İnsan A53T aşırı eksprese eden transjenik farelerin beyninde Geliştirilmiş ELISA ile Hastalık ile ilişkili α-sinüklein tespiti α-sinüklein Mutasyona uğramış

Özet

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated α-synuclein (αS^D) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated αS form or the C-terminal part of the protein.

Özet

Western blot gibi bilinen metotlara ek olarak, yeni yöntemler hızlı ve kolay bir sinükleopatiler deneysel modellerinde hastalıkla ilişkili α-sinüklein (aS ^D) ölçmek için ihtiyaç vardır. Aşırı ifade eden insan A53T aS ve kendiliğinden kilo kaybı, bitkinlik, ve ağır motor bozukluğu dahil olmak üzere semptomlarla karakterize Sekiz ve 22 ay arasında bir dramatik klinik fenotip üreten bir transjenik fare soyu (M83), bu çalışmada kullanılmıştır. Bu farelerde aS ^D (hastalıkla ilişkili aS) moleküler analiz için, bir ELISA, özellikle hasta farelerde aS ^D ölçmek için tasarlanmıştır. Bu fare modeli, merkezi sinir sistemi analizi esas kaudal beyin bölgelerinde ve omurilikteki aS ^D varlığını göstermiştir. Yani klinik hastalığa yol açan farklı deneysel koşullar arasında aS ^D dağılımında farklılıklar uninocul de vardıated ve normal transgenik fareler yaşlanma ve hastalık farelerden alınan beyin özleri ile aşılanmış farelerde. Ser129 karşı bir antikor kullanılarak aS ^D imünoreaktivite spesifik tespiti esas olarak Western Blot ve immünohistokimya ile elde edilen korelasyon ELISA ile aS fosforile. Beklenmedik bir şekilde, benzer bir sonuç aS C-terminal kısmına karşı birkaç diğer antikorlar ile gözlendi. Bir "prion gibi" mekanizmasının rolünü düşündürmüştür aS ^D yayılması, böylece kolayca izlenebilir ve bir ELISA yaklaşımı kullanarak bu fare modelinde belirlenebilir.

Giriş

Most current methods for detecting disease-associated α-synuclein (αS^D) in experimental models of Parkinson's disease (PD), such as immunohistochemistry or Western blot, are time-consuming and not quantitative. This neurodegenerative disease is characterized by alpha-synuclein aggregation mainly in the form of inclusions containing an aggregated form of the normally soluble presynaptic protein αS^1,2 (Lewy bodies and Lewy neurites). Normally only marginally phosphorylated, αS is hyperphosphorylated at its serine 129 residue in these inclusions³ and can be monitored by antibodies specifically directed against Ser129 phosphorylated αS, thus providing a reliable marker of the pathology.

Recent research suggests that a “prion-like” mechanism could be involved in the propagation of αS aggregation within the nervous system of an affected patient^4,5. These studies reported the acceleration of a synucleinopathy by inoculating brain extracts containing αS^D into a transgenic mouse model (M83) expressing an A53T mutated human αS protein associated with a severe motor impairment occurring as the mice age⁶. In the same manner, intra-cerebral inoculation of aggregated recombinant αS in the same M83 mouse model confirmed the acceleration of aggregation⁵. The induction of deposits of phosphorylated αS has also been reported after inoculation of C57Bl/6 wild-type mice with either fibrillar recombinant αS or brain extracts from human DLB patients^7,8. Sacino et al.⁹ recently pointed out that after injection of fibrillar human αS, a widespread and progressive cerebral αS inclusion formation could be induced in M83 mice, but not in E46K transgenic mice or non-transgenic mice in which induced αS inclusions were transient, and mainly restricted to the site of injection. Recent studies on monkeys confirmed propagation of αS aggregates after inoculation of PD-derived extracts in species closer to humans¹⁰.

The link between αS alterations and Parkinson’s disease suggest that αS^D is a potential biomarker for Parkinson’s disease¹¹. A recent study showed the detection of oligomeric soluble aggregates of α-synuclein in human cerebro-spinal fluid (CSF) and plasma as a potential biomarker for Parkinson’s disease based on a conventional sandwich system ELISA using the same antibody to capture and detect αS¹². Based on the same method, multimeric proteins were recognized in biological samples, including the brain, because there are multiple copies of epitopes present in the assembled forms¹³. Very recently, pathological αS in the CSF of patients with a proven Lewy body pathology was detected using both an ELISA kit with a highly specific antibody against αS^D (5G4) and an immunoprecipitation assay¹⁴. These methods could differentiate patients with PD/DLB from other types of dementia.

The “prion-like” propagation of αS aggregation was further studied in transgenic mouse model M83 using an ELISA approach that was designed to specifically identify αS^D15. In this study, we report the detailed ELISA protocol used to quantitatively detect αS^D in sick mice (whether or not inoculated with αS^D from sick M83 mice) and more especially in the brain regions specifically targeted by the pathological process in this M83 transgenic mouse model⁴.

Protokol

Tüm prosedürler ve hayvanları da içeren protokoller EC Direktifi 86/609 / EEC ve Cometh, hayvan deneyleri (protokol 11-0043) etik dikkate Fransız ulusal komitesi tarafından onaylanmış uygun idi. hayvanların barındırıldığı ve Anses en (0801 69387 onay B) Lyon deneysel tesisleri onaylı bakım için.

Fareler 1. Hazırlık

1. Sodyum pentobarbital öldürücü dozun intraperitoneal enjeksiyonu ile farelere Euthanize.
2. Fare kafatası tüm beyin almak ve ekstraksiyon kadar buz üzerinde 35 mm plastik Petri kabı yerleştirin.
3. Servikal spinal kord ayıklayın.
   NOT: Özü aS ya Tablo 1'de listelenen deneyler sonra kullanılabilir sagital kesit sonra veya disseke fare beyinleri beyin yarım birinden gelen.

Experiment	Fareler Aşı (beyin eşdeğeri)	Survival dönemi (Dpi)	Medyan / maksimum sağkalım (Gün eski)	ELISA ile D algılama aS / WB / İHK
1	Aşılanmamış fareler	441 ± 166	419/736	8/8
2	Aşılanmış fareler (0.2 mg),	150 ± 52	140/241	9/9

M83 fareler üzerinde gerçekleştirilen deneylerin Tablo 1. listesi. Aşılama sonrası, (glikoz içinde% 1 ağırlık / hacim,% 5), hasta bir fare beyin homojenatının 20 ul ile striato-kortikal bölgede Deney 2 6 hafta uygulandı % 3 izofluran inhalasyon yoluyla 6 haftalık homozigot M83 farelerin anestezi. dpi: gün inokülasyonu sonrasıtirme.

Beyin Yarısı 2. aS Ekstraksiyon

1. Sagittally iki yarısını elde etmek için beyin kesti. Öğütme topları içeren bir ribolysis tüp içinde her yarım tartılır.
2. 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 750 mM NaCI, 5 mM EDTA, 1 mM DTT,% 1 fosfataz ve proteaz inhibitörü kokteyli içeren yüksek tuz (HS), tampon hazırlayın. % 20 (ağırlık / hacim) homojenatları elde etmek için, beyin yarısı yüksek tuz tamponu ekleyin.
3. 6.0 m mekanik homojenleştirici kullanarak beyin yarıları örnekleri hazırlayın / s 23 sn kez. Ilk 23 saniye homojenize edildikten sonra ikinci bir 23-sek çevriminden önce 2 dakika için buz üzerinde homojenatları içeren tüpleri.
4. 5 dk öğütülmemiş beyin parçalarını ortadan kaldırmak için 1000 xg'de örnekleri santrifüj. 200 ul alikotlara bölünür ve daha sonra ELISA analizi için -80 ° C'de saklayın, süpernatantlar kurtarmak.

Dissected Beyin Bölgeler 3. aS Ekstraksiyon

1. Teşrih biruçları, hipokampus kesme dışında bir arada tutulur, iki forcipes kullanarak düşük güç büyüteç (8 x büyütme) ile buz üzerinde 35 mm'lik plastik Petri tabağı içine tüm beyin. Beyin bütünlüğünü korumak için 10 dakika aşmayın. Beyin yerleştirin sağ yan ve bu sırayla şu beyin bölgelerinin almak:
   1. Sadece ampul arkasına yerleştirilen forseps kullanılarak iki koku ampuller Ayrı biri. Bir aşağı hareket ile beyinden ayırmak. İkinci ampul bu işlemi tekrarlayın.
   2. Yavaşça iki kortekste arasında forseps kama ve iki korteks ayrılmasını kolaylaştırmak için ileriye doğru hareket ettirin. Bir forseps ile yerine beyin tutulması, hipokampus gelen korteks ayırmak için başka kullanabilirsiniz.
   3. Forseps korteks altında 2 mm yerleştirin. Hipokampus üst görünür oluncaya kadar forseps üzerinde hafif bir baskı koruyun. Korteksin ilk bölümü soyulabilir ve ikinci bölümü ile tekrarlayın. İki korteks ayırmak için forseps kullanabilirhipokampus başlayan ve beynin ön tarafına doğru hareket.
   4. Hippocampi biri etrafında açık forseps yerleştirin. Daha sonra yavaşça mümkün olduğu kadar geri kazanılması, çıkarmak hipokamp altındaki forseps kapatın. İkinci hipokampus için prosedürü tekrarlayın.
   5. Striatasından birinin altındaki açık forseps yerleştirin ve yavaşça beynin ayırın. Striatum kalan korteks kaldırmak için forseps kullanın. İkinci striatum için bu yordamı yineleyin.
   6. Yavaşça beyin beyincik ayrılmasını kolaylaştırmak için, 2 mm beyincik konturu tarafından bastırmak için forseps kullanın. Sadece beyincik arkasında forseps yerleştirin ve ileri forseps hareket ettirerek çıkarın.
   7. Beyin sapını birleştiği yerde açıkça görmek için mesencephalon yükseltmek için forseps geniş kısmını kullanın. Kavşakta dikey kesi daha sonra beyin sapı çıkarın olun.
   8. , Mezensefalona arkasındaki forseps yerleştirin hangi idört yuvarlak yapılardan oluşur s. Mezensefalon tamamen geriye kalan beyin ayrılmış kadar dikey olarak İnsizyon.
2. Değişken% HS tampon maddesi içinde (ağırlık / hacim), mevcut dokuların miktarına bağlı olarak, örneğin, 10 ve 30 mg arasında bir ağırlık için% 5 homojenat, 30 ve 80 mg arasında bir ağırlık için% 10 ve% 20 arasında homojenatları hazırlanması 80 mg üzerinde bir ağırlık.
   1. Homojenat beklenen% elde etmek için parçalandı beyin bölgelerine HS tamponu yeterli hacim.
   2. Vortex ve dokular tamamen HS tamponu dalmış olup olmadığını kontrol edin.
   3. Borosilikat cam tüp ve iki havan tokmaklarının, A ve B oluşan bir doku öğütücüsüyle kesilerek beyin bölgelerinde veya servikal spinal kord hazırlanabilir örnekleri homojenize
   4. Tüp içine doğrudan ezilmiş olan her beyin bölgesini dökün. Tüpe havaneli A yerleştirin ve geri çekin. Doku ayırmak Bu hareketi yaklaşık on kez tekrarlayın. Ardından c havaneli B kullanınBir başka 20 hareketleri ile doku taşlama ontinue. 1 ml transfer pipet ile 1.5 ml tüp içine homojenatları aktarın.
3. Herhangi bir öğütülmemiş beyin parçaları ortadan kaldırmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de örnekleri santrifüjleyin. Süpernatanlar Al 200 ul alikotları bunları ayırmak ve daha sonra ELISA analizi için -80 ° C 'de muhafaza edin.

ELISA ile aS 4. Algılama

1. 0.01 ng / ml kaplama antikorları sulandırmak. 50 mM _Na-2 CO ₃ / NaHCO ₃ tamponu (pH 9.6), anti-aS tavşan poliklonal ya da monoklonal antikor klon 42 kullanın.
2. Ceket 96 oyuklu mikro-plakalar bu kaplama çözeltisi, oyuk başına 100 ul ve 4 ° CO / N bırakın. Saptama antikorları syn514 kullanılarak ELISA kaplama çözeltisi içinde, anti-aS tavşan poliklonal antikoru kullanarak 42, LB509, AS11, 4D6 ve 8A5 klonu. Bir kaplama solüsyonu gibi anti-aS monoklonal antikor klon 42 kullanınAnti-pSer129 aS algılama antikoru ile kombinasyon halinde.
   Not: plakalar ELISA önce bir hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir, gerekli ise gerçekleştirilir.
3. Oyuk başına% 0.05 Tween 20 (PBST) ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi, 300 | il ile beş kez yıkamak için bir levha yıkayıcı kullanın. Başlar ve bu adımdan, inkübasyon, oda sıcaklığında yer almaktadır.
4. T20 PBS kuyu başına tampon engelleme 200 ul ekleyin. 150 rpm'de 1 saat boyunca çalkalanır. PBST ile plakalar beş kez yıkayın.
5. (% 20 homojenatlarının 100,% 10 homojenatlarının 1:50 ve PBST BSA% 1% 5 homojenatlarının 1:25 seyreltme 1) ve her bir kuyucuğa 100 ul Beyin homojen seyreltilir. 150 rpm'de çalkalanarak daha sonra 2 saat süreyle inkübe edin. PBST ile plakalar beş kez yıkayın.
6. Malzeme Listesi'nde belirtilen sulandırmalarda BSA ile PBST% 1 farklı aS algılama antikorları ekleyin. 150 rpm'de 1 saat süreyle inkübe edin. PBST ile plakalar beş kez yıkayın.
7. Anti-ya Ekle150 rpm'de çalkalanarak 1 saat boyunca% 1 BSA ile desteklenmiş PBST içinde 8000: -fare ya da anti-tavşan IgG HRP konjügatları 1 seyreltilmiştir. PBST ile plakalar beş kez yıkayın.
8. Her oyuğa, 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) çözeltisine 3,3 '100 ul ilave edin ve 150 rpm'de çalkalanarak karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin.
9. De o zaman mikro levha okuyucusu ile 450 nm'de absorbans ölçümü için 1 N HCI, 100 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun.
10. Veri analizi için, analiz edilen örneklerin her biri için, ölçülen OD değerleri herhangi bir fare beyin örneklerindeki (boş oyuk) dışındaki tüm reaktifleri ile iyi olarak elde edilen OD değerini çıkarın.

5. Epitop Haritalama

1. Osman ¹⁶ tarafından tarif edilen metoda göre, epitop eşleme gerçekleştirin. Kısaca, 10 üst üste binen amino asitlerin nitroselüloz üzerinde 12 amino asidini ihtiva eden insan α-sinüklein dizisinin Noktası peptidler.
2. 50 mM Tris / 150 mM NaCl tamponu, pH 1 ile bloke0% 0.05 Tween 20 ve% 5 süt tozu ihtiva etmektedir. 2-10 ° CO / H de ml başına 2 ug antikorun bir konsantrasyonda çözelti engelleme antikor inkübe edin.
3. Membranı 50 mM Tris / 150 keçi anti-fare IgG HRP konjügatı ile% 0.05 Tween 20 ihtiva eden inkübe mM NaCI tampon pH 10 ile üç kez yıkayın. Daha sonra aynı tampon kullanarak başka beş kez bir Western Blot TMB boyama kiti kullanılarak leke membran yıkayın.

6. İstatistiksel Analiz

1. OD model karışık etkiler regresyon gerçekleştirmek için R yazılım ve nlme paketi kullanın. Her bir karşılaştırma için, karışık bir etkisi regresyon modeli yerine getirir. Asemptomatik gruplardan semptomatik ayırt etmek için bir sabit efektini kullanın.
2. Belirli bir fare tekrarlar değişkenliği yansıtacak şekilde rastgele efektini kullanın. Artıklar inceleyerek homoscedasticity edin ve gerekirse Pinheiro ve Bates ¹ doğrultusunda grup içi hataların varyans yapısını modellemek için varyans işlevlerini kullanın7. P. önemi eşiği olarak 0.05 ayarla

Sonuçlar

Bu çalışmada kullanılan ELISA özel hasta M83 farelerden yüksek tuz tamponu içinde hazırlanan beyni homojenatlarında hastalıkla ilişkili aS (aS ^D) tanımlanmıştır. Özellikle pSer129 aS (p = 0,0074) tanıyan bir antikor kullanarak, ELISA kolaylıkla genç (eski 2-5 ay), sağlıklı M83 farelerde (Şekil 1) eski, hasta farelerin (> 8 aylık) ayırır. Birkaç diğer antikorlar benzer şekilde yüksek sinyaller sadece hasta farelerin beyin homojenatlanndaki (> 0.6 OD) göster...

Tartışmalar

bir ELISA kullanımı özellikle M83 transjenik fare modelinde hastalıktan sırasında fare beyni homojenatlarında şirketinden aS ^D tespit etmek için ortaya konmuştur. Nitekim, bu ELISA kolayca Yüksek Tuz tamponunda sadece tüm beyin homojenatları kullanarak sağlıklı M83 farelerden elde edilen hasta M83 fareler ayırt olabilir.

Bu ELISA kullanılarak başarılı sonuçlar için en kritik adımlar şunlardır: doğru diseksiyon sırasında zarar görmesini önlemek için ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB509	Abcam	ab27766	Detection antibody 1/2,000
AS11	Produced at Anses		Detection antibody 1/1,000
4D6	Abcam	ab1903	Detection antibody 1/2,000
PSer129	Abcam	ab59264	Detection antibody 1/3,000
PSer129 EP1536Y	Abcam	ab51253	Detection antibody 1/1,000
syn514	Abcam	ab24717	Detection antibody 1/500
clone 42	BD Biosciences	610787	Coating and detection antibody (1/2,000)
8A5	Provided by Dr. Anderson		Detection antibody 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibody	Millipore	AB5038P	Coating antibody
Anti-mouse IgG HRP conjugate	Southern Biotech	1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugate	Southern Biotech	4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugate	Dianova	115-035-164
HS buffer			Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C
Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B
NaCl 750 mM	Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	Sigma	43815
PBS			Adjust at pH 7.5
Na2HPO4 1 mM	Euromedex	1309
KH2PO4 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl  137 mM	Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20	Euromedex	2001-C
BSA	Sigma	A7906
DTT 1 mM	Sigma	43815	Stock solution 100 mM, toxic
1% phosphatase cocktail	Pierce	78428
1% protease inhibitor cocktail	Roche	04 693 132 001	50x concentrated
Microplate MaxiSorpTM	Thermo Scientific	442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9.6
Na2CO3, 10H2O	Sigma	71360	2.86 g/L
NaHCO3	Merk	6329	3.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking buffer	Pierce	E6423H	10x concentrated
TMB	Sigma	T0440	Used for ELISA
TMB	Analytik Jena AG	847-0104200302	Used for epitope mapping
HCl 1 N	Chimie plus	40030
Ribolyser	Thermo	Fast prep FP120	keep on ice at this step
Grinding tubes	Biorad	355-1197
Plate washer	Tecan	Columbus Pro
Plate reader	Biorad	Model 680
Low power magnifier	VWR	630-1062	8X magnification
Forceps Dumont#7	WPI	14097	For dissection steps
Transfer pipette 1ml Samso	Samso	043231
1.5 ml tubes	Dutscher	033290