Detecção de doença associada α-sinucleína por ELISA reforçada no cérebro de ratinhos transgénicos que sobre-expressam A53T Humano Mutante α-sinucleína

Resumo

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated α-synuclein (αS^D) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated αS form or the C-terminal part of the protein.

Resumo

Além dos métodos estabelecidos como Western blot, são necessários novos métodos para quantificar rapidamente e facilmente associada a doença α-sinucleína ^(D aS) em modelos experimentais de synucleopathies. Uma linha de ratinhos transgénicos (M83) que sobre-expressam os aS A53T humanos e o desenvolvimento de um fenótipo clínico espontaneamente dramática entre oito e 22 meses de idade, caracterizada por sintomas que incluem a perda de peso, prostração, e deficiência motora grave, foi utilizada neste estudo. Para análises moleculares de aS ^D (aS associada a doença) nestes ratos, um ensaio ELISA foi desenvolvido para quantificar especificamente aS ^D em ratinhos doentes. Análise do sistema nervoso central neste modelo de ratinho revelou a presença de ^D aS principalmente nas regiões do cérebro caudal e da medula espinhal. Não houve diferenças na distribuição aS ^D entre diferentes condições experimentais que conduzem à doença clínica, isto é, em uninoculATED e normalmente envelhecimento ratinhos transgénicos e em ratinhos inoculados com extractos de cérebro de ratinhos doentes. A detecção específica de aS ^D imunorreactividade usando um anticorpo contra a Ser129 fosforilada aS por ELISA essencialmente correlacionados com os valores obtidos por transferência de Western e imuno-histoquímica. Inesperadamente, resultados semelhantes foram observados com vários outros anticorpos contra a parte C-terminal de aS. A propagação de aS ^D, sugerindo o envolvimento de um mecanismo de "prião-like", pode, assim, ser facilmente controlado e quantificado neste modelo de ratinho utilizando uma abordagem de ELISA.

Introdução

Most current methods for detecting disease-associated α-synuclein (αS^D) in experimental models of Parkinson's disease (PD), such as immunohistochemistry or Western blot, are time-consuming and not quantitative. This neurodegenerative disease is characterized by alpha-synuclein aggregation mainly in the form of inclusions containing an aggregated form of the normally soluble presynaptic protein αS^1,2 (Lewy bodies and Lewy neurites). Normally only marginally phosphorylated, αS is hyperphosphorylated at its serine 129 residue in these inclusions³ and can be monitored by antibodies specifically directed against Ser129 phosphorylated αS, thus providing a reliable marker of the pathology.

Recent research suggests that a “prion-like” mechanism could be involved in the propagation of αS aggregation within the nervous system of an affected patient^4,5. These studies reported the acceleration of a synucleinopathy by inoculating brain extracts containing αS^D into a transgenic mouse model (M83) expressing an A53T mutated human αS protein associated with a severe motor impairment occurring as the mice age⁶. In the same manner, intra-cerebral inoculation of aggregated recombinant αS in the same M83 mouse model confirmed the acceleration of aggregation⁵. The induction of deposits of phosphorylated αS has also been reported after inoculation of C57Bl/6 wild-type mice with either fibrillar recombinant αS or brain extracts from human DLB patients^7,8. Sacino et al.⁹ recently pointed out that after injection of fibrillar human αS, a widespread and progressive cerebral αS inclusion formation could be induced in M83 mice, but not in E46K transgenic mice or non-transgenic mice in which induced αS inclusions were transient, and mainly restricted to the site of injection. Recent studies on monkeys confirmed propagation of αS aggregates after inoculation of PD-derived extracts in species closer to humans¹⁰.

The link between αS alterations and Parkinson’s disease suggest that αS^D is a potential biomarker for Parkinson’s disease¹¹. A recent study showed the detection of oligomeric soluble aggregates of α-synuclein in human cerebro-spinal fluid (CSF) and plasma as a potential biomarker for Parkinson’s disease based on a conventional sandwich system ELISA using the same antibody to capture and detect αS¹². Based on the same method, multimeric proteins were recognized in biological samples, including the brain, because there are multiple copies of epitopes present in the assembled forms¹³. Very recently, pathological αS in the CSF of patients with a proven Lewy body pathology was detected using both an ELISA kit with a highly specific antibody against αS^D (5G4) and an immunoprecipitation assay¹⁴. These methods could differentiate patients with PD/DLB from other types of dementia.

The “prion-like” propagation of αS aggregation was further studied in transgenic mouse model M83 using an ELISA approach that was designed to specifically identify αS^D15. In this study, we report the detailed ELISA protocol used to quantitatively detect αS^D in sick mice (whether or not inoculated with αS^D from sick M83 mice) and more especially in the brain regions specifically targeted by the pathological process in this M83 transgenic mouse model⁴.

Protocolo

Todos os procedimentos e protocolos que envolvam animais estavam em conformidade com a Directiva CE 86/609 / CEE do Conselho e ratificado pelo vem, o comitê nacional francês para a consideração de Ética em Experimentação Animal (protocolo 11-0043). Os animais foram alojados e tratados em ANSES de aprovado instalações experimentais em Lyon (aprovação B 69387 0801).

1. Preparação de Ratos

1. Eutanásia ratinhos por injecção intraperitoneal de uma dose letal de pentobarbital de sódio.
2. Recuperar todo o cérebro do crânio do rato e colocá-lo em um 35 milímetros de plástico placa de Petri sobre gelo até a extração.
3. Extrai-se a medula espinal cervical.
   NOTA: aS Extrair quer a partir de uma das metades do cérebro após a secção sagital ou a partir de cérebros de rato dissecadas, disponível após as experiências enumeradas na Tabela 1.

Experiment	Ratos Inóculo (equivalente cérebro)	Período de sobrevivência (Dpi)	Median / sobrevivência máxima (dias de idade)	aS detecção d por ELISA / WB / IHC
1	Ratos não inoculadas	441 ± 166	419/736	8/8
2	Camundongos inoculados (0,2 mg)	150 ± 52	140/241	9/9

Tabela 1. Lista de experiências realizadas em ratos M83. As inoculações foram realizadas com 6 semanas de experiência 2 na área do estriato-cortical com 20 ul de um homogenato de cérebro de um rato doente (1% peso / vol em glucose a 5%), depois anestesia de seis semanas de idade ratos M83 homozigotos 3% inalação de isoflurano. dpi: dias após inoculção.

2. Extracção de aS Cérebro Metades

1. Sagital cortar o cérebro para obter duas metades. Pesar cada metade em um tubo ribolysis contendo bolas de moagem.
2. Prepare alta Sal (SH) de tampão contendo 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 750 mM, EDTA 5 mM, DTT 1 mM, 1% de fosfatase e inibidores da protease cocktails. Adicionar tampão alto de sal para as metades do cérebro para se obter 20% (peso / volume) homogeneizados.
3. Preparar as amostras de as metades cerebrais usando um homogeneizador mecânico em 6,0 m / s durante 23 seg duas vezes. Após os primeiros 23 segundos de homogeneização, colocar os tubos que contêm os homogeneizados em gelo durante 2 min antes do segundo ciclo de 23 seg.
4. Centrifugar as amostras a 1000 xg durante 5 minutos para eliminar fragmentos de cérebro não moídos. Recuperar os sobrenadantes, dividem-se em 200 mL alíquotas e mantê-los à temperatura de -80 ° C para análise posterior ELISA.

3. aS Extração de Dissecadas regiões do cérebro

1. Dissecar umcérebro inteiro em um 35 milímetros de plástico placa de Petri no gelo com um ampliador de baixa potência (ampliação 8X), utilizando dois forcipes cujas extremidades são mantidos juntos, exceto quando dissecando o hipocampo. Não exceda 10 min para preservar a integridade do cérebro. Coloque o cérebro lado direito para cima e recuperar os seguintes regiões do cérebro, nesta ordem:
   1. Separe um dos dois bulbos olfatórios usando uma pinça colocados logo atrás do bulbo. Deslocá-lo do cérebro por um movimento para baixo. Repita esta operação para a segunda lâmpada.
   2. Suavemente cunha a pinça entre as duas córtices e movê-lo para a frente para facilitar a dissociação das duas córtex. Mantendo o cérebro no lugar com um fórceps, utilizar outro para separar o córtex do hipocampo.
   3. Posicionar a pinça 2 mm abaixo do córtex. Manter uma pressão suave sobre a pinça até que o topo do hipocampo é visível. Retire a primeira parte do córtex, e repita com a segunda parte. Utilizar as pinças para separar os dois córticescomeçando no hipocampo e que se deslocam para a frente do cérebro.
   4. Posicione a pinça abertos ao redor um dos hipocampos. Fechar a pinça, na parte inferior do hipocampo, em seguida, removê-lo suavemente, recuperando-se, tanto quanto possível. Repetir o procedimento para a segunda hipocampo.
   5. Posicionar as pinças abertas abaixo de um dos corpos estriados e separá-lo suavemente a partir do cérebro. Utilizar as pinças para remover qualquer remanescente córtex do striatum. Repita este procedimento para o segundo striatum.
   6. Utilizar as pinças para deprimir suavemente por 2 mm, o contorno do cerebelo para facilitar a separação do cerebelo a partir do cérebro. Coloque a pinça logo atrás do cerebelo e removê-lo, movendo a pinça para a frente.
   7. Utilizar a parte larga da pinça para elevar o mesencéfalo, a fim de ver claramente onde se junta o tronco cerebral. Adicione uma incisão vertical na junção, em seguida, remover o tronco cerebral.
   8. Posicione a pinça atrás do mesencéfalo, que is composta por quatro estruturas arredondadas. Inciso verticalmente até o mesencéfalo foi completamente separado do restante do cérebro.
2. Prepare homogenatos de variável% (peso / volume) em tampão SH, dependendo da quantidade de tecidos disponíveis, isto é, 5% homogeneizado para um peso entre 10 e 30 mg, 10% para um peso entre 30 e 80 mg, e 20% para um peso acima de 80 mg.
   1. Adicionar um volume adequado de tampão de HS para as regiões cerebrais dissecados para se obter o esperado% de homogenato.
   2. Vortex e verificar que os tecidos são totalmente imersos no buffer HS.
   3. Homogeneizar amostras preparadas a partir das regiões cerebrais dissecados ou a medula espinhal cervical com um moinho de tecido composto por um tubo de vidro de borosilicato e dois pilões, A e B.
   4. Pour cada região do cérebro para ser esmagado directamente para dentro do tubo. Inserir um pilão para dentro do tubo e retirá-la. Repetir este movimento cerca de dez vezes para dissociar o tecido. Em seguida, use um pilão B para continue moer o tecido com mais 20 movimentos. Transferir os homogeneizados num tubo de 1,5 ml com uma pipeta de transferência de 1 ml.
3. Centrifugar as amostras a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C para eliminar quaisquer fragmentos cerebrais não moídos. Recuperar os sobrenadantes, dividi-los em 200 mL alíquotas e mantê-los à temperatura de -80 ° C para análise posterior ELISA.

4. Detecção de aS por ELISA

1. Diluir os anticorpos de revestimento para 0,01 ng / ml. Use um anti-soro policlonal de coelho ou aS monoclonal clone de anticorpo em 42 mM de Na ₂ CO / ₃ tampão NaHCO ₃ 50 (pH 9,6).
2. Revestir a microplacas de 96 poços com 100 ul por poço de solução de revestimento, esta e deixar a 4 ° CO / N. Utilizar o anticorpo policlonal de coelho anti-aS na solução de revestimento para ELISA, utilizando anticorpos de detecção syn514, clone 42, LB509, AS11, 4d6 ou 8A5. Use o anti-aS anticorpo monoclonal clone 42 como uma solução de revestimentoem combinação com o anti-pSer129 aS anticorpo de detecção.
   NOTA: Se necessário, as placas podem ser mantidas a 4 ° C durante uma semana antes do ELISA é realizado.
3. Usar um lavador de placas para lavar as placas cinco vezes com 300 ul de solução salina tamponada com fosfato com 0,05% de Tween 20 (PBST) por poço. A partir deste passo em diante, a incubação é a TA.
4. Adicionar 200 ul de tampão PBS T20 por cavidade de bloqueio. Agita-se durante 1 hora a 150 rpm. Lavam-se as placas cinco vezes com PBST.
5. Diluir os homogenatos cerebrais (diluição 1: 100 dos homogenatos de 20%, 01:50 10% dos homogenatos e 01:25 dos homogenatos de 5% em PBST BSA a 1%), e adicionar 100 ul a cada poço. Em seguida incubar durante 2 horas enquanto se agitava a 150 rpm. Lavam-se as placas cinco vezes com PBST.
6. Adicione os diferentes anticorpos de detecção aS em PBST com BSA 1% nas diluições mencionados na Lista de Materiais. Incubar durante 1 hora a 150 rpm. Lavam-se as placas cinco vezes com PBST.
7. Adicionar tanto anti-Mouse ou anti-coelho conjugados HRP de IgG diluído 1: 8000 em PBST suplementado com BSA a 1% durante 1 hora, agitando a 150 rpm. Lavam-se as placas cinco vezes com PBST.
8. Adicionar 100 ul de 3,3 ', 5,5' solução-tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço e incubar durante 15 min no escuro, com agitação a 150 rpm.
9. Parar a reacção por adição de 100 ul de HCl 1 N por poço, em seguida, medir a absorvência a 450 nm com um leitor de microplacas.
10. Para análise de dados, subtrair o valor de DO obtidos com um bem com todos os reagentes, excepto as amostras do cérebro do rato (bem em branco) a partir dos valores de DO medido para cada uma das amostras analisadas.

5. Mapeamento de Epitopos

1. Realizar mapeamento de epítopos de acordo com o método descrito por Osman ^16. Resumidamente, os péptidos da sequência no local de α-sinucleína humano contendo 12 aminoácidos de nitrocelulose com 10 aminoácidos que se sobrepõem.
2. Bloco com 50 mM de Tris / NaCI 150 mM, pH 10 contendo 0,05% de Tween 20 e 5% de leite em pó. Incubar o anticorpo em solução a uma concentração de 2 ug de anticorpo por ml de bloqueio a 2-10 ° CO / N.
3. Lava-se a membrana três vezes, utilizando Tris a 50 mM / NaCl 150 mM, pH 10, que contém 0,05% de Tween 20. Incubar, com o anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho conjugado com HRP. Lava-se a membrana mais cinco vezes, utilizando o mesmo tampão, em seguida, a mancha usando um kit de coloração de Western blot de TMB.

6. Análise Estatística

1. Use o pacote de software e R nlme para executar as regressões de efeitos mistos para modelar OD. Para cada comparação, realizar um modelo de regressão de efeitos mistos. Use um efeito fixo para distinguir sintomático de grupos assintomáticos.
2. Usar um efeito aleatório para reflectir a variabilidade de repetições para um dado rato. Verifique homoscedasticidade examinando os resíduos e, se necessário, use as funções de variância para modelar a estrutura de variância de erros dentro do grupo de acordo com Pinheiro e Bates ¹7. Defina 0,05 como limite de significância de P.

Resultados

Neste estudo, as ELISAs utilizados especificamente identificados aS associados à doença ^(D aS) em homogenatos de cérebro preparados num tampão de alto de sal a partir de ratinhos doentes M83. Usando um anticorpo que reconhece especificamente pSer129 aS (p = 0,0074), o ELISA facilmente distingue antigos, camundongos doentes (> 8 meses de idade) de jovens (2-5 meses de idade), os camundongos saudáveis ​​M83 (Figura 1). Vários outros anticorpos mostraram sinais igualmente elevados (...

Discussão

Foi demonstrada a utilização de um ELISA para detectar especificamente aS ^D directamente a partir de homogenatos do cérebro do rato no decorrer da doença no modelo de ratinho transgénico para M83. Na verdade, este ELISA poderia facilmente distinguir os ratos doentes M83 M83 de camundongos saudáveis ​​utilizando homogeneizados única inteiras cerebrais em tampão de alta sal.

Os passos mais críticos para os resultados bem sucedidos utilizando este ELISA são: dissecting ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB509	Abcam	ab27766	Detection antibody 1/2,000
AS11	Produced at Anses		Detection antibody 1/1,000
4D6	Abcam	ab1903	Detection antibody 1/2,000
PSer129	Abcam	ab59264	Detection antibody 1/3,000
PSer129 EP1536Y	Abcam	ab51253	Detection antibody 1/1,000
syn514	Abcam	ab24717	Detection antibody 1/500
clone 42	BD Biosciences	610787	Coating and detection antibody (1/2,000)
8A5	Provided by Dr. Anderson		Detection antibody 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibody	Millipore	AB5038P	Coating antibody
Anti-mouse IgG HRP conjugate	Southern Biotech	1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugate	Southern Biotech	4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugate	Dianova	115-035-164
HS buffer			Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C
Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B
NaCl 750 mM	Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	Sigma	43815
PBS			Adjust at pH 7.5
Na2HPO4 1 mM	Euromedex	1309
KH2PO4 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl  137 mM	Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20	Euromedex	2001-C
BSA	Sigma	A7906
DTT 1 mM	Sigma	43815	Stock solution 100 mM, toxic
1% phosphatase cocktail	Pierce	78428
1% protease inhibitor cocktail	Roche	04 693 132 001	50x concentrated
Microplate MaxiSorpTM	Thermo Scientific	442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9.6
Na2CO3, 10H2O	Sigma	71360	2.86 g/L
NaHCO3	Merk	6329	3.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking buffer	Pierce	E6423H	10x concentrated
TMB	Sigma	T0440	Used for ELISA
TMB	Analytik Jena AG	847-0104200302	Used for epitope mapping
HCl 1 N	Chimie plus	40030
Ribolyser	Thermo	Fast prep FP120	keep on ice at this step
Grinding tubes	Biorad	355-1197
Plate washer	Tecan	Columbus Pro
Plate reader	Biorad	Model 680
Low power magnifier	VWR	630-1062	8X magnification
Forceps Dumont#7	WPI	14097	For dissection steps
Transfer pipette 1ml Samso	Samso	043231
1.5 ml tubes	Dutscher	033290