АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Аннотация

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

Введение

Клеточные анализы являются важным инструментом для развития и открытия новых лекарств против рака. 1,2 Исторически сложилось так, однослойные культуры раковых клеток были использованы для изучения эффективности соединений-кандидатов против отдельных видов раковых клеток. Простота в обслуживании однослойных культур в стандартных планшетах для культивирования, совместимость стандартных пластин с коммерческими роботов инструментов для добавления реагентов, а также с сортировочного оборудования для нисходящего анализа клеточных реакций на химические соединения основные преимущества, которые делают 2D культурам привлекательный инструмент для тестирования на наркотики. 3 К сожалению, монослой клеток анализы часто не в состоянии предсказать эффективность соединений в естественных условиях, что делает разработки лекарственных препаратов и открытия чрезвычайно дорогостоящий процесс. 4,5 Несмотря на значительные инвестиции и усилия фармацевтических компаний и академических подразделений, только ~ 1% противораковых были утверждены наркотики в клинических испытанияхпо FDA в течение последних двух десятилетий. 6 Неравенство между 2D культур и комплексной среде 3D раковых клеток в естественных условиях является существенным недостатком систем культивирования монослоя. 7 Таким образом, скрининг соединений-кандидатов против опухолевых клеток в условиях, больше напоминает среда опухоли 3D может ускорить разработку новых препаратов химиотерапии. 8

Раковая клетка сфероидов представить соответствующую 3D модель опухоли в пробирке. 9,10 Spheroids компактные кластеры, которые образуют через спонтанного или индуцированного сборки раковых клеток на неприлипающих поверхностях или в суспензии, используя такие методы, как вращающуюся колбу, жидкого наложения, микроизготовленном микро- . также массивы, микрофлюидики и висячей капли 11-16 Spheroids имитировать основные черты твердых опухолей, включая геометрии и ограниченной сети транспорта кислорода, питательных веществ и лекарственных соединений в центральной зоне; следовательно, они более тесно регенерации наркотиков responSE солидных опухолей по сравнению с однослойных культур. 17-19 Несмотря на это заметное выгоды, не используются сферические обычно для скрининга химических соединений против раковых клеток. Трудность получения однородных по размеру сфероидов в стандартной установки с высокой пропускной который совместим с коммерчески доступными робототехники и инструментов скрининга / визуализации препятствует включению сфероида культуры в стадии разработки лекарственного средства. Хотя пользовательские материалы и пластины в последнее время стали коммерчески доступными для удовлетворения этой потребности, соображения экономии сдерживать их широкое применение.

Два основных методов с возможностью получения в соответствии размера сфероидов в высокой пропускной использовать новый висячей капли платформу и микроизготовленном микро-Уэллс. 13,16,20 Однако, оба подхода требуют специальных пластин и устройств, которые являются дорогостоящими для изготовления и неудобно для пользователей конечных точек в основных научно-исследовательских центров и фармацевтической промышленности, где наиболее крупных EFфорты для открытия новых лекарств против рака сделаны. Несмотря на некоторые улучшения в стабильности клеточных-содержащих капли с недавним дизайна свисающими тарелки, только каждый второй отверстие пластины до сих пор используется во время культивирования, чтобы избежать распространения / слияние капель. 16 Это значительно снижает экспериментальный пропускную способность. Добавление наркотиков и возобновление трудно с ручной или роботизированной пипетки и сферические должны быть переданы в стандартной пластины для биохимического анализа, поскольку эта конфигурация панель не легко совместим с обычным сортировочного оборудования, таких как плиты читателей. 21 микро-скважин изготовлены с использованием мягкого литографии также позволяют контролируемого размера сфероид производства. 13,20 Тем не менее, несовместимость этой платформы с помощью стандартных инструментов пипеток предотвращает лечения отдельных сфероидов с различными лекарственных соединений / концентрации, выставляя все сфероидов в одном состоянии обработки. Таким образом, этот способ не подходит для высокогоскрининг соединение, которое требуется одновременное тестирование нескольких соединений / концентрациях.

Чтобы преодолеть эти трудности, новая технология производства за большой пропускной способностью стабильно размера сфероидов раковых клеток в стандартных 96-луночных была разработана. 22,23 подход основан на полимерной водной двухфазной системе (АТП) с полиэтиленгликолем ( ПЭГ) и декстран (DEX) в фазе формирования полимеров. 24 ATPSs недавно были использованы в различных биологических приложений новым клеток, позволяющих клеток micropatterning и локализованной доставки биологических реагентов с клетками в водной среде высокой. 25-32 Для формирования сфероид, раковые клетки смешивают с водной фазой DEX и капли суб-мкл полученной суспензии с помощью пипетки в лунку, содержащую погружения водным раствором ПЭГ фазы. Падение остается не смешивается с этапа погружения и ограничивает клеток для облегчения образования сфероида. Чертенокortantly, высоко водную фазу погружения обеспечивает питательные вещества к клеткам сфероида и минимизирует хорошо известную проблему массовой информации испарения, общий для некоторых других анализов, которые вызывает изменения в медиа-осмотического давления и колебания концентрации препарата. Эта методика дает сфероид производства и медикаментозное лечение только с помощью коммерчески доступных реагентов-пипетки и инструменты в стандартных 96-луночных. Важно отметить, что анализ клеточных ответов сфероидов выполняется в одной и той же пластине с помощью стандартных биохимических анализов и пластины читателей. Простота работы с АТП и приспособляемости подхода к роботизированной обработки жидкого предъявляет высокие поколения пропускная способность как моно-культуры и сотрудничества культуры сфероидов простой лабораторной техники. Этот новый подход будет важным шагом вперед на пути интеграции раковых клеток сфероидов в разработке лекарств и открытий процессов с улучшенными тестирование пропускной способности и экономической эффективности (увеличение числа тестируемых соединений и РедуCED расход реагентов) и эффективность (снижение руки-по времени).

Подробный протокол робота производства раковых клеток сфероидов в 96-луночных планшетах с использованием АТП подход описан ниже. Кроме того, сведения о лекарственной терапии в результате сфероидов и вниз по течению анализа клеточных реакций с использованием коммерческого биохимический анализ представлены.

протокол

1. Получение полимерного водного двух системных фазы (ATPS)

  1. Взвешивание 0,5 г полиэтиленгликоля (ПЭГ) (MW: 35000) и добавить его в 9,5 мл полной среды роста в стерильной 15 мл коническую подготовить 10 мл 5% (вес / объем) водной фазы ПЭГ.
    Примечание: Добавление половину среды в коническую первого последующим добавлением полимера, а затем оставшееся количество среды минимизирует адгезию полимера к конической стенки и полимер растворяются быстрее.
  2. Взвешивание 0,128 г декстрана (DEX) (MW: 500 000) и добавить его в 0,872 мл полной среды роста в стерильной 1,5 мл микроцентрифужных трубки, чтобы подготовить 1 мл 12,8% (вес / объем) водной фазы DEX.
  3. Вихревой как растворы в течение примерно 1 мин, чтобы растворить полимеры в среде.
  4. Держать оба решения на водяной бане при 37 ° С в течение 1 ч, чтобы обеспечить растворение и однородных смесей. Держите выше уровня воды колпачки, чтобы избежать возможности заражения решений из ваннывода.
  5. Загрузка фазе раствора ПЭГ в стерильный пластиковый шприц, и передать его через шприцевой фильтр с размером пор 0,2 мкм, чтобы удалить примеси.
    Примечание: Заполните шприц с раствором ПЭГ, поместите его на вставке фильтра в верхней части конической трубе и с помощью силы, медленно толкать раствора через фильтр. Это нормально, чтобы испытать устойчивость к движению поршень шприца. Незначительные потери раствора полимера происходит в некоторых раствора останется в фильтре, но концентрация полимера не изменится.
  6. Пипетка 10 мкл DEX фазы раствора и разбавить его в 10 мкл среды в отдельную пробирку, приведет к 6,4% (вес / объем) DEX фазы раствора. Аспирируйте 100 мкл раствора ПЭГ фазы и выдачи его в чашку Петри.
    1. Не включать 0,5 мкл 6,4% (вес / объем) DEX фазу раствора в фазе раствора ПЭГ. Визуально подтвердить успешное формирование АТП, наблюдая падение DEX под микроскопом. Границе каплидолжен оставаться видимым, указывающий наличие двух стабильных отдельных водных фаз.
  7. Хранить запас водного ПЭГ и фазовые решения DEX в 4 ° С до использования.
    Примечание: Рекомендуется, чтобы полимерные растворы получают свежий перед каждым экспериментом и использовать в течение 24 ч хранения.

2. Подготовка к печати раковых клеток сфероидов

  1. Растут раковые клетки, представляющие интерес (например, MDA-MB-157 клеток рака молочной железы) до 90% -100% сливной монослоя. Для MDA-MB-157 клеток, используют среду, состоящую из DMEM, содержащей 10% FBS, 1% глутамина и 1% антибиотика.
    1. Урожай клетки с использованием буфера для диссоциации клеток (в соответствии с протоколом производителя) и загрузки суспензии в 15 мл коническую форму. Центрифуга в течение 5 мин при 173,3 мкг, удалить супернатант, и ресуспендируют клеток в 1 мл полной среды роста.
  2. Тензодатчики на гемоцитометре и считать их рассчитать необходимое количествоклеток в течение желаемого сфероида плотности клеток. Сливная монослой MDA-MB-157 клетки, выращенные в колбе Т75 обычно дает ~ 7 × 10 6 клеток.
    Примечание:. Требуемое плотность клеток для объема капли, чтобы генерировать один сфероид будет зависеть от типа клеток 22 Например, плотность 1,5 х 10 4 или больше для MDA-MB-157 клеток рекомендуется в 0,3 мкл DEX фазы капли, чтобы обеспечить формирование единого сфероида.
  3. Центрифуга клетки во второй раз в течение 5 мин при 173,3 мкг и ресуспендируют их в соответствующем объеме среды роста концентрировать суспензии до желаемой плотности клеток.
    Примечание: Например, если были собраны 7 × 10 6 раковых клеток, общий объем клеточной суспензии, необходимой для образования сфероида плотности 1,5 × 10 4 клеток в 0,3 мкл каплей DEX фазы будет 140 мкл. Тем не менее из-за разбавления с DEX фазы раствора в следующей стадии, используют только 70 мкл клеточной культуральной среды для ресуспендирования клеток.
  4. Добавить к полученной клеточной суспензии добавляли равный объем на 12,8% (вес / объем) водной фазы DEX раствор, приготовленный в 1,2. Для примера сфероида плотности 1,5 × 10 4 клеток, 70 мкл раствора фазового DEX добавляют к 70 мкл клеточной суспензии.
  5. Тщательно перемешать клеточной суспензии, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток и смешивание раствора DEX. Пипетированием вверх и вниз должно быть сделано аккуратно, чтобы предотвратить образование пузырьков.

3. Подготовка для печати сокультивировали сфероидов

  1. Растут раковые клетки (например, MDA-MB-157 рака молочной железы человека клетки) и поддерживающие клетки (например, фибробластов человека) к 90% -100% сливной монослоя. Урожай каждого типа клеток, используя буфер для диссоциации клеток (в соответствии с протоколом производителя).
    1. Загрузка каждой суспензии в 15 мл коническую отцентрифугированы в течение 5 мин при 173,3 мкг, и аспирации супернатант из каждой конической. Ресуспендируют клеток каждого конуса 1 мл полного гrowth средой.
      Примечание: флуоресцентные красители, такие как кальцеина AM (живой пятна клеток) и ядерных красителей (Hoechst) могут быть использованы для различения двух типов клеток.
  2. Загрузка каждого типа клеток отдельно на гемоцитометра и сосчитать их рассчитать требуемое количество каждого типа клеток на желаемом соотношении раковых клеток, чтобы поддерживать клетки в совместном культивировании сфероидов. Конфлюэнтные монослоя MDA-MB-157 клеток и фибробластов, выращенных в Т75 колбы обычно дают ~ 7 х 10 6 и ~ 6 х 10 6 клеток, соответственно.
  3. Добавить правильного объема из суспензии опорных клеток к раковым клеткам суспензии дать желаемое соотношение количества двух типов клеток. Например, можно использовать соотношение 50 раковых клеток к 1 фибробластов.
  4. Центрифуга коническая, содержащий смешанную суспензию клеток течение 5 мин при 173,3 мкг и ресуспендируют клеток в соответствующем объеме, чтобы привести к конечной плотности, состоящий из равных объемов среды для выращивания и 12,8% (вес / объем) водного DEXфазы раствора (полученного в 1,2).
  5. Осторожно пипетки в результате клеточной суспензии вверх и вниз, чтобы обеспечить однородность суспензии.

4. Печать опухолевых сфероидов в 96-луночный планшет

  1. За день до экспериментов, пальто необработанными с круглым дном 96-луночные планшеты с 1% (масса / объем) Pluronic при 37 ° С в течение 24 ч. Это покрытие предотвращает прикрепление клеток в течение периода культивирования.
  2. Разлить по 50 мкл фильтрованного 5% (вес / объем) водной фазы ПЭГ в каждую лунку 96-луночного планшета (назначения) пластины.
  3. С помощью пипетки, смешать клеточной суспензии (полученного на стадии 2 или 3 стадии для моно- и со-культуры, соответственно) и добавить 20 мкл суспензии с любой другой также от одного столбца 384-луночного планшета (источник пластины) ,
  4. Включите жидкой обработчика и "дома" пипеткой головы зарегистрироваться координаты. Тогда скомпилировать ранее определенный протокол (ниже в 4,6), чтобы обеспечить лабораторное оборудование и параметры определяются правильноLY. Это "наведения" шаг может быть различной для различных жидких обработчиков.
    Примечание: поток протокола, как показано шаг за шагом ниже в 4,6, будет одинаковой независимо от обработчика робота жидкости, используемой; Однако, программный интерфейс может отличаться из-за использования различного программного обеспечения.
  5. Поместите исходный пластину, назначения пластину, и пипетки коробки на определенных позициях на станции жидкого обработчик, как показано на рисунке 1.
  6. Выполнить протокол, который включает в себя следующие шаги:
    1. Загрузите один столбец баррелей из пипетки главы жидкой обработчика с перемешиванием наконечники (8 TIPS) с рабочей станции (рис 1).
    2. Смешайте клеточной суспензии в скважинах исходного пластины (рис 1). Выберите смесительную камеру меньше, чем объем клеточной суспензии в лунки, чтобы избежать образования пузырьков.
    3. Извлеките советы в пустой коробке советы отходов (рисунок 1).
    4. Загрузите один столбец баррелей из пипетки голове 10 мкл дозирования наконечники пипеток (Рисунок 1).
    5. Отберите 0,3 мкл клеточной суспензии из исходного пластины (рис 1) в каждой пипетки.
    6. Отказаться от клеточной суспензии в лунки одного столбца назначения пластины (рис 1). Использование высоту дозирования 0,5 мм и скорость дозирования потока меньше, чем 1 мкл / сек.
    7. Повторите этапы 4.6.1 через 4.6.6 до столбца за столбцом печати на всю пластину назначения не будет завершена.
  7. Осторожно снимите назначения пластину от поверхности рабочей станции, и в местах с повышенной инкубаторе при 37 ° С и 5% CO 2. Поддерживать пластины горизонтально при проведении его в инкубатор, чтобы избежать нарушения фазовых капель DEX, содержащих клетки.
  8. Инкубируют планшет в течение 24 ч, чтобы позволить агрегацию клеток в сфероида в капле DEX фазы.

5. Наркологическая раковых клеток сфероидов

Следует отметить, что следующий протокол для 4-дневного лекарственной терапии и включает в себя обновление со свежими препарата в день 2. Это может быть модифицирована для других периодов лечения.

  1. Визуально подтверждают образование сфероида в 96-луночных планшетах за 24 ч. При необходимости, изображение скважин для измерения размера сфероидов путем усреднения наименьшего и наибольшего диаметра каждого сфероида.
  2. Подготовка исходного раствора требуемой препарата путем растворения его в растворителе, рекомендованным производителем в заданной концентрации растворимости. Например, растворяются в воде цисплатин в дозе 2 мг / мл.
    Примечание: Защита исходного раствора препарата от света, если препарат легко чувствительны к регистру.
  3. С помощью метода серийных разведений, подготовки разбавленные концентрации препарата с клеточной культуральной среды из маточного раствора, полученного на предыдущей стадии. Каждое разведение должно быть в два раза больше желаемой концентрации. ДилКоэффициенты социологическое загрязнение будет варьироваться в зависимости от исходной концентрации акций и желаемой рабочей концентрации.
  4. Добавить 50 мкл лекарственного раствора, приготовленного на предыдущей стадии, в каждую лунку. Это может быть сделано с помощью робота или вручную пипетки.
    Примечание: В каждом концентрация лекарственного средства будет в два раза разбавл до желаемой концентрации в 50 мкл водной фазы ПЭГ уже в каждую лунку.
    1. Использование сфероидов из двух столбцах 96-луночного планшета (N = 16) для каждой концентрации.
    2. В контрольных лунках, добавить только 50 мкл свежей культуральной средой с существующими 50 мкл водной фазы ПЭГ.
  5. Инкубируйте сфероидов с препаратом в течение 48 ч при 37 ° С и 5% СО 2, защищенном от света месте.
  6. После 48 ч инкубации, готовят свежие разведений препарата в нужные концентрации и возобновить препарат путем добавления 50 мкл свежего раствора лекарственного средства в каждую лунку.
    Примечание: скважины уже содержат нужной концентрации наркотиков из первого препарата Treatment. Поэтому в данном обновления фазы, каждая концентрация получают в нужной концентрации, так как не произойдет разбавление.
  7. Инкубируйте сфероидов с лекарственным средством в течение еще ​​48 ч при 37 ° С и 5% СО 2, защищенном от света месте.

6. Анализ жизнеспособности клеток в сфероидов

  1. После 48 ч инкубации с новой препарата (то есть, общее время обработки сфероидов с лекарственным средством является 4 дней), измерить общий объем среды в один и ручным пипетированием.
    Примечание: Типичный объем в одну лунку составляет ~ 140 мкл (небольшое уменьшение происходит за счет испарения).
  2. Рассчитать объем клеточной жизнеспособности реагента (например, PrestoBlue) в концентрации от общего объема а 10%. Добавить объем жизнеспособности клеток реагента в каждую лунку.
    Примечание: При существующей объема средств массовой информации 140 мкл в колодец, объем 15,6 мкл обязан дать концентрацию общего 10% хорошо. Это вычисляется путемделения существующего тома СМИ по 9 (140 мкл / 9 = 15,6 мкл).
  3. Инкубируйте планшет с реагентом жизнеспособности клеток добавляют в каждую лунку в течение 6 ч при 37 ° С в защищенном от света.
  4. Поместите пластину в читателе микро-пластины и читать сигнал флуоресценции на 560 нм и 590 возбуждения нм и эмиссии длин волн, соответственно.
  5. Вычислить процентное жизнеспособность клеток в сфероидов путем нормализации флуоресцентного сигнала от обработанных скважин в том, что из контрольных лунок после усреднения значений из одних и тех же условий обработки.

Результаты

Рабочая станция роботизированного жидкости обработчика показана на рисунке 1. Пипеткой головы и все станции, используемые в робота печати сфероидов в разделе 4.6 помечены. Изображение показывает использование двух различных станций на наконечник коробки (один набор наконечни...

Обсуждение

Spheroids представить реалистичную модель, чтобы лучше понять физиологию опухоли и эффективность препарата и полезным инструментом для обнаружения наркотиков против рака. Такие приложения могут извлечь большую пользу из простых методов генерации и обслуживания сфероид, когда требуется ...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, Mw: 35,000Sigma-Aldrich94646
Dextran, Mw: 500,000Pharmacosmos5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6429
Fetal Bovine SerumSigma-Aldrich12306C
GlutamineLife Technologies35050-061
AntibioticLife Technologies15240-062
Clacein AMLife TechnologiesC3100MP
HoechstLife Technologies33342
CisplatinSpectrum Chemicals15663-27-1
PrestoBlueLife TechnologiesA-13261
Pluronic F-108Sigma Aldrich542342
Disposable Tips (10 µl)FluoticsC-P10V11.ST
Disposable Tips (70 µl)FluoticsC-P70V11.ST
Round-bottom 96-well platesCorning7007
Equipment
Liquid HandlerAgilent TechnologiesSRT Bravo
Microplate ReaderBiotek InstrumentsSynergy H1M

Ссылки

  1. Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
  2. Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).
  3. Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
  4. Gidrol, X., et al. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).
  5. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).
  6. Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK. BMJ Open. 3, (2013).
  7. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
  8. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
  9. Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).
  10. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
  11. Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).
  12. Wartenberg, M., et al. Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells. FASEB J. 15, 995-1005 (2001).
  13. Tekin, H., et al. Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates. Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).
  14. Patra, B., et al. A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis. Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).
  15. Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat. Commun. 5, 4250 (2014).
  16. Hsiao, A. Y., et al. Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates. Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).
  17. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).
  18. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).
  19. Minchinton, A., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumors. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
  20. Jeong, G. S., et al. Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies. Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).
  21. Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids. JALA. 19, 208-214 (2014).
  22. Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids. Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).
  23. Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture. Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).
  24. Albertsson, P. -. A., Tjerneld, F. Phase diagrams. Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).
  25. Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems. J. Vis. Exp. (73), (2013).
  26. Frampton, J. P., et al. Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA. Sci. Rep. 4, 4878 (2014).
  27. Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions. Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).
  28. Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system. Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).
  29. Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).
  30. Tavana, H., et al. Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies. Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).
  31. Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).
  32. Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).
  33. Kalluri, R., Zeisberg, M. . Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
  34. Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts. BMC Cancer. 10, 444 (2010).
  35. Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).
  36. Hsiao, A. Y., et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids. Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).
  37. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).
  38. Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).
  39. Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).
  40. Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

98Cell3DRoboticCo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены