تقييم البطانية هجرة الخلايا بعد التعرض للمواد الكيميائية السامة

Summary

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Abstract

التعرض للمواد الكيميائية (بما في ذلك مؤلكل عوامل الحرب الكيميائية مثل الكبريت والنيتروجين الخردل) يسبب عدد كبير من الأعراض السريرية بما في ذلك الجرح اضطراب الشفاء. عملية فسيولوجية التئام الجروح معقدة للغاية. تشكيل النسيج الحبيبي هو خطوة أساسية في هذه العملية مما أدى إلى إغلاق الجرح الأولي وتوفير شبكة من الأوعية الدموية الشعرية الجديدة - إما عن طريق تكون الأوعية (تشكيل رواية) أو الأوعية الدموية (تنتشر السفن الموجودة). كلا vasculo- والأوعية الدموية تتطلب وظيفية، والهجرة الموجهة من الخلايا البطانية. وهكذا، والتحقيق في وقت مبكر من الخلايا البطانية (EEC) الهجرة غير المهم أن نفهم الفيزيولوجيا المرضية من المواد الكيميائية الناجمة عن التئام الجروح الاضطرابات ويحتمل أن تحديد استراتيجيات جديدة للتدخل العلاجي.

قمنا بتقييم ضعف التئام الجروح بعد مؤلكل التعرض لعامل واختبار المركبات المرشحة المحتملة للجراراتeatment. كنا مجموعة من التقنيات الواردة في هذا البروتوكول. A غرفة بويدن المعدلة للتحقيق من الناحية الكمية يوصف تنشيط كيميائي من EEC. وعلاوة على ذلك، ويتضح استخدام التئام الجروح فحص في تركيبة مع تحليل المسار لتقييم نوعيا الهجرة. أخيرا، علينا أن نظهر استخدام TMRM صبغة الفلورسنت للتحقيق في احتمال غشاء الميتوكوندريا إلى تحديد الآليات الكامنة وراء هجرة الخلايا المضطربة. يصف بروتوكول التالية التقنيات الأساسية التي تم تكييفها للتحقيق في EEC.

Introduction

هجرة الخلايا مهمة في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية بما في ذلك تطوير والأمراض المختلفة، والتئام الجروح بعد إصابة الجلد.

بعد إصابة الجلد، التهاب الأنسجة ويزيل تحبيب محركات الأقراص التالفة أو الميتة إغلاق الجرح الأولي ويسمح تشكيل شبكة من الشعيرات الدموية الجديدة من خلال تكون الأوعية (تشكيل رواية) أو الأوعية الدموية (تبرعم الحويصلات الموجودة) ^1-3. كلا vasculo- والأوعية الدموية تتطلب هجرة الخلايا البطانية. شبكة متنامية من الأوعية الدموية أمر ضروري لنقل الأكسجين والمواد المغذية إلى الخلايا الكيراتينية المتكاثرة التي تخضع في نهاية المطاف التقرن، تشكيل ظهارة جديدة وتوفير إغلاق الجرح.

الهجرة ضعف الخلايا البطانية هو السبب الكامن وراء الجرح اضطراب ^4،5 الشفاء. ويلزم بذلك، وأساليب تقييم هجرة الخلايا البطانية في وقت مبكر لاستكشاف pathophysiolتتبناها من اضطرابات الهجرة الخلية وتحديد استراتيجيات جديدة للتدخل العلاجي.

تعرض البشرة للعوامل مؤلكل (على سبيل المثال، والكبريت والنيتروجين الخردل) يسبب الجرح اضطراب ⁶ الشفاء. واستخدمت هذه المركبات كما عوامل الحرب الكيميائية في العديد من الصراعات في القرن 20 ويبقى سبب قلق شديد بسبب المخزونات الموجودة في المناطق غير المستقرة سياسيا وتركيب بسيط نسبيا. على الرغم من خردل الكبريت تم تصنيعه لأول مرة في عام 1822، ليست مفهومة علم الأمراض الجزيئية والسريرية التعرض SM في التفاصيل، ويتم تحديد أي ترياق للتعرض SM.

وقد أجريت العديد من الدراسات لفهم ونمذجة ضعف التئام الجروح بعد التعرض SM واختبار المركبات المرشحة المحتملة قادرة على الاحتفاظ بهذا المعنى. شميت وآخرون (2009) اختبار تأثير الكلوراميوسيل، وهو مركب مؤلكل مع خصائص مشابهة لSM في مذكرة التفاهمحد ذاتها نماذج الجسم مضغي وجدت مثيرة، وأحيانا للحد من أكثر من 99٪ في تكوين الاوعية ^7. كان هذا تأثير سلبي أكثر وضوحا في مرحلة التنمية التي، في ظل الظروف الفسيولوجية، يهيمن عليها انتشار وهجرة الخلايا السلائف بطانة الأوعية الدموية. وهكذا، تم تحديد هذه الخلايا لتكون حساسة بشكل خاص لمؤلكل الوكلاء. Steinritz وآخرون (2010) اختبار الزبالين من أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، ولا سيما، N أسيتيل (NAC) وحمض اللينولينيك ألفا (ALA) لقدرتها على تقليل SM سمية في الماوس مضغي نماذج الجسم وعلى وجه الخصوص، ل استعادة تكوين الاوعية ^8. وقد لوحظت آثار وقائية مؤقتة، مشيرا إلى أن تشكيل ROS المفرط على الأرجح تساهم في الآثار السلبية لSM على التئام الجروح. وكانت هذه الآثار يست دائمة وربما لا تكون المركبات مرشح اثنين قادرة على استعادة تكوين الاوعية والتئام الجروح على المدى الطويل ^8. Howeveص، أجريت تلك التجارب في نموذج 3D المعقدة التي لم تسمح التحقيق في الهجرة الخلية. وبالتالي، نحن اختبار في وقت لاحق NAC وALA للآثار مفيدة على هجرة الخلايا من EEC التي لها دور أساسي في عملية تكوين الاوعية ^9.

وعلاوة على ذلك، هناك أدلة على أن الخلية القطبية مطلوب للهجرة الخلية. وقد أظهرت ضعف الميتوكوندريا مما يؤدي إلى تشكيل ROS مخلا قطبية الخلية وبالتالي قد تؤثر سلبا على الهجرة الخلية. لذلك، تم إجراء تصوير الخلايا الحية فيما يتعلق ظيفة الميتوكوندريا وتم فحص آثار الزبالين ROS. يصف بروتوكول التالية المتطلبات العامة للزراعة EEC، وغرفة فحص بويدن، والتئام الجروح مقايسة بما في ذلك تحليل تتبع الخلية واستخدام TMRM لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في التفاصيل. ويسلط الضوء على جوانب هامة من البروتوكولات التجريبية لزراعة الجماعة الاقتصادية الأوروبية والهجرة.

Protocol

يصف بروتوكول التالية تقنيات التحقيق في وقت مبكر من هجرة الخلايا البطانية. زراعة السليم للخلايا بطانة الأوعية الدموية تتطلب قبل طلاء قوارير زراعة الخلايا مع الجيلاتين لضمان الانتشار السليم والمحافظة على النمط الظاهري البطانية.

1. قبل طلاء قوارير خلية ثقافة

1. حل الجيلاتين في 0.1 M PBS إلى تركيز النهائي من 0.1٪.
2. الأوتوكلاف الحل مع المعلمات من أجل التعقيم السائل (لمزيد من التفاصيل انظر تعليمات الأوتوكلاف معين).
3. إضافة كمية كافية من محلول الجيلاتين تعقيمها إلى قارورة معقمة ثقافة الخلية (على سبيل المثال، لا يقل عن 5 مل للثقافة قارورة خلية T25).
4. نقل قوارير في حاضنة (37 ° C، 5٪ CO ₂ غير مطلوب ولكن لا تتدخل) لمدة 30 دقيقة على الأقل.
5. إزالة حل الجيلاتين المتبقية. استخدام قوارير المغلفة مسبقا في وقت لاحق (انظر زراعة الخلية) أو الصورةمزق تحت ظروف معقمة حتى الاستخدام.

2. زراعة خلية من الخلايا البطانية في وقت مبكر

ملاحظة: تم الحصول على الخلايا الجذعية الجنينية المستمدة الخلايا البطانية في وقت مبكر (EEC) من الهيئات مضغي الفئران متباينة من قبل المغناطيسي تنشيط فرز الخلايا من جزء الخلية إيجابي PECAM-1 كما هو موضح سابقا ^10،11.

1. ثقافة EEC على أطباق زراعة الخلايا المغلفة الجيلاتين في DMEM تستكمل مع 15٪ FCS، 50 U / البنسلين مل، 50 U / مل الستربتومايسين، و 200 ميكرومتر L-الجلوتامين، و 100 ميكرومتر ß المركابتويثانول و 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية. التعامل مع الخلايا تحت ظروف معقمة. زراعة الخلايا مع CO ₂ 5٪ عند 37 درجة مئوية والرطوبة 95٪ حتى-التقاء الفرعية (بحد أقصى 80٪).
2. في التقاء الفرعي، وتقسيم الخلايا في نسبة 1: 5. ملاحظة: المفرزة من الخلايا البطانية هو خطوة حاسمة.
   1. حصاد الخلايا مع RT accutase. إزالة وسائل الإعلام، وشطف مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من accutase في 25 سم ^2.
   2. احتضان القارورة في RT ل10/02 دقيقة حتى فصل الخلايا. تفريق الخلايا ونقلها إلى التطبيق المطلوب. ملاحظة: لا حاجة لتحييد الكيميائي للaccutase كما يحدث عندما يتم تخزين الخلايا المصنفة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. ومع ذلك، يمكن أيضا أن انخفض accutase النشاط من خلال إضافة DMEM تحتوي على FCS.

3. بويدن غرفة

ملاحظة: يتم إجراء فحوصات غرفة بويدن باستخدام أنظمة ضوئية مبهمة إدراج البولي ايثلين مع 8 ميكرون حجم المسام.

1. قبل معطف إدراج مرشح (التي تناسب داخل الآبار زراعة الخلايا وبالتالي خلق غرفة بويدن) وذلك بإضافة 500 ميكرولتر من 0.1٪ الجيلاتين المذاب في 0.1 M PBS لمدة 30 دقيقة على الأقل.
2. إذا الخلايا هي أن تتعرض لمواد كيميائية سامة، فضح وفقا لتصميم تجريبي معين قبل الحصاد الخلية. خلايا تعرضت إلى 12.5 ميكروغرام الكلوراميوسيل / مل DMEM: مذكرةلمدة 24 ساعة. وفيما يتعلق التصميم التجريبي معين، قد تختلف التعليمات.
3. حصاد EEC وتحديد عدد الخلايا باستخدام غرفة خلية العد. ملاحظة: أجهزة الفرز الآلي يمكن استخدامها، ولكن يجب استخدامها بحذر: دليل العد الخلية هو أكثر دقة وينصح بشدة.
4. إضافة 500 ميكرولتر مستنبت الخلية إلى انخفاض حجرة غرفة لغرفة بويدن.
5. إضافة بالضبط 10 ⁴ EEC في 500 ميكرولتر مستنبت الخلية في إدراج مرشح في الدائرة المقصورة العليا. القضاء على الفقاعات.
6. احتضان إدراج مرشح في الحاضنة لمدة 8 ساعات بالضبط.
7. شطف مع PBS مرة واحدة واستبدال المتوسطة مع 0.5 مل بارافورمالدهيد 4٪ في كل من المقصورات لمدة 25 دقيقة لتثبيت الخلية. غسل المرشح على نطاق واسع ولكن على الأقل 3 مرات مع 0.1 M PBS.
8. استئصال الأغشية مع مشرط.
9. جبل الغشاء بين اثنين من زلات غطاء زجاجي مع تصاعد المتوسط ​​تحتوي على دابي لstainin النوويةز. الالتفات إلى التوجه. تأكد من أن الخلايا الوحيدة التي هاجروا نحو الجانب مقصورة السفلي من الغشاء تحسب.
10. عدد الخلايا التي هاجرت نحو الجانب مقصورة السفلي من الغشاء مع المجهر مضان في 400X التكبير. لا تخلط بين مسام الغشاء مع خلايا هاجر (الشكل 1A، 1B). التحقيق في عدد معقول من مكررات البيولوجية (على الأقل 3 مكررات البيولوجية في حالة).

4. التئام الجروح الفحص

1. اعتمادا على المعدات المتاحة، تختار بعناية أطباق زراعة الخلايا أو لوحات: عند استخدام DIC المجهر، وتجنب الأطباق الثقافة القائمة على سطح البلاستيك أو لوحات جيدة ولكن استخدام الأجهزة القائمة على الزجاج بدلا من ذلك.
   ملاحظة: إذا كنت تستخدم على النقيض من المرحلة المجهري، والأطباق البلاستيكية أساس يمكن أن تستخدم أيضا.
2. زراعة EEC في جهاز ثقافة الخلية المناسبة (على سبيل المثال، 4 سم الزجاج طبق بتري أسفل مناسبة لتصوير الخلايا الحية) حتى 80٪ التقاء. هام: لا زراعة الخلايا لاستكمال التقاء.
3. خدش الطبقات الوحيدة العقيمة مع 10 نصائح ميكرولتر ماصة. دفع غيض بلطف دون الكثير من الضغط على سطح الطبق وتحريكه في خط مستقيم على نحو سلس من جانب واحد على other.Wash الخلايا مرتين مع 0.1 M PBS لإزالة خلايا منفصلة.
4. إضافة كمية كافية من المتوسط ​​إلى الطبق الثقافة. إذا كان ذلك ممكنا، إضافة المركبات التي ينبغي التحقيق فيها.
   ملاحظة: 1.5 مل المتوسطة التي تحتوي على 15 نانوغرام / مل ألفا تمت إضافة حمض اللينولينيك.
5. تركيب الطبق الثقافة تحت المجهر قادرة على تصوير الخلايا الحية. ضمان 5٪ CO _2، 37 ° C وجو مرطب.
   ملاحظة: الترطيب مهم بشكل خاص لتجنب التبخر المتوسط.
6. الحصول على صور مرور الزمن أكثر من 24 ساعة على 10 فترات دقيقة. خطة لأحجام الملفات الكبيرة. ملاحظة: القرار 512 X 512 بكسل وعادة ما يكفي. ومع ذلك، فإننا نوصي باستخدام صور من 1024 س 1،0 على الأقل24.
7. قياس عرض الفجوة في تي = 0 ساعة وعند t = 24 ساعة باستخدام أداة طول البرامج المقدمة مع المجهر أو استخدام البرمجيات مفتوحة المصدر (على سبيل المثال، يماغيج). ملاحظة: في عام معين الحصول على الصور وتحليل البرامج يتم توفيرها من قبل الشركة المصنعة. لذلك، للحصول على التفاصيل التقنية المتعلقة باستخدام البرنامج، الرجوع إلى دليل.

تتبع 5. خلية

1. اعتمادا على المعدات المتاحة، تختار بعناية أطباق زراعة الخلايا أو لوحات: عند استخدام DIC المجهر، وتجنب الأطباق الثقافة القائمة على سطح البلاستيك أو لوحات جيدة ولكن استخدام الأجهزة القائمة على الزجاج بدلا من ذلك.
   ملاحظة: إذا كنت تستخدم على النقيض من المرحلة المجهري، والأطباق البلاستيكية أساس يمكن أن تستخدم أيضا.
2. البذور 5 × 10 ⁴ EEC في استكمال DMEM في جهاز ثقافة الخلية المناسبة (على سبيل المثال، 24 لوحة multiwell) وزراعة الخلايا مع CO ₂ 5٪ عند 37 درجة مئوية والرطوبة 95٪ لمدة 1-2 أيام.
3. عندما نمت الخلايا تصل الى 80٪ التقاء، وإزالة وسائل الإعلام والثقافة الخلايا مع وسائل الإعلام الجديدة في وجود مواد الاختبار منها (على سبيل المثال، 12.5 ميكروغرام الكلوراميوسيل / مل DMEM). تتضمن دائما خلايا التحكم (تعامل مع المذيب، على سبيل المثال، والإيثانول) في 37 ° C لفترة معينة من الزمن (24 ساعة، اعتمادا على نظام فحص فردي).
4. تركيب الطبق الثقافة تحت المجهر قادرة على التصوير الحي الخلية (37 ° C، 5٪ CO ₂ و 95٪ الرطوبة). الحصول على صور مرور الزمن أكثر من 24 ساعة على فترات محددة سلفا. الحصول على صور في 10 دقيقة فترات.
5. أداء تتبع يدويا من EEC عن طريق استخدام البرنامج المساعد يماغيج MTrackJ. اختيار 10 الخلايا عشوائيا من مجال الرؤية وتتبع تحركاتهم عن طريق إضافة نقطة بيانات في وقت من الأوقات باستخدام "إضافة" قيادة MTrackJ.

ملاحظة: MTrackJ متاح مجانا في ويماغيج هو التواجد [Meijering، Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]لو في [Rasband، يماغيج. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. دليل مفصل حول البرنامج المساعد MTrackJ يتوفر في "http://www.imagescience.org".

6. يعيش التصوير خلية / تقييم الميتوكوندريا غشاء المحتملة

1. زراعة EEC في جهاز ثقافة الخلية المناسبة (على سبيل المثال، 4 سم الزجاج طبق بتري أسفل مناسبة لتصوير الخلايا الحية) تصل إلى نقطة التقاء 80٪.
   هام: لا تقم زراعة الخلايا لاستكمال التقاء.
2. إذا كان ذلك ممكنا، وتعريض الخلايا للمواد الكيميائية. تعرض الخلايا إلى 12.5 ميكروغرام / مل الكلوراميوسيل لمدة 24 ساعة: مذكرة. وفيما يتعلق التصميم التجريبي معين، قد تختلف التعليمات.
3. يعد حل 10 ملم الأوراق المالية من tetramethylrhodamine (TMRM) في DMSO. يحفظ بعيدا عن الضوء. ملاحظة: يمكن تخزين الحل السهم عند -20 درجة مئوية.
4. تمييع الحل الأسهم في مستنبت الخلية إلى حل العاملة مع تركيز من 10 ميكرومتر (1: 1000 تمييع). يحفظ بعيدا عن الضوءواستخدم في أقرب وقت ممكن. ملاحظة: يمكن أن تظل الحل العاملين في RT لبعض الوقت (> 1 ساعة)، ومع ذلك، ينصح بشدة إعداد حل عمل جديدة.
5. إضافة 2 ميكرولتر من حل العاملة إلى 1 مل مستنبت الخلية (حل التحميل) جديدة.
6. تحميل الخلايا عن طريق استبدال مستنبت الخلية مع الحل التحميل. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ والجو مرطب (الحاضنة). ويتم تصدير معظم المؤشرات مضان من قبل خلايا الحية على مر الزمن؛: الحذر ولتجنب تحميل لفترات طويلة أو تأخير التحليل.
7. دون غسل، ووضع طبق تحت المجهر مناسبة لتصوير الخلايا الحية. هام: مؤشرات مضان شديدة الحساسية للضوء، وبالتالي، وتجنب التعرض للضوء لزوم لها.
8. الحصول على صور دون تغيير المعلمات اقتناء لضمان إمكانية المقارنة بين الصور المختلفة.

النتائج

تعرض البشرة للعوامل مؤلكل يثير حمامي، تشكيل نفطة وتقرح الجلد الذي يقترن اضطراب التئام الجروح. التئام الجروح يتطلب تكون الأوعية angio- والتي تقوم على هجرة الخلايا البطانية. ويمكن تقييم الهجرة الكمية عن طريق استخدام غرفة الفحص بويدن. كما هو مبين في الشكل 1C تعرض E...

Discussion

تعرض البشرة للمواد الكيميائية السامة غالبا ما يؤدي إلى اضطراب شديد التئام الجروح. الآليات الكامنة غير معروفة إلى حد كبير. التئام الجروح هو عملية معقدة تتكون من مراحل مختلفة (الارقاء، والتهاب، وانتشار وإعادة عرض). وتشارك الهجرة خلية في كل مرحلة، ومع ذلك، فإنه من الأهم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Boyden Chamber
Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm	Corning Incorporated	#351151
Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm	Life Sciences	#351152
(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)
Wound  healing assay
Glass bottom dishes	Word Precision Instruments, Inc.	#FD35-100
Assessment of mitochondrial potential
TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)	Life Technologies	#T669
Cell culture
Accutase	PAA, Pasching, Austria	# L11-007
α-Linolenic acid	Fluka (Sigma), Steinheim, Germany	# L2376
Chlorambucil	Fluka (Sigma), Steinheim, Germany	# 23125
Gelatin	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	# G2500-100G