약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

요약

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

초록

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

서문

세포 기반 분석법을 개발 및 새로운 항암 약물의 발견을위한 중요한 도구를 제공한다. ^1,2 역사적으로, 암 세포의 단층 배양 물은 암 세포의 특정 유형에 대한 후보 화합물의 효과를 조사하기 위해 사용되어왔다. 표준 배양 플레이트에 단층 문화의 유지 보수의 용이성, 시약을 첨가 한 상용 로봇 도구와 표준 플레이트의 호환성 및 화학 물질에 대한 세포 반응의 다운 스트림 분석을위한 검사 장비와는 2D 문화에게 매력적인 도구를 렌더링의 주요 장점은 약물 테스트를 위해. ³ 불행하게도, 단층 세포 분석은 종종 신약 개발과 발견을 매우 비용이 많이 드는 과정을, 생체 내에서 화합물의 효능을 예측하지 못한다. ^4,5 제약 회사 학술 단위, 만 ~ 1 %로 상당한 투자와 노력에도 불구하고 항암제의 임상 시험에서 약물이 승인되었다지난 20 년간 FDA에 의해. 차원 배양 및 생체 내에서 암세포의 복잡한 3D 환경 사이 ⁶ 격차가 단층 배양 시스템의 주요 단점이다. ⁽⁷⁾ 따라서, 설정에서 종양 세포에 대한 후보 화합물 스크리닝은 더 밀접하게 닮았다 3D 종양 환경은 새로운 화학 요법 약물의 개발을 촉진 할 수있다. ⁽⁸⁾

암세포 타원체는 시험관 내에서 중요한 3D 종양 모델을 제시한다. ^9,10 타원체는 비 - 부착 표면 또는 스피너 플라스크, 액체 오버레이, 미세 마이크로 같은 기법을 사용하여 현탁액 중의 암세포의 자발 또는 유도 조립체를 통해 형성 컴팩트 클러스터 아르 . 어레이, 미세 유체 및 매달려 방울도 ^{11 ~ 16} 타원체는 형상과 중앙 영역에 산소, 영양분, 약물 화합물의 제한으로 전송을 포함한 고형 종양의 주요 기능을 모방; 따라서, 그들은 더 밀접하게 약물 respon를 재생단층 문화에 비해 고형 종양의 자체.이 현저한 이점에도 불구하고 ^{17 ~ 19,} 타원체 정기적으로 암 세포에 대한 화학 물질의 스크리닝에 사용되지 않습니다. 상업적으로 이용 가능한 로봇 및 심사 / 이미징 도구와 호환되는 표준 높은 처리량 설정에서 균일 한 크기의 타원체를 생산 난이도는 신약 개발 파이프 라인으로 회전 타원체 문화의 결합을 방해. 사용자 정의 재료와 플레이트는 최근 이러한 요구를 해결하기 위해 시중에서 판매되고 있지만, 비용을 고려은 광범위한 사용을 방지.

새로운 매달려 드롭 플랫폼과 미세 마이크로 우물을 사용하여 높은 처리량의 일관된 크기의 타원체를 생산하는 기능이있는 두 가지 주요 기술. ^13,16,20 그러나, 두 가지 접근 방식은 특별한 접시와 제작이 비싸고 엔드 포인트 사용자를위한 불편 장치가 필요 핵심 연구 센터 및 제약 산업 대부분의 주요 EF에서새로운 항암 약물의 발견을위한 요새가 만들어진다. 드롭 플레이트 매달려의 최근 디자인 세포 함유 방울의 안정성에 약간의 개선에도 불구하고, 판 매 다른 구멍은 여전히 방울의 확산 / 병합을 방지하기 위해 문화 중에 사용됩니다. ^(16)이 크게 실험 처리량을 감소시킨다. 의약품 추가 및 갱신은 수동 또는 로봇 피펫으로 어려운이 판 구성은 플레이트 리더로 기존의 검사 장비와 쉽게 호환되지 않기 때문에 타원체는 생화학 적 분석을위한 표준 플레이트에 전달 될 ​​필요가있다. ⁽²¹⁾ 마이크로 웰은 또한 소프트 리소그래피를 사용하여 제작 제어 크기 회전 타원체 생산을 할 수 있습니다. ^{13, 20을하지만,} 표준 피펫 팅 툴이 플랫폼의 호환성은 단일 처리 조건에 모든 구 상체를 노출, 다른 약 화합물 / 농도 개별 타원체의 치료 방지 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 높은 적합하지 않다여러 화합물 / 농도의 동시 테스트를 필요로 처리 화합물 스크리닝.

이러한 장애를 극복하기 위해, 표준 96 웰 플레이트에서 일관 크기 암세포 타원체의 높은 처리량의 생산을위한 새로운 기술이 개발되었다. ^{22, 23} 접근법은 폴리에틸렌 글리콜 중합체 수성 개의 상 시스템 (ATPS ()에 기초 상 형성 중합체와 같은 PEG)과 덱스 트란 (DEX). ⁽²⁴⁾ ATPSs는 최근 셀의 미세화를 가능하게하는 새로운 세포 생물학적 다양한 응용 분야에 활용이 높은 수성 미디어의 셀에 생물학적 시약의 전달을 현지화하고있다. ^{25 ~ 32을} 형성하기 회전 타원체가 암세포 DEX 수성 상과 현탁액의 서브 드롭 마이크로 리터와 혼합이 잘 함유 수성 침지 PEG 용액 상으로 피펫 팅한다. 드롭 타원체의 형성을 용이하게하기 위해 침지 위상 및 경계 셀에서 혼화 남아있다. 꼬마 도깨비ortantly, 높은 수성 침지 단계는 회전 타원체의 세포에 영양분을 제공하며, 미디어 삼투압 변화 및 ​​약물 농도의 변동을 일으키는 다른 분석법에 공통 매체 증발의 잘 알려진 문제를 최소화한다. 이 기술은 회전 타원체 생산에만 표준 96- 웰 플레이트에서 시판 시약 피펫 팅 도구를 사용하여 약물 치료를 가능하게한다. 중요한 것은, 타원체의 세포 반응의 분석은 표준 생화학 검정 및 플레이트 판독기를 사용하여 동일한 플레이트에서 수행된다. 로봇 액체 처리에 대한 접근 방식의 ATPS과 적응성 작업의 용이성 모노 문화 및 공동 문화 모두의 높은 처리량 생성이 간단 실험실 기술을 타원체 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 개선 된 테스트 처리량 및 테스트 화합물과 redu의 수가 증가 비용 효율성 (와 약물 개발 및 검색 프로세스에 암 세포 타원체의 통합을 향해 앞으로 중요한 단계가 될 것입니다CED 시약 소비)과 효율성 (시간에 손을 감소).

ATPS 접근법을 사용하여 96- 웰 플레이트에서 암세포 타원체의 로봇 제조 상세한 프로토콜 설명한다. 또한, 얻어진 타원체와 상용 생화학 분석을 이용하여 세포 반응의 분석 하류의 약물 치료의 세부 사항이 제시된다.

프로토콜

고분자 수성 2 단계 시스템 1. 준비 (ATPS)

1. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (MW : 35,000) 0.5 g을 달아 수성 PEG 단계 (/ V W) 5 % 10 ㎖를 제조 멸균 15ml의 원뿔에서 완전 성장 배지 9.5 ml의 추가.
   주 : 제 중합체를 추가하고 그 다음에 원뿔형 배지의 절반을 추가하는 것은 그 다음 매체의 잔량이 원추형 벽 중합체의 접착 성을 최소화하고, 중합체가 더 빨리 용해 돕는다.
2. 덱스 트란 (DEX) 0.128 g (MW : 500,000)를 달아 12.8 % (w / v)의 수용액 DEX 상 1 ㎖를 제조 멸균 1.5 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브에 완전 성장 배지의 0.872 ml의 추가.
3. 약 1 분 동안 와동 두 솔루션 배지에서 중합체를 용해.
4. 용해 및 균질 혼합물을 보장하기 위해 1 시간 동안 37 ℃에서 수욕에서 두 솔루션 유지. 목욕의 솔루션의 오염 가능성을 방지하기 위해 물 수준의 위 뚜껑을 유지물.
5. 멸균 플라스틱 주사기 내로 PEG 상 용액을로드 및 불순물을 제거하기 위해 0.2 ㎛의 공극 크기의 주사기 필터를 통해 전달한다.
   천천히 필터를 통해 솔루션을 밀어, PEG 용액을 주사기를 채우기 원뿔 튜브의 상단과 힘을 사용하는 방법에 대한 필터의 삽입에 배치 참고. 그것은 주사기 플런저의 움직임에 대한 저항을 경험하는 정상입니다. 용액의 일부는 필터에 남아 있지만, 중합체의 농도가 변화하지 않으므로 중합체 용액 경미한 손실이 발생한다.
6. 피펫 10 DEX 위상 솔루션의 μL 및 별도의 튜브에 매체의 10 μL에 희석은 6.4 % (w / v)의 DEX 단계 솔루션을 초래할 수 있습니다. 대기음 100 PEG 상 용액 μL 및 페트리 접시로 분배.
   1. PEG 용액 상으로 DEX 상 용액 (V / w) 6.4 % 0.5 μl를 분배. 시각적으로 현미경 DEX 강하를 관찰하여 성공적인 ATPS 형성을 확인합니다. 드롭 경계두 안정, 별도의 수성 단계의 존재를 나타내는, 계속 표시해야합니다.
7. 사용할 때까지 4 ° C에서의 주식 수성 PEG와 DEX 단계 솔루션을 저장합니다.
   주 : 폴리머 솔루션은 이전에 각 실험에 신선한 준비 및 보관 24 시간 내에 사용하는 것이 좋습니다.

인쇄 암의 세포 타원체 2. 준비

1. 90 % -100 %의 융합 성 단층 관심 (예를 들면, MDA-MB-157 유방암 세포)의 암세포 성장. MDA-MB-157 세포, DMEM은 10 % FBS, 1 %의 글루타민, 및 1 % 항생 물질을 함유 이루어지는 매체를 사용한다.
   1. (제조사의 프로토콜에 따라)과 15 ML 원뿔에 서스펜션을로드 셀 분리 버퍼를 사용하여 수확 세포. , 173.3 XG에서 5 분 정도 원심 분리기 뜨는을 제거하고, 재현 탁 세포 완전한 성장 배지 1 ㎖에.
2. 로드셀 상 혈구 계산하고이를 원하는 숫자를 계산하는원하는 회전 타원체 세포 밀도에 대한 세포의. T75 플라스크에 성장 MDA-MB-157 세포의 합류 단층은 보통 ~ 7 × 10 ⁶ 세포를 제공합니다.
   주 :. 1.5 × ¹⁰⁴ 또는 MDA-MB-157 세포에 대한 큰 방울 체적에 필요한 세포 밀도가 단일 회전 타원체는 세포 유형에 의존 할 것이다 생성하기 위해 예를 들어 ^22, 밀도는 0.3 μL DEX 위상 드롭 당 권장 단일 회전 타원체의 형성을 보장합니다.
3. 173.3 XG에서 5 분 동안 원심 분리 두번째 세포 및 원하는 세포 밀도로 현탁 집중 성장 배지의 적당한 용적에 재현 탁 그들을.
   참고 : 7 × ¹⁰⁶ 암세포 수확 예를 들어, 0.3 μL의 DEX 위상 강하는 1.5 × ¹⁰⁴ 세포 밀도의 타원체를 형성하는데 필요한 세포 현탁액의 총 부피는 140 μL 것이다. 그러나 인해 다음 단계에서 DEX 상 용액으로 희석 만 세포를 재현 탁하는 세포 배양 배지의 70 μl를 사용한다.
4. 12.8 %의 동일 부피 (w / v)의 수용액 DEX 상 용액 1.2에서 제조 얻어진 세포 현탁액에 추가. 1.5 × ¹⁰⁴ 세포 밀도 타원체의 예를 들면, 위상 DEX 용액 70 μl의 세포 현탁액 70 μL를 첨가한다.
5. 철저히 세포 DEX 혼합 용액의 균일 한 분포를 보장하기 위해 세포 현탁액을 혼합한다. 피펫 위아래로 거품 형성을 방지하기 위해 조심스럽게 수행해야합니다.

공동 배양 타원체의 인쇄 3. 준비

1. 암 세포 성장 (예를 들어, MDA-MB-157 인간 유방암 세포) 및 90 % -100 %의 융합 성 단층을지지 세포 (예, 인간 섬유 아세포). (제조사의 프로토콜에 따라) 세포 해리 완충액을 이용하여 각 세포 유형 수확.
   1. 각 원뿔형 5 173.3 XG에 분하고, 흡인 상등액을 위해 그들을 원심 분리기, 15 ML 원뿔로 각각의 서스펜션을로드합니다. 완전한 g 1 ml의 각 원뿔의 재현 탁 세포rowth 매체.
      참고 : 예컨대 칼 세인 AM (생균 얼룩) 핵 염색 (훽스트) 형광 염료는 두 종류의 세포를 구별하는데 사용될 수있다.
2. 혈구에 별도로 각 세포 유형을로드하고 공 배양 세포 타원체를 지원하는 암세포의 원하는 비율에 대한 각각의 세포 유형의 필요한 개수를 계산하도록 계산. T75 플라스크에서 재배 합류 MDA-MB-157 세포의 단층 및 섬유 아 세포는 일반적으로 각각 ~ 7 × 10 ⁶ ~ 6 × 10 ⁶ 세포를 제공합니다.
3. 두 종류의 세포 수의 바람직한 비율을 제공하는 암 세포에 세포 현탁액을지지 현탁액으로부터 정확한 볼륨. 예를 들어, 하나의 섬유 아세포 세포에 암 세포를 50의 비율을 사용한다.
4. 원심 적절한 부피 173.3 XG 재현 탁하고 세포에서 5 분 동안 혼합 세포 현탁액을 함유하는 수성 원추형 DEX (/ V W)와 동일한 성장 배지의 부피를 12.8 %의 최종 농도로 포함하는 결과(1.2에서 준비) 단계 솔루션입니다.
5. 부드럽게 현탁액의 균질성을 확인하기 위해 위아래로 얻어진 세포 현탁액을 피펫.

96- 웰 플레이트 종양 타원체 4. 인쇄

1. 어느 날 이전에 실험에, 1 % 코트 비 처리 된 둥근 바닥 96 웰 플레이트 24 시간 동안 37 ° C에서 (w는 / v)의 플루로 닉. 이 코팅은 배양 기간 동안 세포 부착을 방지 할 수 있습니다.
2. 여과하고, 5 %의 50 μl를 분주를 96 웰 플레이트 (대상 판)의 각 웰에 PEG 수성 상 (/ V w).
3. 피펫을 사용하여, 세포 현탁액을 혼합 (2 단계 또는 각각 모노와 공동 문화에 대해 단계 3에서 제조) 및 384 웰 플레이트의 하나의 열 (소스 판)에서 잘 모든 다른 서스펜션의 20 μl를 추가 .
4. 액체 핸들러와 "홈"좌표를 등록하는 피펫 팅 머리를 켭니다. 그런 다음 실험 실용을 보장하기 위해 (4.6 이하) 이전에 정의 된 프로토콜을 컴파일하고 매개 변수가 올바른 정의LY. 이 "원점 복귀"단계는 다른 액체 핸들러 다를 수 있습니다.
   참고 : 프로토콜의 흐름, 단계별로 아래 4.6에 관계없이 사용되는 로봇 액체 핸들러의 유사합니다 표시; 그러나, 프로그래밍 인터페이스는 다른 의한 소프트웨어의 사용으로 다르​​게 보일 수있다.
5. 도 1에 도시 된 바와 같이 액체 핸들러의 워크 스테이션의 위치에 정의 된 소스 플레이트, 대상 판, 피펫 팁 및 박스를 배치.
6. 다음 단계를 포함하는 프로토콜을 실행
   1. 로드 워크 스테이션 (그림 1)에서 피펫 팁 (8 팁) 믹싱 액체 핸들러의 피펫 팅 헤드로부터 배럴 중 하나 열입니다.
   2. 소스 플레이트 (도 1)의 웰에 세포 현탁액을 혼합한다. 기포 형성을 방지하기 웰에 세포 현탁액의 부피보다 작은 혼합 볼륨을 선택.
   3. 빈 폐기물 팁 상자 (그림 1)에 팁을 꺼냅니다.
   4. 부하 10 μL 분배 피펫 팁 피펫 헤드로부터 배럴의 하나의 열 (그림 1).
   5. 대기음 각 피펫 팁으로 소스 플레이트에서 세포 현탁액 0.3 μL (도 1).
   6. 대상 판의 하나의 열 (도 1)의 웰에 세포 현탁액을 분배. 0.5 mm의 높이 및 분배 미만 1 μL / sec의 분사 유량을 사용한다.
   7. 전체 대상 플레​​이트에 컬럼 별 인쇄가 완료 될 때까지 반복 4.6.6을 통해 4.6.1 단계를 반복합니다.
7. 조심스럽게 워크 스테이션 표면에서 대상 플레이트를 제거하고 CO _2를 37 ° C에서 습기가 인큐베이터에 배치하고 5 %. 세포를 포함하는 위상 DEX 방울의 교란을 방지하기 인큐베이터로 운반시 접시 수평을 유지한다.
8. DEX 단계 드롭 내에서 회전 타원체로 세포의 응집을 할 수 있도록 24 시간 동안 접시를 품어.

5. 암 세포 타원체의 약물 치료

다음 프로토콜은 4 일간의 약물 치료이며, 그것은 다른 치료 기간을 수정할 수 있습니다 일 2. 후 신선한 약물과 갱신이 포함되어 있습니다.

1. 시각 24 시간 후 96 웰 플레이트의 회전 타원체의 형성을 확인합니다. 각 회전 타원체의 최소 및 최대 직경을 평균하여 타원체의 크기 측정을위한 이미지 우물을 필요로합니다.
2. 소정의 용해도 농도 제조사 권장 용매 및 원하는 약물의 원액을 준비한다. 예를 들어, ㎖ / 2 mg을 물에 시스플라틴을 용해.
   주 : 약물이 빛에 민감한 경우 빛으로부터 약물의 원액을 보호합니다.
3. 시리얼 희석 기술을 사용하여, 이전 단계에서 제조 스톡 용액으로부터 세포 배양 배지로 희석 약물 농도를 준비한다. 각 회 희석하여 원하는 농도가 이루어져야한다. DIL의 ution 비율은 시작 재고 농도에 따라 달라질 수 및 작업 농도를 원하는 것입니다.
4. 각 웰에 이전 단계에서 제조 된 약물 용액 50 μL를 추가한다. 이 로봇 또는 수동 피펫 팅하여 수행 할 수 있습니다.
   주 : 각 약물 농도는 각 웰에 50 ㎕의 이미 PEG 수성 상으로 원하는 농도로 반으로 희석한다.
   1. 각 농도 96 웰 플레이트 (N = 16)의 두 개의 열에서 타원체를 사용합니다.
   2. 대조군 웰에서, PEG 수성상의 기존 50 μL 신선한 배지의 50 μL를 추가한다.
5. 빛으로부터 보호 된 37 ° C에서 48 시간 및 5 % CO _2,위한 약물과 타원체 부화.
6. 배양 48 시간 후, 소정 농도의 신선한 약물 희석액을 제조하고 각 웰에 신선한 약물 용액 50 μl를 첨가하여 약제를 갱신.
   주 : 웰이 이미 제 약물 t에서 원하는 약물 농도를 포함reatment. 더 희석이 발생하지 않는 것이므로 따라서 갱신이 단계에서, 각각의 농도가 목적하는 농도로 제조한다.
7. 빛으로부터 보호 37 ° C에서 또 다른 48 시간 동안 약 5 % CO _2와 타원체를 품어.

6. 타원체의 세포 생존 능력의 분석

1. 갱신 약물 (즉, 약물과 타원체의 처리의 총 시간 4 일)와 배양 48 시간 후, 잘 매뉴얼 피펫 팅에 의해 하나의 매체의 총 부피를 측정한다.
   참고 : 하나 잘 일반적인 볼륨이 140 μl의 (작은 감소는 증발로 인해 발생) ~이다.
2. 웰 총 부피의 10 % 농도 세포 생존 시약 (예 PrestoBlue)의 체적을 계산한다. 각 웰에 세포 생존 시약이 볼륨을 추가합니다.
   주 : 웰 140 μL의 기존 미디어 부피, 15.6 μL의 부피는 웰의 총 농도 10 %를 제공 할 필요가있다. 이 계산됩니다9 (140 μL / 9 = 15.6 μL)에 의해 기존의 미디어 볼륨을 분할.
3. 빛으로부터 보호 된 37 ° C에서 6 시간 동안 각각의 웰에 첨가 세포 생존 시약, 접시를 인큐베이션.
4. 마이크로 플레이트 리더에서 접시를 놓고 각각 560 nm에서 590 nm의 여기 및 방출 파장에서 형광 신호를 읽어보십시오.
5. 동일한 처리 조건에서 값을 평균 한 후 대조군 웰의 처리함으로써 웰로부터 형광 신호를 정규화하여 타원체에서 세포의 생존 비율을 계산한다.

결과

로봇 액체 핸들러의 워크 스테이션. 그림 1의 피펫 팅 헤드와 4.6에서 타원체의 로봇 인쇄에 사용 된 모든 방송국이 표시되어있다. 이미지는 팁 상자에 대한 두 개의 서로 다른 스테이션 (한 믹싱 팁 세트와 세포 현탁액 수성 DEX 상 혼합물의 / 분배를 흡입에 대한 두 번째 세트)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 전체 셋업은 무균 상태를 유지하기 위해 표준 생물학적 안전 캐비닛 내에 수?...

토론

스페 로이드 잘 종양 생리학 및 약물 효능을 이해하고 항암 약물 개발을위한 유용한 도구를 제공하는 실제적인 모델을 제시한다. 이러한 응용 프로그램은 크게 만 표준 실험 실용 액체 처리 도구 및 선별 장비를 필요로 간단한 회전 타원체 생성 및 유지 보수 기술 혜택을 누릴 것입니다. 수성 개의 상 시스템 드롭 위상 내로 자발적 집합체 암세포의 사용은 효율적인 생산과 로봇 액체 핸들러 타원?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, Mw: 35,000	Sigma-Aldrich	94646
Dextran, Mw: 500,000	Pharmacosmos	5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6429
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12306C
Glutamine	Life Technologies	35050-061
Antibiotic	Life Technologies	15240-062
Clacein AM	Life Technologies	C3100MP
Hoechst	Life Technologies	33342
Cisplatin	Spectrum Chemicals	15663-27-1
PrestoBlue	Life Technologies	A-13261
Pluronic F-108	Sigma Aldrich	542342
Disposable Tips (10 µl)	Fluotics	C-P10V11.ST
Disposable Tips (70 µl)	Fluotics	C-P70V11.ST
Round-bottom 96-well plates	Corning	7007
Equipment
Liquid Handler	Agilent Technologies	SRT Bravo
Microplate Reader	Biotek Instruments	Synergy H1M