JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Abstract

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

Introduction

توفر المقايسات خلية القاعدة أداة هامة لتطوير واكتشاف عقاقير جديدة مضادة للسرطان. 1،2 تاريخيا، وقد استخدمت الثقافات أحادي الطبقة من الخلايا السرطانية للتحقيق كفاءة مركبات مرشح ضد أنواع معينة من الخلايا السرطانية. سهولة الصيانة الثقافات أحادي الطبقة في لوحات ثقافة القياسية، والتوافق لوحات القياسية مع الأدوات الروبوتية التجارية لإضافة الكواشف، ومع معدات الفحص لتحليل المصب من الاستجابات الخلوية إلى المركبات الكيميائية هي الفوائد الرئيسية التي تجعل الثقافات 2D أداة جذابة لاختبار المخدرات 3. لسوء الحظ، غالبا ما تفشل المقايسات خلية أحادي الطبقة التنبؤ فعالية من المركبات في الجسم الحي، مما يجعل تطوير العقاقير واكتشاف عملية مكلفة للغاية. وعلى الرغم من 4،5 استثمارات كبيرة وجهد من قبل شركات الأدوية والوحدات الأكاديمية، فقط ~ 1٪ المضادة للسرطان تمت الموافقة على المخدرات في التجارب السريريةمن قبل FDA على مدى العقدين الماضيين. 6 التفاوت بين الثقافات 2D و 3D البيئة المعقدة من الخلايا السرطانية في الجسم الحي هو أحد أوجه القصور الرئيسية لنظم الاستزراع أحادي الطبقة. 7 لذلك، وفحص المركبات مرشح ضد الخلايا السرطانية في الإعداد الذي أكثر شبها البيئة الورم 3D قد تعجل تطوير عقاقير العلاج الكيميائي الرواية. 8

الأجسام الشبه الكروية الخلايا السرطانية تقديم نموذج ورم 3D ذات الصلة في المختبر. 9،10 الأجسام الشبه الكروية هي مجموعات المدمجة التي تشكل من خلال التجمع العفوي أو المتعمد من الخلايا السرطانية على الأسطح غير ملتصقة أو في تعليق باستخدام تقنيات مثل قارورة الدوار، تراكب السائل، والصغرى microfabricated . كذلك المصفوفات، على microfluidics، وقطرات شنقا 11-16 الأجسام الشبه الكروية تحاكي الملامح الرئيسية الأورام الصلبة بما في ذلك الهندسة والنقل محدود من الأكسجين والمغذيات، والمركبات المخدرات في المنطقة الوسطى. وبالتالي، فإنها تتجدد بشكل وثيق respon المخدراتحد ذاته من الأورام الصلبة مقارنة الثقافات أحادي الطبقة. 17-19 وعلى الرغم من هذا الاستحقاق ملحوظة، لا تستخدم الأجسام الشبه الكروية بشكل روتيني لفحص المركبات الكيميائية ضد الخلايا السرطانية. صعوبة إنتاج الأجسام الشبه الكروية موحدة الحجم في إعداد إنتاجية عالية القياسية التي تتوافق مع الروبوتات المتاحة تجاريا وأدوات الفحص / التصوير تعرقل إدماج ثقافة كروي في خط أنابيب تطوير الأدوية. على الرغم من أن المواد المخصصة لوحات وأصبحت في الآونة الأخيرة المتاحة تجاريا لتلبية هذه الحاجة، اعتبارات التكلفة ردع استخدامها على نطاق واسع.

اثنين من التقنيات الرئيسية لديها القدرة على إنتاج الأجسام الشبه الكروية متناسقة الحجم في إنتاجية عالية استخدام منصة قطرة شنقا جديدة وmicrofabricated الآبار الصغيرة. 13،16،20 ومع ذلك، كلا النهجين تتطلب لوحات والأجهزة التي هي مكلفة لصنع وغير مريح للمستخدمين النهائيين الخاصة في مراكز البحوث الأساسية والصناعات الدوائية حيث EF معظم كبارمصنوعة الحصون لاكتشاف عقاقير جديدة مضادة للسرطان. وعلى الرغم من بعض التحسن في استقرار قطرات تحتوي على خلية مع تصميم حديث من شنقا لوحات قطرة، لا تزال تستخدم فقط كل حفرة الآخر من لوحة خلال ثقافة لتجنب انتشار / دمج قطرات. 16 هذا يقلل بشكل ملحوظ الإنتاجية التجريبية. إدمان المخدرات والتجديد صعبة مع دليل أو pipetting لالروبوتية وتحتاج إلى أن يتم تحويلها إلى لوحة القياسية لتحليل الكيمياء الحيوية الكروية لهذا التكوين لوحة غير متوافق بسهولة مع معدات الفحص التقليدية مثل لوحة القراء. ملفقة 21 مايكرو الآبار باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة أيضا سماح حجم تسيطر إنتاج كروي. 13،20 ومع ذلك، عدم توافق هذه المنصة مع الأدوات القياسية pipetting ليمنع علاج من الأجسام الشبه الكروية الفردية مع مختلف المركبات الدوائية / تركيزات، وفضح كل الأجسام الشبه الكروية إلى حالة معاملة واحدة. وهكذا، وهذه الطريقة ليست مناسبة لارتفاعفحص مجمع الخرج الذي يتطلب الاختبار في وقت واحد من المركبات متعددة / التركيزات.

للتغلب على هذه العقبات، وقد تم تطوير تقنية جديدة لإنتاج إنتاجية عالية من الحجم باستمرار الكروية الخلايا السرطانية في لوحات 96-جيدا القياسية. 22،23 ويستند هذا النهج على نظام مائي على مرحلتين البوليمر (ATPS) مع البولي ايثيلين جلايكول ( وقد تم مؤخرا استخدمت PEG) وديكستران (DEX)، والبوليمرات التي تشكل المرحلة 24 ATPSs في مجموعة متنوعة من التطبيقات البيولوجية خلية جديدة لتمكين micropatterning الخلية والمترجمة تسليم الكواشف البيولوجية للخلايا في الوسط المائي للغاية. 25-32 تشكيل ل كروي، يتم خلط الخلايا السرطانية مع المرحلة DEX المائية وانخفاض-ميكروليتر الفرعية لتعليق الناتجة من pipetted إلى تحتوي أيضا على الغمر المائي حل المرحلة PEG. يبقى قطرة إمتزاج من مرحلة الغمر والخلايا حدود لتسهيل تشكيل كروي. عفريتortantly، مرحلة الغمر المائي للغاية توفر المواد المغذية للخلايا كروي ويقلل من مشكلة معروفة من التبخر وسائل الإعلام المشتركة لبعض المقايسات الأخرى التي تسبب التغيرات في الأسمولية وسائل الإعلام وتقلبات تركيزات المخدرات. هذه التقنية تتيح إنتاج كروي والعلاج من تعاطي المخدرات فقط باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا وأدوات pipetting لفي لوحات 96-جيدا القياسية. الأهم من ذلك، يتم إجراء تحليل الاستجابات الخلوية من الأجسام الشبه الكروية في نفس لوحة باستخدام فحوصات البيوكيميائية القياسية والقراء لوحة. سهولة العمل مع ATPS والقدرة على التكيف للنهج لمعالجة السائل الروبوتية يجعل الجيل إنتاجية عالية من كلا أحادية الثقافة وشارك في الثقافة الكروية تقنية المختبرات مباشرة. وهذا النهج الجديد سيكون خطوة كبيرة إلى الأمام نحو تكامل الكروية الخلايا السرطانية في عمليات التنمية المخدرات والاكتشاف مع تحسين الإنتاجية الاختبار وفعالية التكاليف (زيادة أعداد المركبات وredu اختباراستهلاك دائرة الهندسة المدنية كاشف) والكفاءة (خفض اليدين في الوقت المحدد).

يوصف بروتوكول مفصل لإنتاج الروبوتية من الأجسام الشبه الكروية الخلايا السرطانية في لوحات 96-جيدا باستخدام نهج ATPS أدناه. وبالإضافة إلى ذلك، يتم عرض تفاصيل العلاج من تعاطي المخدرات من الناتج الكروية وتحليل المصب من الاستجابات الخلوية باستخدام مقايسة البيوكيميائية التجاري.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد البوليمرية مائي نظام المرحلة الثانية (ATPS)

  1. تزن 0.5 غرام من غليكول البولي ايثيلين (PEG) (MW: 35،000) وإضافته إلى 9.5 مل من كامل متوسطة النمو في العقيمة 15 مل المخروطية لإعداد 10 مل من 5٪ (ث / ت) المرحلة PEG المائية.
    ملاحظة: إضافة نصف المتوسط ​​إلى المخروطية الأولى تليها إضافة البوليمر ثم المبلغ المتبقي من المتوسط ​​يقلل من التصاق البوليمر على الجدران المخروطية ويساعد البوليمر تذوب بشكل أسرع.
  2. تزن 0.128 غرام من ديكستران (DEX) (MW: 500،000) وإضافته إلى 0.872 مل من كامل متوسطة النمو في أنبوب معقم microcentrifuge 1.5 مل لإعداد 1 مل من 12.8٪ (ث / ت) مرحلة التنفيذ المباشر المائية.
  3. دوامة كلا حلول لحوالي 1 دقيقة لإذابة البوليمرات في المتوسط.
  4. إبقاء كلا حلول في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لضمان حل ومخاليط متجانسة. الحفاظ على أغطية فوق مستوى المياه لتجنب احتمال التلوث من الحلول من الحمامالمياه.
  5. تحميل حل المرحلة PEG إلى معقمة، المحاقن البلاستيكية وتمريرها من خلال مرشح حقنة من 0.2 ميكرومتر حجم المسام لإزالة الشوائب.
    ملاحظة: ملء المحاقن مع الحل PEG، وضعه في إدراج للمرشح على رأس أنبوب مخروطي الشكل واستخدام القوة، ودفع ببطء الحل من خلال مرشح. فمن الطبيعي أن تواجه مقاومة ضد حركة المكبس حقنة. خسارة طفيفة من الحل البوليمر تحدث عن بعض من الحل سيبقى في التصفية، إلا أن تركيز البوليمر لن تتغير.
  6. ماصة 10 ميكرولتر من الحل مرحلة التنفيذ المباشر وتمييع في 10 ميكرولتر من المتوسط ​​في أنبوب منفصل أن يؤدي إلى 6.4٪ (ث / ت) حل المرحلة DEX. نضح 100 ميكرولتر من محلول المرحلة PEG والاستغناء عليه في طبق بتري.
    1. الاستغناء 0.5 ميكرولتر من 6.4٪ (ث / ت) حل المرحلة DEX في حل المرحلة PEG. تأكيد بصريا تشكيل ATPS ناجحة من خلال مراقبة هبوط DEX تحت المجهر. انخفاض الحدودينبغي أن تظل مرئية، مشيرا إلى وجود اثنين مستقرة، المراحل المائية منفصلة.
  7. تخزين مخزون مائي PEG وحلول مرحلة التنفيذ المباشر في 4 ° C حتى الاستخدام.
    ملاحظة: من المستحسن أن الحلول البوليمر يتم إعداد العذبة قبل كل تجربة وتستخدم خلال 24 ساعة من التخزين.

2. إعداد للطباعة من السرطان الأجسام الشبه الكروية خلية

  1. تنمو الخلايا السرطانية من الفائدة (على سبيل المثال، والخلايا MDA-MB-157 سرطان الثدي) إلى 90٪ -100٪ متموجة أحادي الطبقة. لMDA-MB-157 الخلايا، واستخدام وسيلة تتألف من DMEM تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ الجلوتامين، و 1٪ للمضادات الحيوية.
    1. حصاد الخلايا باستخدام تفارق العازلة الخلية (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة) وتحميل تعليق في مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 173.3 x ج، وإزالة طاف، وخلايا resuspend في 1 مل من كامل متوسطة النمو.
  2. خلايا الحمل على عدادة الكريات ونعدهم لحساب العدد المطلوبخلايا لكثافة الخلايا كروي المطلوب. أحادي الطبقة متموجة من MDA-MB-157 الخلايا المزروعة في قارورة T75 عادة ما يعطي ~ 7 × 10 6 خلايا.
    ويوصى كثافة الخلايا المطلوبة لحجم قطرة لتوليد سوف كروي واحد يعتمد على نوع من الخلايا 22 على سبيل المثال، كثافة 1.5 × 10 4 أو أكبر لMDA-MB-157 خلية لكل ميكرولتر 0.3 قطرة مرحلة التنفيذ المباشر ل: ملاحظة. ضمان تشكيل كروي واحد.
  3. خلايا الطرد المركزي للمرة الثانية لمدة 5 دقائق عند 173.3 x ج و resuspend لهم في حجم مناسب من النمو المتوسطة لتركيز تعليق لكثافة الخلايا المطلوبة.
    ملاحظة: على سبيل المثال إذا كانت تحصد 7 × 10 6 خلايا السرطان، والحجم الكلي للتعليق الخلية المطلوبة لتشكيل كروي الكثافة 1.5 × 10 4 خلية في 0.3 ميكرولتر DEX انخفاض المرحلة ستكون 140 ميكرولتر. ولكن نظرا لتخفيف مع الحل مرحلة التنفيذ المباشر في الخطوة التالية، استخدم فقط 70 ميكرولتر من مستنبت الخلية ل resuspend الخلايا.
  4. إضافة إلى تعليق الخلية الناتجة حجم مساو من 12.8٪ (ث / ت) حل المرحلة DEX المائية أعد في 1.2. للمثال من كثافة 1.5 × 10 4 خلية كروي، يتم إضافة 70 ميكرولتر من محلول المرحلة DEX إلى 70 ميكرولتر من التعليق الخلية.
  5. تخلط جيدا تعليق خلية لضمان توزيع موحد للخلايا وخلط حل DEX. وينبغي أن يتم pipetting صعودا وهبوطا بلطف لمنع تشكيل فقاعة.

3. إعداد للطباعة من الأجسام الشبه الكروية المشارك مثقف

  1. تنمو الخلايا السرطانية (على سبيل المثال، MDA-MB-157 خلايا سرطان الثدي البشرية) وخلايا الدعم (على سبيل المثال، الخلايا الليفية الإنسان) إلى 90٪ -100٪ متموجة أحادي الطبقة. حصاد كل نوع من الخلايا باستخدام تفارق العازلة الخلية (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة).
    1. تحميل كل تعليق في المخروطية 15 مل، أجهزة الطرد المركزي لهم لمدة 5 دقائق على 173.3 x ج، ونضح طاف من كل المخروطية. Resuspend الخلايا المخروطية في كل 1 مل من ز الكاملrowth المتوسطة.
      ملاحظة: الأصباغ الفلورية مثل Calcein AM (وصمة عار الخلية الحية) والأصباغ النووية (هويشت) يمكن استخدامها للتمييز بين أنواع الخلايا اثنين.
  2. تحميل كل نوع من الخلايا بشكل منفصل على عدادة الكريات ونعدهم لحساب العدد المطلوب من كل نوع من الخلايا لنسبة المطلوب من الخلايا السرطانية الى دعم الخلايا في الأجسام الشبه الكروية شارك في تربيتها. الطبقات الوحيدة متموجة من MDA-MB-157 الخلايا والخلايا الليفية التي تزرع في قوارير T75 عادة ما تعطي ~ 7 × 10 6 و~ 6 × 10 6 خلايا، على التوالي.
  3. إضافة وحدة التخزين الصحيحة عن تعليق دعم الخلايا لخلايا السرطان تعليق لإعطاء نسبة المرجوة من عدد من أنواع الخلايا اثنين. على سبيل المثال، استخدام نسبة من 50 خلايا السرطان إلى 1 الخلية الليفية.
  4. الطرد المركزي المخروطية التي تحتوي على تعليق خلية مختلطة لمدة 5 دقائق عند 173.3 x ج و resuspend الخلايا في حجم مناسب لتؤدي في الكثافة النهائية التي تتألف من كميات متساوية من نمو المتوسطة و12.8٪ (ث / ت) DEX مائيحل المرحلة (المعد في 1.2).
  5. ماصة بلطف تعليق الخلية مما يؤدي إلى أعلى وأسفل لضمان تجانس تعليق.

4. طباعة الأجسام الشبه الكروية ورم في لوحة 96-جيدا

  1. قبل يوم واحد إلى التجارب، ومعطف، جولة القاع لوحات 96-جيدا غير المعالجة مع 1٪ (ث / ت) Pluronic عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. هذا الطلاء يمنع مرفق الخلية خلال الفترة الثقافة.
  2. الاستغناء 50 ميكرولتر من تصفيتها 5٪ (ث / ت) المرحلة PEG المائية في كل بئر من لوحة 96-جيدا (لوحة الوجهة).
  3. باستخدام ماصة، مزيج تعليق خلية (المعد في الخطوة 2 أو الخطوة 3 لأحادية وشارك في الثقافة، على التوالي)، وإضافة 20 ميكرولتر من تعليق على كل البعض جيدا من عمود واحد من لوحة 384 جيدا (لوحة المصدر) .
  4. تشغيل معالج السائل و"الوطن" رئيس pipetting للتسجيل الإحداثيات. ثم ترجمة بروتوكول المحددة سابقا (أقل من 4.6 في) لضمان معدات المختبرات ويتم تعريف المعلمات الصحيحلاي. هذا "صاروخ موجه" خطوة قد تكون مختلفة لمختلف معالجات السائلة.
    ملاحظة: تدفق البروتوكول، كما هو موضح خطوة بخطوة أدناه في 4.6، سوف تكون مشابهة بغض النظر عن معالج السائل الروبوتية المستخدمة؛ ومع ذلك، فإن واجهة برمجة قد تبدو مختلفة نظرا لاستخدام البرامج المختلفة.
  5. وضع لوحة مصدر، لوحة جهة، وصناديق ماصة الموجودة بالمواقع المحددة على محطة العمل من معالج السائل كما هو مبين في الشكل (1).
  6. تنفيذ البروتوكول الذي يتضمن الخطوات التالية:
    1. تحميل عمود واحد من برميل من الرأس pipetting لمن معالج السائل مع خلط نصائح ماصة (8 نصائح) من محطة العمل (الشكل 1).
    2. مزيج تعليق خلية في الآبار من لوحة المصدر (الشكل 1). تحديد حجم الخلط أصغر من حجم تعليق خلية في الآبار لتجنب تشكيل فقاعة.
    3. إخراج نصائح إلى مربع نصائح النفايات فارغة (الشكل 1).
    4. تحميل عمود واحد من برميل من الرأس pipetting لمع 10 ميكرولتر الاستغناء نصائح ماصة (الشكل 1).
    5. نضح 0.3 ميكرولتر من تعليق خلية من لوحة المصدر (الشكل 1) في كل طرف ماصة.
    6. الاستغناء تعليق خلية في آبار من عمود واحد من لوحة الوجهة (الشكل 1). استخدام ارتفاع الاستغناء 0.5 ملم ومعدل التدفق من الاستغناء أصغر من 1 ميكرولتر / ثانية.
    7. كرر الخطوات من 4.6.1 خلال 4.6.6 حتى الطباعة العمود تلو العمود في لوحة المقصد كلها كاملة.
  7. إزالة بعناية لوحة جهة من سطح محطة العمل ووضعه في حاضنة الرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. الحفاظ على لوحة الأفقي عندما حملها في الحاضنة لتجنب تعطيل قطرات المرحلة DEX التي تحتوي على الخلايا.
  8. احتضان لوحة لمدة 24 ساعة للسماح تجميع الخلايا في كروي داخل قطرة مرحلة التنفيذ المباشر.
<ص الطبقة = "jove_title"> 5. العلاج من تعاطي المخدرات من السرطان الأجسام الشبه الكروية خلية

لاحظ أن البروتوكول التالي هو لمعالجة مدمني المخدرات 4 أيام ويتضمن التجديد مع المخدرات الجديدة بعد يوم 2. ويمكن تعديل لفترات العلاج الأخرى.

  1. تأكيد بصريا تشكيل كروي في لوحات 96-جيدا بعد 24 ساعة. إذا لزم الأمر، والآبار صورة لقياس حجم الأجسام الشبه الكروية عن طريق حساب متوسط ​​أصغر وأكبر بأقطار من كل كروي.
  2. إعداد محلول المخزون من دواء المطلوب حلها من قبل في مذيب الموصى بها من قبل الشركة المصنعة في تركيز الذوبان محددة سلفا. على سبيل المثال، ويحل سيسبلاتين في الماء عند 2 ملغ / مل.
    ملاحظة: حماية محلول المخزون من المخدرات من الضوء إذا كان الدواء هو حساسة للضوء.
  3. باستخدام تقنية التخفيف التسلسلية، وإعداد تركيزات الدواء المخفف مع زراعة الخلايا المتوسطة من حل الأوراق المالية على استعداد في الخطوة السابقة. وينبغي بذل كل تخفيف ضعف التركيز المطلوب. ديلوتختلف نسب ution اعتمادا على تركيز الأسهم تبدأ ورغبتك فى تركيزات العمل.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من محلول الدواء أعدت في الخطوة السابقة إلى كل بئر. ويمكن القيام بذلك آليا أو من قبل pipetting اليدوي.
    ملاحظة: سيتم تخفيفه كل تركيز الدواء في نصف إلى التركيز المطلوب من قبل 50 ميكرولتر المرحلة PEG المائية بالفعل في كل بئر.
    1. استخدام الأجسام الشبه الكروية من عمودين من لوحة 96-جيدا (ن = 16) لكل تركيز.
    2. في آبار المراقبة، إضافة فقط 50 ميكرولتر من مستنبت الطازجة إلى 50 ميكرولتر الحالية للمرحلة PEG المائية.
  5. احتضان الأجسام الشبه الكروية مع المخدرات لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، محمية من الضوء.
  6. بعد 48 ساعة من الحضانة، وإعداد التخفيفات جديدة من المخدرات بتركيزات المطلوبة وتجديد المخدرات عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من محلول الدواء الطازجة إلى كل بئر.
    ملاحظة: هذه الآبار تحتوي بالفعل على تركيز الدواء المطلوب من الأول ر المخدراتreatment. لذلك في هذه المرحلة التجديد، يتم تحضير كل التركيز على التركيز المطلوب نظرا لعدم التخفيف سيحدث.
  7. احتضان الأجسام الشبه الكروية مع المخدرات لمدة 48 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، محمية من الضوء.

6. تحليل الجدوى الخلوية في الأجسام الشبه الكروية

  1. بعد 48 ساعة من الحضانة مع تجدد المخدرات (أي الوقت الكلي للعلاج الأجسام الشبه الكروية مع المخدرات 4 أيام)، وقياس إجمالي حجم المتوسطة في واحدة بشكل جيد من قبل pipetting اليدوي.
    ملاحظة: حجم نموذجي في بئر واحدة هي ~ 140 ميكرولتر (يحدث انخفاض طفيف بسبب التبخر).
  2. حساب حجم خلية الجدوى كاشف (على سبيل المثال، PrestoBlue)، وتركيز 10٪ من حجم إجمالي جيدا. إضافة هذا الحجم من بقاء الخلية الكاشف إلى كل بئر.
    ملاحظة: مع حجم وسائل الاعلام القائمة من 140 ميكرولتر في بئر، مطلوب وبلغ حجم التداول 15.6 ميكرولتر لإعطاء تركيز 10٪ من إجمالي جيدا. ويتم احتساب ذلك من خلالتقسيم حجم الإعلامية القائمة بنسبة 9 (140 ميكرولتر / 9 = 15.6 ميكرولتر).
  3. احتضان لوحة مع كاشف بقاء الخلية تضاف إلى كل بئر لمدة 6 ساعة عند 37 درجة مئوية، محمية من الضوء.
  4. وضع لوحة في قارئ لوحة صغيرة وقراءة إشارة مضان في 560 نانومتر و 590 نانومتر الإثارة وانبعاث موجات، على التوالي.
  5. حساب الجدوى في المئة من الخلايا في الأجسام الشبه الكروية التي كتبها تطبيع إشارة الفلورسنت من الآبار التي تمت معالجتها لتلك الآبار السيطرة بعد حساب متوسط ​​القيم من شروط المعاملة نفسها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويرد محطة العمل من معالج السائل الروبوتية في الشكل 1. وقال رئيس pipetting لوصفت جميع المحطات المستخدمة في الطباعة الروبوتية من الأجسام الشبه الكروية في القسم 4.6. تظهر الصورة استخدام اثنين من محطات مختلفة لمربعات طرف (مجموعة واحدة من النصائح لخلط والمجموعة الثاني...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الأجسام الشبه الكروية تقديم نموذج واقعي لفهم أفضل لعلم وظائف الأعضاء الورم ونجاعة الأدوية وتوفير أداة مفيدة لمكافحة السرطان اكتشاف الأدوية. ان مثل هذه التطبيقات تستفيد كثيرا من التقنيات البسيطة جيل كروي والصيانة التي تتطلب سوى معدات المختبرات القياسية، والتعامل م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, MW: 35,000Sigma-Aldrich94646
Dextran, MW: 500,000Pharmacosmos5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6429
Fetal Bovine SerumSigma-Aldrich12306C
GlutamineLife Technologies35050-061
AntibioticLife Technologies15240-062
Clacein AMLife TechnologiesC3100MP
HoechstLife Technologies33342
CisplatinSpectrum Chemicals15663-27-1
PrestoBlueLife TechnologiesA-13261
Pluronic F-108Sigma Aldrich542342
Disposable Tips (10 µl)FluoticsC-P10V11.ST
Disposable Tips (70 µl)FluoticsC-P70V11.ST
Round-bottom 96-well platesNunc268200
Equipment
Liquid HandlerAgilent TechnologiesSRT Bravo
Microplate ReaderBiotek InstrumentsSynergy H1M

References

  1. Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
  2. Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).
  3. Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
  4. Gidrol, X., et al. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).
  5. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).
  6. Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK. BMJ Open. 3, (2013).
  7. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
  8. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
  9. Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).
  10. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
  11. Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).
  12. Wartenberg, M., et al. Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells. FASEB J. 15, 995-1005 (2001).
  13. Tekin, H., et al. Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates. Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).
  14. Patra, B., et al. A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis. Biomicrofluidics. 7, 54114(2013).
  15. Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat. Commun. 5, 4250(2014).
  16. Hsiao, A. Y., et al. Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates. Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).
  17. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).
  18. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).
  19. Minchinton, A., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumors. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
  20. Jeong, G. S., et al. Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies. Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).
  21. Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids. JALA. 19, 208-214 (2014).
  22. Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids. Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).
  23. Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture. Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).
  24. Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. Phase diagrams. Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).
  25. Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems. J. Vis. Exp. (73), (2013).
  26. Frampton, J. P., et al. Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA. Sci. Rep. 4, 4878(2014).
  27. Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions. Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).
  28. Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system. Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).
  29. Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).
  30. Tavana, H., et al. Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies. Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).
  31. Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).
  32. Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).
  33. Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
  34. Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts. BMC Cancer. 10, 444(2010).
  35. Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).
  36. Hsiao, A. Y., et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids. Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).
  37. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).
  38. Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).
  39. Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).
  40. Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

98 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved