Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien

Zusammenfassung

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Zusammenfassung

Die Exposition gegenüber chemischen Stoffen (einschließlich alkylierende chemische Kampfstoffe wie Schwefel und Stickstoffsenf) führen eine Fülle von klinischen Symptomen wie Wundheilungsstörung. Der physiologische Prozess der Wundheilung ist sehr komplex. Die Bildung von Granulationsgewebe ist ein wichtiger Schritt in diesem Prozess, was zu einer vorläufigen Wundverschluss und die Bereitstellung eines Netzes von neuen kapillaren Blutgefäßen - entweder durch Vaskulogenese (Roman Bildung) oder Angiogenese (sprießen bestehender Schiffe). Sowohl vasculo- und Angiogenese erfordern funktionale, gerichtete Wanderung von Endothelzellen. Somit ist Untersuchung von frühen Endothelzellen (EWG) Migration wichtig, die Pathophysiologie der chemischen induzierten Wundheilungsstörungen zu verstehen und möglicherweise zu identifizieren neue Strategien für die therapeutische Intervention.

Wir beurteilen Wundheilungsstörungen nach Alkylierungsmittel Belichtung und getestet potenziellen Kandidatenverbindungen für treatment. Wir haben eine Reihe von Techniken, die in diesem Protokoll beschrieben. A modifizierten Boyden-Kammer, um quantitativ zu untersuchen Chemokinese der EWG beschrieben. Darüber hinaus wird die Verwendung der Wundheilungs Assay in Verbindung mit Gleis Analyse qualitativ beurteilen Migration dargestellt. Schließlich zeigen wir die Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs TMRM zur Erforschung des mitochondrialen Membranpotentials zu Grunde liegenden Mechanismen der gestörten Zellmigration zu identifizieren. Das folgende Protokoll beschreibt grundlegende Techniken, die für die Untersuchung der EWG adaptiert wurden.

Einleitung

Zellmigration ist in vielen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, einschließlich der Entwicklung, verschiedene Krankheiten, und die Wundheilung nach Verletzungen der Haut wichtig.

Folgende Hautverletzung, Entzündung beseitigt beschädigte oder nekrotische Gewebe und Granulierung Antriebe vorläufigen Wundverschluß und ermöglicht die Bildung eines Netzwerks von Kapillaren durch Vaskulogenese (Roman Bildung) oder Angiogenese (Sprießen von vorhandenen Bläschen) ^1-3. Sowohl vasculo- und Angiogenese erfordern Migration von Endothelzellen. Die wachsende Netzwerk von Blutgefäßen ist wichtig, um Sauerstoff und Nährstoffe zu proliferierenden Keratinozyten, die letztlich Verhornung unterziehen zu transportieren, bilden eine neue Epithel und bieten Wundverschluss.

Beeinträchtigt Migration von Endothelzellen ist eine zugrunde liegende Ursache der Wundheilungsstörung ^4,5. Somit Methoden zur Messung der Migration der frühen Endothelzellen sind erforderlich, um die pathophysiol erforschenlogie der Zellmigration Störungen und neue Strategien für die therapeutische Intervention zu identifizieren.

Hautexposition Alkylierungsmittel (beispielsweise Schwefel und Stickstoffsenfgas) verursacht Wundheilungsstörung ^6. Solche Verbindungen wurden als chemische Kampfstoffe in mehrere Konflikte im 20. Jahrhundert Grund für große Besorgnis wegen der bestehenden Lagerbestände in politisch instabilen Regionen und die relativ einfache Synthese verwendet werden und zu bleiben. Obwohl Senfgas wurde zum ersten Mal im Jahre 1822 synthetisiert wird die molekularen und klinischen Pathologie der SM Exposition nicht im Detail verstanden und kein Gegenmittel für SM Exposition festgestellt wurde.

Es wurden mehrere Studien durchgeführt, um zu verstehen und zu einer Beeinträchtigung der Wundheilung nach SM Expositionsmodell und für potenzielle Kandidatenverbindungen, die die Reservierung diese Wirkung zu testen. Schmidt et al. (2009) untersucht die Wirkung von Chlorambucil, einem alkylierenden Verbindung mit ähnlich SM in mou Eigenschaftense Embryoidkörper Modelle und fand eine dramatische, manchmal mehr als 99% ige Reduktion der Gefäßbildung ^7. Dieser nachteilige Effekt war besonders im Stadium der Entwicklung, die unter physiologischen Bedingungen durch die Proliferation und Migration der vaskulären endothelialen Vorläuferzellen dominiert ausgeprägt. Somit wurden diese Zellen identifiziert besonders empfindlich Alkylierungsmittel sein. Steinritz et al. (2010) getestet Fänger von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), insbesondere N-Acetylcystein (NAC) und Alpha-Linolensäure (ALA) auf ihre Fähigkeit zur SM-Toxizität in der Maus Embryoidkörper Modelle und insbesondere zu verringern, Wiederherstellung Gefäßbildung ^8. Temporäre Schutzwirkungen wurden nicht beobachtet, was darauf hinweist, dass die übermäßige Bildung von ROS wahrscheinlich war, um die negativen Auswirkungen der SM auf die Wundheilung bei. Diese Effekte waren nicht dauerhaft und die zwei Kandidatenverbindungen nicht wiederherstellen kann Gefäßbildung und Wundheilung langfristig ⁸ sein. However wurden diese Experimente in einem komplexen 3D-Modell, das ermöglicht Untersuchung der Zellmigration haben durchgeführt. So haben wir anschließend getestet NAC und ALA für eine wohltuende Wirkung auf die Zellmigration der EWG, die eine Schlüsselrolle im Prozess der Gefäßbildung ⁹ haben.

Darüber hinaus gibt es Hinweise, dass die Zellpolarität ist für Zellmigration erforderlich. Mitochondriale Dysfunktion, die zu ROS-Bildung wurde gezeigt, dass Zellpolarität beeinträchtigen und somit nachteilig auf die Zellmigration. Daher wurde lebenden Zellen im Hinblick auf die mitochondriale Funktion durchgeführt, und die Wirkungen von ROS-Fänger wurden untersucht. Das folgende Protokoll beschreibt die allgemeinen Anforderungen für den Anbau von EWG, der Boyden-Kammer-Assay, der Wundheilungsassay einschließlich Zell Tracking-Analyse und den Einsatz von TMRM zur Beurteilung der Funktion der Mitochondrien im Detail. Wichtige Aspekte der Versuchsprotokolle für EWG Anbau und Migration werden hervorgehoben.

Protokoll

Das folgende Protokoll beschreibt Techniken für die Untersuchung der frühen Endothelzellmigration. Die richtige Pflege der vaskulären Endothelzellen erfordert pre-Beschichtung von Zellkulturflaschen mit Gelatine, um die ordnungsgemäße Verbreitung und Aufrechterhaltung eines endothelialen Phänotyp zu gewährleisten.

1. Pre-Beschichtung von Zellkulturflaschen

1. Auflösen Gelatine in 0,1 M PBS auf eine Endkonzentration von 0,1%.
2. Autoklavieren Sie die Lösung mit Parametern für flüssige Autoklavieren (Details siehe Anleitung der spezifischen Autoklav).
3. Gebe ausreichend Volumen des autoklavierten Gelatinelösung in eine sterile Zellkulturflasche (beispielsweise zumindest 5 ml einer T25 Zellkulturflasche).
4. Übertragen Sie die Flaschen in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO ₂ nicht erforderlich, aber nicht stört) für mindestens 30 min.
5. Entfernen Sie die verbleibende Gelatine-Lösung. Verwenden Sie die vorbeschichtete Kolben anschließend (siehe Zellkultivierung) oder sriß unter sterilen Bedingungen bis zur Verwendung.

2. Zellkultur der frühen Endothelzellen

Hinweis: embryonalen Stammzellen abgeleitet frühen Endothelzellen (EWG) wurden von differenzierten murine embryonale Körper durch magnetische Zellsortierung der PECAM-1-positive Zellfraktion, wie zuvor beschrieben, erhalten ^10,11.

1. Kultur EWG Gelatine beschichtete Zellkulturschalen in DMEM, ergänzt mit 15% FCS, 50 U / ml Penicillin, 50 U / ml Streptomycin, 200 & mgr; M L-Glutamin, 100 & mgr; M ß-Mercaptoethanol und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren. Griff Zellen unter sterilen Bedingungen. Kultivieren der Zellen mit 5% CO ₂ bei 37 ° C und 95% Feuchtigkeit bis Subkonfluenz (max. 80%).
2. Bei Subkonfluenz, teilen Sie die Zellen bei einer 1: 5-Verhältnis. Anmerkung: Ablösung der Endothelzellen ist ein kritischer Schritt.
   1. Ernten Sie die Zellen, die mit RT Accutase. Entfernen Sie die Medien, Spülen mit PBS und 1 ml Accutase pro 25 cm ^2.
   2. Der Kolben wird bei RT inkubieren 2-10 min, bis die Zellen abgelöst. Dispergieren der Zellen und sie auf die gewünschte Anwendung. Anmerkung: Eine chemische Neutralisation des Accutase ist nicht erforderlich, wie es stattfindet, wenn die angesiedelten Zellen werden im Brutschrank bei 37 ° C gelagert. Jedoch kann Accutase Aktivität auch durch Zugabe DMEM FCS verringert werden.

3. Boyden Chamber

Hinweis: Boyden-Kammer-Tests werden unter Verwendung von lichtundurchlässigen Polyethylenterephthalat Einsatzsystemen mit 8 & mgr; m Porengröße durchgeführt.

1. Precoat- die Filtereinsätze (dh passen in Zellkulturvertiefungen wodurch eine Boyden-Kammer), die durch Zugabe von 500 ul 0,1% Gelatine in 0,1 M PBS für mindestens 30 min.
2. Wenn Zellen mit toxischen Chemikalien ausgesetzt werden sollen, ausgesetzt werden entsprechend der speziellen Versuchsdesign vor der Zellernte. Anmerkung: Die Zellen wurden auf 12,5 ug Chlorambucil / ml DMEM ausgesetzt24 h. Im Hinblick auf die spezifische experimentelle Design können Befehle variieren.
3. Ernte EWG und bestimmen die Zellzahl mit Hilfe einer Zählkammer. Hinweis: Die automatische Zählgeräte verwendet werden, sollte aber mit Vorsicht verwendet werden: manuelle Zellzählung ist genauer und ist sehr zu empfehlen.
4. Gib 500 & mgr; l Zellkulturmedium in die untere Kammer Raum des Boyden Chamber.
5. In genau 10 ⁴ EWG in 500 ul Zellkulturmedium pro Filtereinsatz in der oberen Kammer Fach. Beseitigen Sie Luftblasen.
6. Inkubieren Sie die Filtereinsätze in den Inkubator für genau 8 Stunden.
7. Spülen mit PBS einmal und ersetzen Sie das Medium mit 0,5 ml 4% Paraformaldehyd in beiden Fächern für 25 min für die Zellfixierung. Das Filter ausgiebig waschen, aber mindestens 3-mal mit 0,1 M PBS.
8. Verbrauchsteuern, die Membranen mit einem Skalpell.
9. Montieren Sie die Membran zwischen zwei Glasplättchen mit Eindeckmedium enthält DAPI zur Kern staining. Achten Sie auf die Ausrichtung. Sicherzustellen, dass nur Zellen, die in Richtung der unteren Kammer der Membran gewandert sind, gezählt.
10. Zählen von Zellen, die in Richtung der unteren Abteilseite der Membran mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 400-facher Vergrößerung gewandert sind. Nicht zu verwechseln Membranporen mit migrierten Zellen (1A, 1B). Untersuchen Sie eine angemessene Anzahl von biologischen Replikaten (mindestens 3 biologischen Wiederholungen pro Bedingung).

4. Wundheilung Assay

1. In Abhängigkeit von der verfügbaren Ausrüstung, sorgfältig auswählen, die Zellkulturschalen oder Platten: Bei der Verwendung von DIC-Mikroskopie, zu vermeiden Kunststoffoberfläche basierend Kulturschalen oder Well-Platten, sondern verwenden Glas basierten Geräten statt.
   Hinweis: Bei Verwendung Phasenkontrastmikroskopie, können Kunststoffgerichten verwendet werden.
2. Kultivieren EWG in einem geeigneten Zellkulturvorrichtung (zB 4 cm Glasboden Petrischale für Live Cell Imaging), Bis 80% Zusammenfluss. Wichtig: nicht kultivieren die Zellen bis zur Konfluenz abzuschließen.
3. Rubbeln Sie an der Monoschichten mit 10 ul sterile Pipettenspitzen. Schieben Sie die Spitze vorsichtig ohne zu viel Druck auf der Geschirroberfläche und verschieben Sie sie in einer geraden Linie sanft von einer Seite auf die other.Wash die Zellen zweimal mit 0,1 M PBS, um abgelösten Zellen zu entfernen.
4. Hinzufügen einer ausreichenden Menge des Mediums in die Kulturschale. Falls zutreffend, fügen Sie Verbindungen, die untersucht werden sollten.
   Anmerkung: 1.5 ml Medium, enthaltend 15 ng / ml Alpha-Linolensäure zugegeben.
5. Montieren Sie die Kulturschale unter dem Mikroskop in der Lage, Live Cell Imaging. Sicherzustellen, 5% CO _2, 37 ° C und feuchter Atmosphäre.
   Anmerkung: Die Befeuchtung ist besonders wichtig, mittlere Verdunstung zu vermeiden.
6. Erwerben Sie Zeitrafferbilder über 24 Stunden bei 10 min-Takt. Plan für große Dateigrößen. Hinweis: Eine Auflösung von 512 x 512 Pixeln ist in der Regel ausreichend; Wir empfehlen jedoch die Verwendung von Bildern von mindestens 1.024 x 1,024.
7. Messen Sie die Spaltbreite bei t = 0 h und bei t = 24 h unter Verwendung des Werkzeuglänge der Software mit dem Mikroskop geliefert oder verwenden Sie Open-Source-Software (zB ImageJ). Anmerkung: In der Regel spezifische Bilderfassung und -analyse-Software wird durch den Hersteller zur Verfügung gestellt. Daher ist für technische Details in Bezug auf die Verwendung der Software finden Sie in der Bedienungsanleitung.

5. Zelltracking

1. In Abhängigkeit von der verfügbaren Ausrüstung, sorgfältig auswählen, die Zellkulturschalen oder Platten: Bei der Verwendung von DIC-Mikroskopie, zu vermeiden Kunststoffoberfläche basierend Kulturschalen oder Well-Platten, sondern verwenden Glas basierten Geräten statt.
   Hinweis: Bei Verwendung Phasenkontrastmikroskopie, können Kunststoffgerichten verwendet werden.
2. Seed 5 × 10 ⁴ EWG in DMEM ergänzt in einem geeigneten Zellkulturvorrichtung (beispielsweise 24-Multiwell-Platte) und pflegen Sie die Zellen mit 5% CO ₂ bei 37 ° C und 95% Luftfeuchtigkeit für 1-2 Tage.
3. Wenn Zellen wurden bis zu einer 80 gewachsen% Konfluenz, entfernen Sie die Medien und Kultur der Zellen mit neuen Medien in Anwesenheit der jeweiligen Testsubstanzen (zB 12,5 ug Chlorambucil / ml DMEM). Immer auch die Kontrollzellen (mit dem Lösungsmittel, zum Beispiel Ethanol behandelt) bei 37 ° C für eine bestimmte Zeitdauer (24 Stunden, abhängig von der individuellen Assay-System).
4. Montieren Sie die Kulturschale unter dem Mikroskop in der Lage, Live Cell Imaging (37 ° C, 5% CO ₂ und 95% Luftfeuchtigkeit). Erwerben Sie Zeitrafferbilder über 24 Stunden in vordefinierten Intervallen. Erwerben Sie Bilder in 10-Minuten-Intervallen.
5. Führen Sie manuell die Verfolgung der EWG durch den Einsatz der ImageJ Plugin MTrackJ. Wählen Sie 10-Zellen nach dem Zufallsprinzip aus dem Sichtfeld und verfolgen ihre Bewegungen, indem Sie einen Datenpunkt pro Punkt in der Zeit mit dem Befehl von MTrackJ "Hinzufügen".

Hinweis: MTrackJ ist kostenlos abrufbar und ImageJ ist availab [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le bei [Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. Ein ausführliches Handbuch über die MTrackJ Plugin auf "http://www.imagescience.org" zur Verfügung.

6. Live Cell Imaging / Bewertung des mitochondrialen Membranpotentials

1. Kultivieren EWG in einem geeigneten Zellkulturvorrichtung (zB 4 cm Glasboden Petrischale für Live Cell Imaging) bis zu einer 80% Zusammenfluss.
   Wichtig: kultivieren Sie die Zellen bis zur Konfluenz abzuschließen.
2. Falls zutreffend, setzen die Zellen gegenüber Chemikalien. Anmerkung: Die Zellen wurden zu 12,5 & mgr; g / ml Chlorambucil 24 h ausgesetzt. Im Hinblick auf die spezifische experimentelle Design können Befehle variieren.
3. Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung von Tetramethylrhodamin (TMRM) in DMSO. Vor Licht schützen. Hinweis: Die Stammlösung kann bei -20 ° C gelagert werden.
4. Von der Stammlösung in Zellkulturmedium zu einer Arbeitslösung mit einer Konzentration von 10 uM (1: 1000 Verdünnung). Vor Licht schützenund die Verwendung als schnell wie möglich. Hinweis: Die Arbeitslösung kann bei Raumtemperatur für einige Zeit (> 1 h) gehalten werden, jedoch Zubereitung eines frischen Arbeitslösung ist sehr zu empfehlen.
5. In 2 ul der Arbeitslösung zu 1 ml frisches Zellkulturmedium (Beladungslösung).
6. Laden der Zellen durch Austausch des Zellkulturmedium mit der Auftragslösung. Proben für 15 min bei 37 ° C, 5% CO ₂ und befeuchteter Atmosphäre (Brutschrank). Achtung: Fast alle Fluoreszenzindikatoren werden von lebenden Zellen mit der Zeit ausgeführt werden; Daher vermeiden längerer Belastung oder verzögerten Analyse.
7. Ohne Waschen, die Schale unter einem geeignet für Live Cell Imaging Mikroskop. Wichtig: Fluoreszenzindikatoren sind sehr lichtempfindlich, daher unnötige Lichtexposition.
8. Bilder zu erwerben, ohne die Erfassungsparameter, um die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Bilder zu gewährleisten.

Ergebnisse

Dermale Exposition Alkylierungsmittel provoziert Rötung, Blasenbildung und Hautgeschwürbildung, die mit einer Wundheilungsstörung assoziiert ist. Wundheilung erfordert Angio- und Vaskulogenese, die auf die Migration von Endothelzellen beruhen. Quantitative Migration kann durch die Verwendung des Boyden-Kammer-Assays bewertet werden. Wie in 1C Belichtung EWG zum eingesetzten Alkylierungsmittel Chlorambucil gezeigt führte zu einer signifikanten Abnahme der Zellmigration ^9. Neben der ROS-Sca...

Diskussion

Dermale Exposition gegenüber giftigen Chemikalien führt oft zu schweren Wundheilungsstörung. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind weitgehend unbekannt. Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der aus verschiedenen Phasen (Hämostase, Entzündung, Proliferation und Remodellierung) besteht. Zellmigration in jeder Phase, wie auch immer, ist es von größter Bedeutung für die Bildung von Granulationsgewebe. Hier werden neue Blutgefäße entweder durch Angio- oder Vaskulogenese gebildet.

Be...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Boyden Chamber
Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm	Corning Incorporated	#351151
Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm	Life Sciences	#351152
(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)
Wound  healing assay
Glass bottom dishes	Word Precision Instruments, Inc.	#FD35-100
Assessment of mitochondrial potential
TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)	Life Technologies	#T669
Cell culture
Accutase	PAA, Pasching, Austria	# L11-007
α-Linolenic acid	Fluka (Sigma), Steinheim, Germany	# L2376
Chlorambucil	Fluka (Sigma), Steinheim, Germany	# 23125
Gelatin	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	# G2500-100G