الكشف عن الأمراض المرتبطة α-synuclein التي كتبها المحسن ELISA في دماغ الفئران المعدلة وراثيا Overexpressing A53T الإنسان تحور α-synuclein

Summary

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated α-synuclein (αS^D) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated αS form or the C-terminal part of the protein.

Abstract

بالإضافة إلى أساليب راسخة مثل لطخة غربية، وهناك حاجة إلى أساليب جديدة بسرعة وسهولة لتحديد الأمراض المرتبطة α-synuclein (αS ^D) في نماذج تجريبية من synucleopathies. خط الماوس المعدلة وراثيا (M83) الإفراط في التعبير عن αS A53T البشرية وعفوية تطوير النمط الظاهري السريرية مثيرة بين ثمانية و 22 شهرا من العمر، وتتميز الأعراض بما في ذلك فقدان الوزن، والسجود، وإعاقة حركية شديدة، وقد استخدم في هذه الدراسة. للالتحليلات الجزيئية من αS ^D (αS الأمراض المرتبطة) في هذه الفئران، وقد صمم لELISA لتحديد على وجه التحديد αS ^D في الفئران المريضة. وأظهر تحليل للنظام العصبي المركزي في هذا نموذج الفأر وجود αS ^D بشكل رئيسي في مناطق الدماغ الذيلية والحبل الشوكي. لم تكن هناك اختلافات في توزيع αS ^D بين ظروف تجريبية مختلفة مما يؤدي إلى المرض السريري، أي في uninoculATED والشيخوخة عادة الفئران المعدلة وراثيا والفئران الملقحة مع مقتطفات الدماغ من الفئران المريضة. كشف محدد من αS ^D مناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد Ser129 مفسفر αS بواسطة ELISA المترابطة في جوهرها مع أن حصلت عليها لطخة غربية والمناعية. بشكل غير متوقع، وقد لوحظت نتائج مماثلة مع العديد من الأجسام المضادة الأخرى ضد الجزء C من محطة αS. نشر αS ^D، مما يشير إلى تورط آلية "تشبه بريون"، وهكذا يمكن رصدها بسهولة وكميا في هذا النموذج الماوس باستخدام نهج ELISA.

Introduction

Most current methods for detecting disease-associated α-synuclein (αS^D) in experimental models of Parkinson's disease (PD), such as immunohistochemistry or Western blot, are time-consuming and not quantitative. This neurodegenerative disease is characterized by alpha-synuclein aggregation mainly in the form of inclusions containing an aggregated form of the normally soluble presynaptic protein αS^1,2 (Lewy bodies and Lewy neurites). Normally only marginally phosphorylated, αS is hyperphosphorylated at its serine 129 residue in these inclusions³ and can be monitored by antibodies specifically directed against Ser129 phosphorylated αS, thus providing a reliable marker of the pathology.

Recent research suggests that a “prion-like” mechanism could be involved in the propagation of αS aggregation within the nervous system of an affected patient^4,5. These studies reported the acceleration of a synucleinopathy by inoculating brain extracts containing αS^D into a transgenic mouse model (M83) expressing an A53T mutated human αS protein associated with a severe motor impairment occurring as the mice age⁶. In the same manner, intra-cerebral inoculation of aggregated recombinant αS in the same M83 mouse model confirmed the acceleration of aggregation⁵. The induction of deposits of phosphorylated αS has also been reported after inoculation of C57Bl/6 wild-type mice with either fibrillar recombinant αS or brain extracts from human DLB patients^7,8. Sacino et al.⁹ recently pointed out that after injection of fibrillar human αS, a widespread and progressive cerebral αS inclusion formation could be induced in M83 mice, but not in E46K transgenic mice or non-transgenic mice in which induced αS inclusions were transient, and mainly restricted to the site of injection. Recent studies on monkeys confirmed propagation of αS aggregates after inoculation of PD-derived extracts in species closer to humans¹⁰.

The link between αS alterations and Parkinson’s disease suggest that αS^D is a potential biomarker for Parkinson’s disease¹¹. A recent study showed the detection of oligomeric soluble aggregates of α-synuclein in human cerebro-spinal fluid (CSF) and plasma as a potential biomarker for Parkinson’s disease based on a conventional sandwich system ELISA using the same antibody to capture and detect αS¹². Based on the same method, multimeric proteins were recognized in biological samples, including the brain, because there are multiple copies of epitopes present in the assembled forms¹³. Very recently, pathological αS in the CSF of patients with a proven Lewy body pathology was detected using both an ELISA kit with a highly specific antibody against αS^D (5G4) and an immunoprecipitation assay¹⁴. These methods could differentiate patients with PD/DLB from other types of dementia.

The “prion-like” propagation of αS aggregation was further studied in transgenic mouse model M83 using an ELISA approach that was designed to specifically identify αS^D15. In this study, we report the detailed ELISA protocol used to quantitatively detect αS^D in sick mice (whether or not inoculated with αS^D from sick M83 mice) and more especially in the brain regions specifically targeted by the pathological process in this M83 transgenic mouse model⁴.

Protocol

وكانت كافة الإجراءات والبروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 86/609 / EEC والتي صادقت عليها يأتي، اللجنة الوطنية الفرنسية للنظر في الأخلاق في التجارب على الحيوانات (بروتوكول 11-0043). وتم إيواء الحيوانات والرعاية في افق ANSES في مرافق التجريبية في ليون (موافقة B 69387 0801).

1. إعداد الفئران

1. الموت ببطء الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من جرعة قاتلة من بنتوباربيتال الصوديوم.
2. استرداد كامل الدماغ من الجمجمة الماوس ووضعه في 35 ملم البلاستيك طبق بيتري على الجليد حتى الاستخراج.
3. استخراج النخاع الشوكي العنقي.
   ملاحظة: αS استخراج إما من أحد نصفي الدماغ بعد باجتزاء سهمي أو من أدمغة فئران تشريح، متوفرة بعد التجارب المدرجة في الجدول 1.

التجربهتي	الفئران اللقاح (أي ما يعادل الدماغ)	فترة البقاء على قيد الحياة (نقطة في البوصة)	متوسط ​​/ بقاء القصوى (الأيام الخوالي)	αS د الكشف عن طريق ELISA / WB / IHC
1	الفئران Uninoculated	441 ± 166	419/736	08/08
2	الفئران الملقحة (0.2 ملغم)	150 ± 52	140/241	09/09

الجدول 1. قائمة من التجارب التي أجريت على الفئران M83. أجريت التطعيمات في 6 أسابيع لتجربة 2 في منطقة striato القشرية مع 20 ميكرولتر من جناسة دماغ الفأر المرضى (1٪ بالوزن / المجلد في الجلوكوز 5٪)، بعد التخدير من 6 أسابيع من العمر الفئران M83 متماثل بنسبة 3٪ استنشاق الأيزوفلورين. نقطة في البوصة: آخر أيام inoculأوجه.

2. αS استخراج من الدماغ الأنصاف

1. قطع Sagittally الدماغ للحصول على نصفين. تزن كل شوط في أنبوب ribolysis تحتوي على كرات طحن.
2. إعداد كبيرة من الملح (HS) العازلة التي تحتوي على 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 750 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي EDTA، 1 ملم DTT، 1٪ الفوسفاتيز ومثبط البروتياز الكوكتيل. إضافة العازلة عالية من الملح إلى نصفين الدماغ للحصول على 20٪ (وزن / حجم) الخليط.
3. إعداد عينات من نصفي الدماغ باستخدام الخالط الميكانيكية في 6.0 م / ث لمدة 23 ثانية مرتين. بعد أول التجانس 23 ثانية، ووضع الأنابيب التي تحتوي على الخليط على الجليد لمدة 2 دقيقة قبل دورة 23 ثانية الثانية.
4. الطرد المركزي العينات في 1000 x ج لمدة 5 دقائق للقضاء على شظايا الدماغ unground. استرداد supernatants، تقسم إلى 200 مكل والاحتفاظ بها في -80 ° C لتحليل ELISA لاحق.

3. αS استخراج من تشريح مناطق الدماغ

1. تشريحالدماغ كله في 35 ملم البلاستيك طبق بيتري على الجليد مع انخفاض المكبر الطاقة (8X التكبير) باستخدام اثنين من forcipes التي يتم الاحتفاظ بها معا إلا عند تشريح الحصين الغايات. لا تتجاوز 10 دقيقة للحفاظ على سلامة الدماغ. وضع الدماغ الجانب الأيمن حتى واسترداد مناطق الدماغ التالية في هذا النظام:
   1. مستقل واحد من اثنين بصيلات الشم باستخدام ملقط وضعت للتو وراء لمبة. سلخه من الدماغ عن طريق حركة إلى الأسفل. كرر هذه العملية لمبة الثانية.
   2. إسفين بلطف ملقط في فترة ما بين اللحاء اثنين وتحريكه إلى الأمام لتسهيل التفكك من اللحاء اثنين. الحفاظ على الدماغ في مكان واحد مع ملقط، واستخدام آخر لفصل القشرة من الحصين.
   3. وضع ملقط 2 ملم تحت القشرة. الحفاظ على ضغط لطيف على ملقط حتى الجزء العلوي من الحصين مرئيا. تقشر الجزء الأول من القشرة، وكرر مع الجزء الثاني. استخدام ملقط لفصل اللحاء اثنينابتداء من الساعة الحصين وتتحرك نحو الجزء الأمامي من الدماغ.
   4. وضع ملقط مفتوحة حول واحدة من الحصين. إغلاق ملقط في الجزء السفلي من الحصين ثم إزالة برفق، واستعادة قدر الإمكان. كرر الإجراء الحصين الثاني.
   5. وضع ملقط مفتوحة أقل من واحد من مخططية وفصل برفق من الدماغ. استخدام ملقط لإزالة أي القشرة المتبقية من المخطط. كرر هذا الإجراء المخطط الثاني.
   6. استخدام ملقط لخفض بلطف 2 مم كفاف من المخيخ لتسهيل فصل المخيخ من المخ. وضع ملقط خلف المخيخ وإزالته عن طريق تحريك ملقط إلى الأمام.
   7. استخدام جزء واسع من ملقط لرفع الدماغ المتوسط ​​من أجل أن نرى بوضوح حيث ينضم جذع الدماغ. جعل شق عمودي عند تقاطع ثم إزالة جذع الدماغ.
   8. وضع ملقط وراء الدماغ المتوسط، وهو ماق تتألف من أربعة مبان مدورة. شق عموديا حتى تم فصل الدماغ المتوسط ​​تماما من الدماغ المتبقية.
2. إعداد الخليط من متغير٪ (وزن / حجم) في المخزن HS، اعتمادا على كمية من الأنسجة المتاحة، أي 5٪ جناسة لوزن ما بين 10 و 30 ملغ، 10٪ لوزن ما بين 30 و 80 ملغ، و 20٪ لوزن فوق 80 ملغ.
   1. إضافة حجم مناسب من العازلة HS إلى مناطق الدماغ تشريح للحصول على٪ المتوقعة من جناسة.
   2. دوامة وتأكد من أن الأنسجة مغمورة تماما في المنطقة العازلة HS.
   3. التجانس عينات أعدت من مناطق الدماغ تشريح أو الحبل الشوكي العنقي مع طاحونة الأنسجة تتكون من أنبوب زجاجي البورسليكات واثنين من المطاحن، A و B.
   4. صب كل منطقة في الدماغ لابد من سحقهم مباشرة في أنبوب. إدراج مدقة A في أنبوب وسحب عليه. كرر هذه الحركة عن عشر مرات لفصل الأنسجة. ثم استخدام مدقة B إلى Continue طحن الأنسجة مع 20 حركات أخرى. نقل الخليط في أنبوب 1.5 مل مع ماصة نقل 1 مل.
3. الطرد المركزي العينات في 1000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية للقضاء على أي شظايا الدماغ unground. استرداد supernatants، تفرق بينهم ما يصل إلى 200 مكل والاحتفاظ بها في -80 ° C لتحليل ELISA لاحق.

4. الكشف عن αS بواسطة ELISA

1. تمييع الأجسام المضادة طلاء إلى 0.01 نانوغرام / مل. استخدام إما معاداة αS بولكلونل الأرنب أو وحيدة النسيلة استنساخ 42 الأجسام المضادة في 50 ملي نا ₂ CO ₃ / NaHCO ₃ العازلة (درجة الحموضة 9.6).
2. معطف ال 96 جيدا microplates مع 100 ميكرولتر لكل بئر من هذا الحل طلاء، وترك في 4 درجات CO / N. استخدام مكافحة αS الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة في حل طلاء للELISAs باستخدام الأجسام المضادة كشف syn514، استنساخ 42، LB509، AS11، 4D6 أو 8A5. استخدام مكافحة αS وحيدة النسيلة الأجسام المضادة استنساخ 42 كحل طلاءجنبا الى جنب مع مكافحة pSer129 αS الكشف عن الأجسام المضادة.
   ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن أن أبقى لوحات في 4 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد قبل ELISA يتم تنفيذ.
3. استخدام لوحة غسالة لغسل الصحون خمس مرات مع 300 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة مع 0.05٪ توين 20 (PBST) لكل بئر. من هذه الخطوة فصاعدا، الحضانة في RT.
4. إضافة 200 ميكرولتر من T20 PBS عازلة تمنع لكل بئر. يهز لمدة 1 ساعة على 150 دورة في الدقيقة. تغسل الصحون خمس مرات مع PBST.
5. تمييع الخليط الدماغ (التخفيف 1: 100 من 20٪ من الخليط، 01:50 من٪ 10 من الخليط و1:25 من 5٪ من الخليط في PBST BSA 1٪)، وإضافة 100 ميكرولتر إلى كل بئر. ثم احتضان لمدة 2 ساعة في حين تهتز في 150 دورة في الدقيقة. تغسل الصحون خمس مرات مع PBST.
6. إضافة مختلف الأجسام المضادة كشف αS في PBST مع BSA 1٪ في التخفيفات المذكورة في قائمة المواد. احتضان لمدة 1 ساعة على 150 دورة في الدقيقة. تغسل الصحون خمس مرات مع PBST.
7. إضافة إما المضادة-mouse أو المضادة للأرنب تقارن مفتش HRP المخفف 1: 8000 في PBST تستكمل مع جيش صرب البوسنة 1٪ لمدة 1 ساعة في حين تهتز في 150 دورة في الدقيقة. تغسل الصحون خمس مرات مع PBST.
8. إضافة 100 ميكرولتر من 3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine (TMB) حل كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام بينما تهتز في 150 دورة في الدقيقة.
9. وقف رد فعل عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 1 N حمض الهيدروكلوريك لكل بئر ثم قياس الامتصاصية في 450 نانومتر مع قارئ صفيحة ميكروسكوبية.
10. لتحليل البيانات، طرح قيمة OD الحصول عليها في بئر مع جميع الكواشف باستثناء أي عينات مخ الفأر (جيد فارغة) من القيم OD قياس لكل من العينات التي تم تحليلها.

5. حاتمة رسم الخرائط

1. أداء رسم الخرائط حاتمة وفقا للطريقة التي وصفها عثمان ^16. لفترة وجيزة، والببتيدات بقعة من سلسلة α-synuclein الإنسان تحتوي على 12 الأحماض الأمينية على نتروسليلوز مع 10 الأحماض الأمينية متداخلة.
2. منع مع 50 ملي تريس / 150 ملي كلوريد الصوديوم درجة الحموضة عازلة 10 تحتوي على 0.05٪ توين 20 و 5٪ مسحوق الحليب. احتضان الأجسام المضادة في عرقلة الحل بتركيز 2 ميكروغرام الأجسام المضادة لكل مل في 2-10 درجة CO / N.
3. يغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام 50 ملي تريس / 150 ملي كلوريد الصوديوم العازلة درجة الحموضة التي تحتوي على 10 0.05٪ توين 20. احتضان مع الماعز المضادة للماوس مفتش HRP المترافقة. غسل غشاء خمس مرات أخرى باستخدام نفس المخزن ثم يلون باستخدام وصمة عار TMB عدة تلطيخ الغربية.

6. التحليل الإحصائي

1. استخدام البرنامج R وnlme حزمة لأداء آثار مختلطة انحدارات لنموذج OD. لكل المقارنة، نفذ نموذج الأثر الانحدار مختلطة. استخدام الأثر الثابت للتمييز أعراض من مجموعة أعراض.
2. استخدام تأثير عشوائي لتعكس التغير في تكرار للماوس معين. تحقق متماثل التفاوت عن طريق فحص المخلفات وإذا لزم الأمر، استخدام وظائف التباين في تصميم نموذج لهيكل الفرق من أخطاء داخل المجموعة وذلك تمشيا مع بينيرو وبيتس ¹7 اضبط 0.05 كعتبة أهمية P.

النتائج

في هذه الدراسة، وELISAs استخدام التعرف على وجه التحديد αS الأمراض المرتبطة (αS ^D) في الخليط الدماغ أعدت في منطقة عازلة عالية من الملح من الفئران المريضة M83. استخدام أجسام مضادة الاعتراف تحديدا pSer129 αS (ع = 0.0074)، وELISA يميز بسهولة القديمة والفئران المريضة (> 8 أشهر من الع?...

Discussion

وقد تجلى استخدام وسيلة ELISA للكشف على وجه التحديد αS ^D مباشرة من الخليط الماوس الدماغ أثناء المرض في M83 نموذج الفأر المعدل وراثيا. والحقيقة أن هذا ELISA التمييز بسهولة الفئران M83 المريضة من الفئران M83 صحية باستخدام الخليط الدماغ بالكامل فقط في المخزن عالية من الملح.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB509	Abcam	ab27766	Detection antibody 1/2,000
AS11	Produced at Anses		Detection antibody 1/1,000
4D6	Abcam	ab1903	Detection antibody 1/2,000
PSer129	Abcam	ab59264	Detection antibody 1/3,000
PSer129 EP1536Y	Abcam	ab51253	Detection antibody 1/1,000
syn514	Abcam	ab24717	Detection antibody 1/500
clone 42	BD Biosciences	610787	Coating and detection antibody (1/2,000)
8A5	Provided by Dr. Anderson		Detection antibody 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibody	Millipore	AB5038P	Coating antibody
Anti-mouse IgG HRP conjugate	Southern Biotech	1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugate	Southern Biotech	4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugate	Dianova	115-035-164
HS buffer			Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C
Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B
NaCl 750 mM	Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	Sigma	43815
PBS			Adjust at pH 7.5
Na2HPO4 1 mM	Euromedex	1309
KH2PO4 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl  137 mM	Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20	Euromedex	2001-C
BSA	Sigma	A7906
DTT 1 mM	Sigma	43815	Stock solution 100 mM, toxic
1% phosphatase cocktail	Pierce	78428
1% protease inhibitor cocktail	Roche	04 693 132 001	50x concentrated
Microplate MaxiSorpTM	Thermo Scientific	442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9.6
Na2CO3, 10H2O	Sigma	71360	2.86 g/L
NaHCO3	Merk	6329	3.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking buffer	Pierce	E6423H	10x concentrated
TMB	Sigma	T0440	Used for ELISA
TMB	Analytik Jena AG	847-0104200302	Used for epitope mapping
HCl 1 N	Chimie plus	40030
Ribolyser	Thermo	Fast prep FP120	keep on ice at this step
Grinding tubes	Biorad	355-1197
Plate washer	Tecan	Columbus Pro
Plate reader	Biorad	Model 680
Low power magnifier	VWR	630-1062	8X magnification
Forceps Dumont#7	WPI	14097	For dissection steps
Transfer pipette 1ml Samso	Samso	043231
1.5 ml tubes	Dutscher	033290