den vorderen forelimb motorischen Kortex Ziel sollte jeder Maus drei ET-1-Injektionen an den folgenden Koordinaten zu erhalten: (i) 0,7 anteriorposterior (AP) /1.5 medial-lateralen (ml) / - 1,2 dorsal-ventral (DV), ( ii) +0.4 AP / 1,25 ml / - 1,2 DV und (iii) 0,1 AP / 1,75 ml / -1.2 DV ^4.

8. Statistische Analyse

1. Ein Zwei-Wege wiederholten Messungen Varianzanalyse (ANOVA) wird empfohlen, die Prozent der Tatze-Ziehen für die betroffenen und nicht betroffenen Pfoten über verschiedene Zeitpunkte zu analysieren.

Ergebnisse

Wir haben bereits gezeigt, dass paw-Ziehen Verhalten erscheint nach einer fokalen ischämischen Schädigung der Vordergliedmaße sensomotorischen Kortex und ist ein positiver Indikator für Schäden ^4. Intra-kortikalen Injektionen von ET-1 in den forelimb sensomotorischen Cortex wurden verwendet, um einen ischämischen Läsion (8A, B) zu induzieren. Diese Studie untersucht, ob paw-Ziehen Verhalten erweitert für mehr als 14 Tage nach der Verletzung für seine mögliche Verwendung zur funktion...

Diskussion

Die wichtigsten Punkte bei der Quantifizierung paw-Ziehen Verhalten im Zylindertest sind die folgenden, um festzustellen: i) zu quantifizieren, die Anzahl der Pfoten zieht gegen die Gesamt Pfote berührt für jede Pfote vor Hirnverletzung, um eine Basis zu schaffen; ii) zu quantifizieren, die Anzahl der Tatze-Drags gegen insgesamt Pfote berührt für jede Pfote nach der ischämischen Verletzung; und iii) zu unterscheiden zwischen einer Pfote ziehen und die seitliche Bewegung der Pfote an der Zylinderwand während der se...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plexi-glass cylinder	N/A	N/A	17.5cm high, 9.5cm outer diameter, 8.8cm inner diameter, wall thickness 0.35cm (or 3.5 mm)
viewing table	N/A	N/A	54x56x66.5cm (width x length x height), top of table is a 51x51cm sheet of plexiglass.
mirror	N/A	N/A	34x58cm mirror
video camera	Sony	DCR-SR42	Video camera with onboard storage, SD functionality, 40x optical zoom
computer	Dell	Optiplex 760	Processor: Intel, 3.0 GHz, Memory 4.00GB (RAM)
computer monitor	Samsung	S22C350H
Excel (Microsoft Office Professional Plus)	Microsoft	v14.0.7106.5003
VLC Media Player	Video LAN	v2.1.2	Media player with playback speed modulation and video support
External Hard Drive	Western Digital	WDBAAU0020HBK-01	2 TB