薬物検査のための水性二相系と癌細胞スフェロイドのロボット生産

要約

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

要約

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

概要

細胞ベースのアッセイを開発し、新たな抗癌薬の発見のための重要なツールを提供する^。1,2は、歴史的に、癌細胞の単層培養物は、癌細胞の特定の型に対する候補化合物の有効性を調査するために使用されてきた。標準培養プレートで単層培養のメンテナンスの容易さ、試薬の添加のための商業のロボットのツールを標準プレートの互換性、および化学物質に対する細胞応答の下流分析のためのスクリーニング装置では、2Dの文化に魅力的なツールをレンダリングする主要な利点があります薬物試験のために³残念ながら、単層細胞アッセイは、多くの場合、薬剤の開発及び発見非常にコストのかかる処理を行う、生体内での化合物の有効性を予測することができない^。4,5製薬企業および学術単位で多大な投資と努力にもかかわらず、唯一〜1％臨床試験中の抗がん剤は、承認されたのしたがって^、7。 インビボでの 2D培養癌細胞の複雑な3D環境との間の⁶視差が単層培養システムの主要な欠点である。過去20年間のFDAによって、より密接に似ている設定において腫瘍細胞に対する候補化合物のスクリーニング3次元腫瘍環境は、新規な化学療法薬の開発を促進することができる^。8

癌細胞スフェロイドは、 インビトロで 、関連する3D腫瘍モデルを提示する^。9,10スフェロイドは、スピナーフラスコのような技術を使用して非接着性表面上または懸濁液中の癌細胞の自発的または誘導されたアセンブリを介して形成するコンパクトなクラスタ、液体オーバーレイ、微細加工されたマイクロある良くアレイ、マイクロフルイディクス、および懸滴^11-16スフェロイドは、中心ゾーンにキージオメトリおよび酸素の制限された輸送を含む、固形腫瘍の特徴、栄養素、薬物化合物を模倣する。それ故に、彼らはより密接に薬物responを再生成それ固形腫瘍の単層培養物と比較して^17〜19本の著しい利点にもかかわらず、スフェロイドは、日常的に、癌細胞に対する化合物のスクリーニングのために使用されていない。市販のロボット工学およびスクリーニング/イメージングツールと互換性があり、標準的なハイスループット設定で均一なサイズのスフェロイドを製造する難しさは、医薬品開発パイプラインに回転楕円体の文化の取り込みを妨げる。カスタム材料とプレートが最近、このニーズに対応するために市販されるようになってきたが、コストの考慮事項は、その普及を阻止する。

新しいハンギングドロッププラットフォームと微細加工されたマイクロウェルを使用し、高スループットで一貫性のあるサイズのスフェロイドを生産する能力を持つ二つの主要な技術^。13,16,20しかし、両方のアプローチは、特別なプレートと製作するのに費用およびエンドユーザーのための不便なデバイスを必要とする中核研究センターおよび製薬産業、ほとんどの主要EFで新しい抗癌薬の発見のための砦がなされる。ドロッププレートをぶら下げの最近のデザインの細胞含有液滴の安定性のいくつかの改善にもかかわらず、プレートの唯一の他のすべての穴はまだ滴の拡散/マージを回避するために、培養中に使用されます^。16。これはかなり実験的なスループットが低下します。薬物添加と更新は手動またはロボットピペッティングでは困難であり、このプレート構成は、プレートリーダーのような従来のスクリーニング装置と容易に互換性がないため、スフェロイドは生化学分析のための標準的なプレートに転送する必要がある^。21マイクロウェルはまた、ソフトリソグラフィーを使用して製作制御されたサイズのスフェロイド生産を可能にする^。13,20しかし、標準ペッティングツールと、このプラットフォームの非互換性は、単一の処理条件にすべてのスフェロイドを暴露、異なる薬剤化合物/濃度の個々のスフェロイドの治療を防ぎます。したがって、この方法は、高に適していない複数の化合物/濃度の同時試験を必要とスループット化合物スクリーニング。

これらの障害を克服するために、標準的な96ウェルプレート中で一貫してサイズの癌細胞スフェロイドの高スループット生産のための新しい技術が開発されている^。22,23アプローチは（ポリエチレングリコールポリマー水性二相系（ATPS）に基づいている相形成ポリマーとしてPEG）およびデキストラン^{（DEX）。24} ATPSs最近、新規な細胞の様々な高度に水性媒体中の細胞に細胞微細及び生物学的試薬の局所的な送達を可能にするために生物学的用途に利用されている^。25-32を形成する回転楕円体、癌細胞は、水性DEX相と混合し、得られた懸濁液のサブマイクロリットルの滴を十分に浸漬水PEG相溶液を含む中にピペットされる。低下はスフェロイドの形成を容易にするために、浸漬相境界細胞から​​の非混和性のままである。インプortantly、高度に水性の浸漬段階は、回転楕円体の細胞に栄養を提供し、メディアオスモル濃度及び薬物濃度の変動の変化を引き起こすいくつかの他のアッセイに共通のメディア蒸発の周知の問題を最小限に抑える。この技術は、回転楕円体の生産と、標準96ウェルプレート中で、市販の試薬ピペッティング·ツールを使用して薬物治療を可能にする。重要なことには、スフェロイドの細胞応答の分析は、標準的な生化学アッセイおよびプレートリーダーを使用して、同じプレートで行われる。ロボット液体ハンドリングへのアプローチのATPSと適応での作業のしやすさは、モノカルチャーと共培養の両方のハイスループットの生成が簡単な実験技術をスフェロイドなります。この新しいアプローチは、改良された試験のスループットと試験化合物とのReduの費用対効果（数が増加して薬剤の開発と発見のプロセスに癌細胞スフェロイドの統合に向けた大きな前進となりますCED試薬消費量）と効率（）ハンズオン時間を短縮する。

ATPSアプローチを用いて、96ウェルプレート中の癌細胞スフェロイドのロボットの生産のための詳細なプロトコルを以下に記載する。また、得られたスフェロイドおよび商業生化学的アッセイを用いて細胞応答の下流の分析の薬物治療の詳細が提示される。

プロトコル

高分子水性二相系の調製（ATPS）

1. ポリエチレングリコール（PEG）（MW：35000）を0.5g秤量し、水性PEG相（w / v）の5％を10ml調製するための無菌の15mlの円錐形に完全増殖培地9.5 mlに追加します。
   注：最初のポリマーを添加した後、培地の残量が円錐形の壁へのポリマーの付着を最小限にし、ポリマーがより速く溶解するのに役立ち、続いて円錐形に培地の半分を加える。
2. デキストラン（DEX）の0.128グラム（MW：500,000）計量し、12.8％（w / v）の水DEX相から1ミリリットルを準備し、滅菌1.5ミリリットルのマイクロチューブに完全増殖培地の0.872ミリリットルに追加します。
3. 約1分間ボルテックス両方のソリューションは、媒体中にポリマーを溶解した。
4. 溶解および均質の混合物を確保するために、1時間37℃の水浴中で両溶液を保つ。浴からの溶液の汚染の可能性を回避するために、水位上記キャップを保つ水。
5. 無菌のプラスチック製シリンジにPEG相溶液を充填し、不純物を除去するために0.2μmの孔径のシリンジフィルターを介して通過する。
   注：、PEG溶液を注射器を埋める円錐管の上にフィルタの挿入に入れて力を利用して、ゆっくりとフィルターを通してソリューションを押してください。これは、シリンジプランジャの移動​​に対する抵抗を経験することは正常です。解決策のいくつかは、フィルタに残るようにポリマー溶液のマイナー損失が発生しますが、ポリマー濃度は変化しません。
6. ピペット10 DEX相溶液μlの別のチューブに培地10μl中に希釈は、6.4％（w / v）のDEX相溶液を生じた。 PEG相溶液を吸引し、100μlのペトリ皿にそれを分配する。
   1. PEG相溶液中にDEX相溶液（w / v）の6.4％の0.5μLを分注する。顕微鏡下で視覚的にDEXの低下を観察することによって成功したATPSの形成を確認。ドロップ境界二つの安定、独立した水相の存在を示す、表示されたままにする必要があります。
7. 使用するまで4℃で株式水性PEGとDEX相溶液を保管してください。
   注：これは、ポリマー溶液が各実験の前に新たに調製し、貯蔵の24時間以内に使用されていることをお勧めします。

印刷癌の細胞スフェロイド2.準備

1. 90％-100％のコンフルエントな単層への関心（ 例えば、MDA-MB-157乳癌細胞）の癌細胞を成長させる。 MDA-MB-157細胞では、10％FBS、1％グルタミン、および1％抗生物質を含むDMEMから構成される培地を使用する。
   1. （製造業者のプロトコルに従って）細胞解離緩衝液を用いて細胞を回収し、15mlのコニカルに懸濁液を読み込む。 、173.3×gで5分間、それを遠心上清を除去し、細胞を再懸濁する完全増殖培地の1ミリリットル中。
2. ロードセル血球計数器上に、それらをカウントは、必要な数を計算する所望のスフェロイドの細胞密度の細胞。 T75フラスコで成長させたMDA-MB-157細胞のコンフルエントな単層は、通常は〜7×10 ^6個の細胞を提供します。
   注：単一のスフェロイドを生成する液滴体積に必要な細胞密度は、細胞型に依存する。例えば^{22、MDA-MB-157}細胞について×10 ⁴以上1.5の密度は、0.3μlのDEX相滴あたりの推奨されるシングル回転楕円体の形成を確実に。
3. 173.3×gで5分間再度遠心し、細胞および所望の細胞密度に懸濁液を濃縮するために、増殖培地の適切な容量で再懸濁します。
   注：7×10 ⁶個の癌細胞を回収した場合は、0.3μlのDEX相ドロップ1.5×10 ⁴個の細胞密度のスフェロイドを形成するのに必要な細胞懸濁液の全体積は140μlであろう。しかし起因する次のステップでDEX相溶液で希釈し、細胞のみを再懸濁し、細胞培養培地70μlのを使用しています。
4. 12.8％の等量（w / v）の水性DEX相溶液を1.2に調製し、得られた細胞懸濁液に加える。 1.5×10 ⁴細胞密度スフェロイドの例については、DEX相溶液の70μlの細胞懸濁液70μlに添加される。
5. 完全に細胞およびDEX溶液の混合の均一な分布を確実にするために、細胞懸濁液を混合する。ピペット上下に気泡形成を防ぐために静かに行うべきである。

共培養スフェロイドの印刷用3.準備

1. 90％-100％コンフルエント単層に癌細胞（ 例えば、MDA-MB-157ヒト乳癌細胞）および支持細胞（ 例えば、ヒト線維芽細胞）を成長させる。 （製造業者のプロトコルに従って）細胞解離緩衝液を使用して、各細胞型を回収する。
   1. 各円錐から173.3×gで、かつ吸引上清で5分間、それらを遠心分離、円錐形の15ミリリットルに各サスペンションをロードします。完全なGの1ミリリットル中の各円錐形の細胞を再懸濁rowth媒体。
      注：そのようなカルセインAM（生細胞染色）および核染料（ヘキスト社）のような蛍光染料は、2つの細胞型を区別するために使用することができる。
2. 血球計数器上に別々に各細胞型をロードし、共培養スフェロイドにおける支持細胞に対する癌細胞の所望の比率は、各細胞型の必要数を計算するためにそれらを数える。 T75フラスコ中で増殖させたMDA-MB-157細胞および線維芽細胞のコンフルエントな単層は、通常はそれぞれ、〜7×10 ⁶と〜6×10 ^6個の細胞を与える。
3. 2つの細胞型の数の所望の比を与えるために、癌細胞懸濁液に支持細胞の懸濁液から正確なボリュームを追加する。例えば、1線維芽細胞に50癌細胞の比率を使用。
4. 遠心増殖培地の等量を含む最終濃度をもたらすのに適切な容量及び12.8％（w / v）の水性DEXで173.3×gで再懸濁した細胞で5分間混合し、細胞懸濁液を含有するコ​​ニカル（1.2で調製）相溶液。
5. 穏やかに懸濁液の均一性を確実にするために上下に得られた細胞懸濁液をピペット。

96ウェルプレート中に腫瘍スフェロイドの4.印刷

1. 前の24時間、37℃で1％の実験コート非処理、丸底96ウェルプレート（w / v）のプルロニックに一日。このコーティングは、培養期間中、細胞付着を防止する。
2. 96ウェルプレート（宛先プレート）の各ウェル中に濾過し、5％を50μl（w / v）の水性PEG相を分注する。
3. ピペットを用いて、細胞懸濁液（それぞれ、モノ - 及び共培養のためにステップ2またはステップ3で調製）を混合し、384ウェルプレートの1列（ソースプレート）からの他のすべてのサスペンションの20μlを添加する。
4. 液体ハンドラと "ホーム"の座標を登録するペッティングヘッドをオンにします。その後、実験器具を確実にするために（4.6未満）以前に定義されたプロトコルをコンパイルし、パラメータが正しい定義されていますLY。この「ホーミング」のステップは、異なる液体ハンドラの異なる場合があります。
   注：4.6のステップ·バイ·ステップを以下に示したプロトコルの流れは、関係なく、使用されるロボット液体ハンドラの同様であろう。しかし、プログラミングインターフェースは、異なるソフトウェアの使用に異なって見える場合があります。
5. 図1に示すように液体ハンドラーのワークステーション上で定義された位置に、ソースプレート、目的プレート、ピペットチップボックスを配置する。
6. 以下のステップを含むプロトコルを実行します。
   1. ロードワークステーション（ 図1）からピペットチップ（8チップ）を混合液体ハンドラのピペット操作ヘッドから樽の1列。
   2. ソースプレートのウェル中の細胞懸濁液（ 図1）を混ぜる。気泡形成を回避するために、ウェル中の細胞懸濁液の体積よりも小さい混合容積を選択する。
   3. 空の廃棄物のヒントボックス（ 図1）にヒントを取り出します。
   4. 負荷10μL分注ピペットチップとピペット操作ヘッドから樽の1列（ 図1）。
   5. 吸引し、各ピペットチップにソースプレートからの細胞懸濁液0.3μlの（ 図1）。
   6. 目的プレート（ 図1）の1列のウェルに細胞懸濁液を分注する。 0.5mmのディスペンス高さより小さい1μlの/秒の分注流量を使用する。
   7. 全体目的プレートに列ごとの印刷が完了するまで繰り返します4.6.6を通じて4.6.1を繰り返します。
7. 注意深くステーション表面から目的プレートを除去し、CO _2を 37℃の湿潤インキュベーターに入れ、5％。細胞を含むDEX相滴の破砕を避けるために、培養器にそれを運ぶ際にプレートを水平に維持する。
8. DEX相ドロップ内の回転楕円体への細胞の凝集を可能にするために24時間静置します。

5。癌細胞スフェロイドの薬物治療

以下のプロトコルは、4日間の薬物治療のためであり、これは、他の治療期間のために修飾することができる2日後に新鮮な薬物との更新を含むことに留意されたい。

1. 視覚的に24時間後に、96ウェルプレート中のスフェロイド形成を確認する。各スフェロイドの最小および最大径を平均することによりスフェロイドの大きさを測定するための、画像井戸を必要に応じて。
2. 所定の溶解度の濃度で製造業者によって推奨される溶媒に溶解して、所望の薬物のストック溶液を調製する。例えば、2mg / mlの水中でのシスプラチンを溶解する。
   注意：薬剤が光に敏感である場合には光からの薬剤の原液を保護します。
3. 連続希釈法を使用して、前の工程で調製したストック溶液から細胞培養培地で希釈した薬物濃度を準備。各希釈は二回、所望の濃度なされるべきである。 DILution比は、出発ストック濃度および所望の使用濃度に依存して変化する。
4. 各ウェルに前工程で調製薬剤溶液50μlを追加します。これはロボットまたは手動ピペット操作によって行うことができます。
   注：各薬物濃度を、各ウェルに既に50μlの水性PEG相によって所望の濃度に半分に希釈される。
   1. 各濃度について、96ウェルプレート（N = 16）の2つの列からのスフェロイドを使用してください。
   2. 対照ウェルでは、水性のPEG相の既存の50μlに新鮮な培養培地のわずか50μlを添加する。
5. 光から保護し、37℃で48時間、5％CO _2、薬物とスフェロイド培養する。
6. インキュベーションの48時間後に、所望の濃度の薬剤の新鮮な希釈物を調製し、各ウェルに、新鮮な薬物溶液50μlを添加することにより薬物を更新する。
   注意：ウェルは既に第一の薬剤tから所望の薬物濃度を含むreatment。希釈化は生じないので、したがって、この更新段階では、各濃度が所望の濃度で調製する​​。
7. 光から保護し、37℃でさらに48時間、薬物および5％CO ₂でスフェロイド培養する。

6.スフェロイドにおける細胞生存率の分析

1. 新たな薬剤とのインキュベーションの48時間後（ すなわち 、薬物とスフェロイドの治療の合計時間は4日間）、手動ピペッティングによりつのウェル中の培地の総体積を測定する。
   注：1ウ​​ェルの典型的なボリュームが（小さな減少は蒸発により発生した）〜140μLである。
2. 合計ウェル体積の10％の濃度で細胞生存性試薬（ 例えば、PrestoBlue）の体積を計算する。各ウェルに細胞生存性試薬のこのボリュームを追加する。
   注：ウェルの140μLの既存のメディアのボリュームでは、15.6μlのはよく全体の10％の濃度になるようにする必要があります。これは次式で計算される9（140μL/ 9 = 15.6μl）をすることで、既存のメディアボリュームを分割する。
3. 光から保護し、37℃で6時間、各ウェルに添加し、細胞生存性試薬でプレートをインキュベートする。
4. それぞれ、マイクロプレートリーダーでプレートを置き、560 nmおよび590 nmの励起および発光波長で蛍光シグナルを読み取る。
5. 同一の処理条件からの値を平均化した後、対照ウェルと処理したウェルからの蛍光シグナルを正規化することによりスフェロイド中の細胞の生存率パーセントを計算する。

結果

ロボット液体ハンドラのワークステーションは。 図1に示すペッティングヘッドとセクション4.6でスフェロイドのロボットの印刷に使用されるすべてのステーションは、ラベル付けされている。画像は、先端の箱のための2つの異なるステーション（1混合するためのヒントのセットと、細胞懸濁液水性DEX相混合の/調剤を吸引するための第二のセット）の使用を示している。全体の...

ディスカッション

スフェロイドは、より良い腫瘍生理学および薬効を理解し、抗癌薬の発見のための有用なツールを提供するための現実的なモデルを提示する。そのようなアプリケーションは、非常に、標準実験器具、液体ハンドリングツールおよびスクリーニング装置を必要とする単純な回転楕円体の生成および保守技術の恩恵を受ける。水性二相系ドロップ相内に自然に凝集体の癌細胞の使用は、効率的?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, Mw: 35,000	Sigma-Aldrich	94646
Dextran, Mw: 500,000	Pharmacosmos	5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6429
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12306C
Glutamine	Life Technologies	35050-061
Antibiotic	Life Technologies	15240-062
Clacein AM	Life Technologies	C3100MP
Hoechst	Life Technologies	33342
Cisplatin	Spectrum Chemicals	15663-27-1
PrestoBlue	Life Technologies	A-13261
Pluronic F-108	Sigma Aldrich	542342
Disposable Tips (10 µl)	Fluotics	C-P10V11.ST
Disposable Tips (70 µl)	Fluotics	C-P70V11.ST
Round-bottom 96-well plates	Corning	7007
Equipment
Liquid Handler	Agilent Technologies	SRT Bravo
Microplate Reader	Biotek Instruments	Synergy H1M