Evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas

Resumen

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Resumen

La exposición a sustancias químicas (incluyendo alquilantes agentes de guerra química, como mostazas de azufre y nitrógeno) causa una gran cantidad de síntomas clínicos incluyendo trastorno de cicatrización de heridas. El proceso fisiológico de la cicatrización de la herida es muy compleja. La formación de tejido de granulación es un paso clave en este proceso resulta en un cierre de la herida preliminar y proporcionar una red de nuevos vasos sanguíneos capilares - ya sea a través de la vasculogénesis (formación de novela) o la angiogénesis (crecimiento de vasos existentes). Tanto vasculopatía y la angiogénesis requieren funcional, la migración dirigida de células endoteliales. Por lo tanto, la investigación de la migración temprana de células endoteliales (CEE) es importante para comprender la fisiopatología de los trastornos inducidos química herida curativa y potencialmente identificar nuevas estrategias para la intervención terapéutica.

Se evaluó la alteración de la cicatrización de la herida después de la exposición alquilantes agente y probado compuestos candidatos potenciales para el tratamiento. Se utilizó un conjunto de técnicas descritas en este protocolo. Una cámara de Boyden modificada para investigar cuantitativamente chemokinesis del CEE se describe. Además, se ilustra el uso de la cicatrización de la herida ensayo en combinación con el análisis de pista para evaluar cualitativamente la migración. Finalmente, se demuestra el uso de la TMRM colorante fluorescente para la investigación del potencial de membrana mitocondrial para identificar los mecanismos subyacentes de la migración celular perturbada. El siguiente protocolo describe las técnicas básicas que han sido adaptados para la investigación de la CEE.

Introducción

La migración celular es importante en muchos procesos fisiológicos y fisiopatológicos, incluyendo el desarrollo, diversas enfermedades, y curación de heridas después de una lesión de la piel.

Después de una lesión de la piel, la inflamación elimina unidades de tejido de granulación y dañadas o necróticas cierre de la herida preliminar y permite la formación de una red de nuevos capilares a través de la vasculogénesis (formación de novela) o la angiogénesis (surgimiento de vesículas existentes) ^1-3. Tanto vasculopatía y la angiogénesis requieren migración de las células endoteliales. La creciente red de vasos sanguíneos es esencial para el transporte de oxígeno y nutrientes a la proliferación de los queratinocitos que sufren en última instancia, la queratinización, formar un nuevo epitelio y proporcionar cierre de la herida.

Deterioro de la migración de las células endoteliales es una causa subyacente de la cicatrización de heridas trastorno ^4,5. Por lo tanto, los métodos para evaluar la migración de las células endoteliales primeros están obligados a explorar la pathophysiolgía de trastornos de la migración celular y para identificar nuevas estrategias para la intervención terapéutica.

La exposición dérmica a los agentes alquilantes (por ejemplo, azufre y mostazas de nitrógeno) provoca la cicatrización de heridas trastorno ^6. Estos compuestos se utilizan como agentes de guerra química en varios conflictos en el siglo 20 y se mantienen razón de gran preocupación debido a las reservas existentes en regiones políticamente inestables y la relativamente simple síntesis. Aunque la mostaza de azufre se sintetizó por primera vez en 1822, la patología molecular y clínica de la exposición SM no se entiende en detalle y no antídoto para la exposición SM ha sido identificado.

Se han realizado varios estudios para entender y modelar problemas de cicatrización de la herida después de la exposición SM y para detectar si existen compuestos candidatos potenciales capaces de reservar ese efecto. Schmidt et al. (2009) probó el efecto de clorambucilo, un compuesto alquilante con propiedades similares a SM en mouSE modelos de cuerpo embrioide y encontrado una, a veces dramática reducción de más del 99% en la formación de vasos ^7. Este efecto adverso fue más pronunciado en una etapa de desarrollo que, en condiciones fisiológicas, está dominada por la proliferación y migración de las células precursoras endoteliales vasculares. Por lo tanto, se identificaron estas células para ser particularmente sensibles a los agentes alquilantes. Steinritz et al. (2010) probó eliminadores de especies reactivas de oxígeno (ROS), en particular, N-acetilcisteína (NAC) y el ácido alfa linolénico (ALA) por su capacidad para reducir la toxicidad SM en modelos de ratón del cuerpo embrioide y, en particular, a restaurar la formación de vasos ^8. Se observaron efectos protectores temporales, lo que indica que la formación excesiva de ROS era probable que contribuya a los efectos adversos de SM en la cicatrización de heridas. Estos efectos no eran permanentes y los dos compuestos candidatos pueden no ser capaz de restaurar la formación de vasos y la cicatrización de heridas en el largo plazo ^8. However, esos experimentos se realizaron en un modelo 3D complejo que hizo permitir la investigación de la migración celular. Por lo tanto, posteriormente probado NAC y ALA para los efectos beneficiosos sobre la migración de células de CEE que tienen un papel clave en el proceso de formación de vasos ^9.

Además, hay evidencia de que se requiere la polaridad celular para la migración celular. La disfunción mitocondrial que conduce a la formación de ROS se demostró que deteriorar la polaridad celular y por lo tanto puede afectar adversamente la migración celular. Por lo tanto, se realizó imágenes de células vivas con respecto a la función mitocondrial y se examinaron los efectos de los basureros ROS. El siguiente protocolo describe los requisitos generales para el cultivo de la CEE, el ensayo de cámara de Boyden, la cicatrización de heridas ensayo incluyendo el análisis de rastreo celular y el uso de TMRM para la evaluación de la función mitocondrial en detalle. Se destacan aspectos importantes de protocolos experimentales para el cultivo CEE y la migración.

Protocolo

El siguiente protocolo describe técnicas para la investigación de los principios de la migración celular endotelial. El cultivo apropiado de las células endoteliales vasculares requiere pre-revestimiento de frascos de cultivo celular con gelatina para asegurar la proliferación y el mantenimiento de un fenotipo endotelial.

1. Pre-recubrimiento de frascos de cultivo celular

1. Disolver la gelatina en PBS 0,1 M a una concentración final de 0,1%.
2. Autoclave la solución con parámetros para autoclave líquido (para más detalles ver las instrucciones del autoclave específico).
3. Añadir un volumen suficiente de la solución de gelatina en autoclave a un matraz de cultivo celular estéril (por ejemplo, al menos 5 ml para un matraz de cultivo celular T25).
4. Transferencia de los matraces en una incubadora (37 ° C, 5% de CO ₂ no es necesaria, pero no interfiere) durante al menos 30 min.
5. Retire la solución de gelatina restante. Utilice los frascos previamente recubierto posteriormente (véase el cultivo celular) o srasgó en condiciones estériles hasta su uso.

2. El cultivo celular de las células endoteliales primeros

Nota: células madre embrionarias derivadas de células endoteliales primeros (CEE) se obtuvieron a partir de cuerpos embrioides murinos diferenciados por clasificación de células magnético activado de la fracción de células PECAM-1 positivo como se describe anteriormente ^10,11.

1. Cultura CEE sobre placas de cultivo celular recubiertas con gelatina en DMEM suplementado con 15% de FCS, 50 U / ml de penicilina, 50 U / ml de estreptomicina, 200 mM L-glutamina, 100 mM ß-mercaptoetanol y 1% de aminoácidos no esenciales. Manipular células en condiciones estériles. Cultivar las células con 5% de CO ₂ a 37 ° C y 95% de humedad hasta sub-confluencia (máx. 80%).
2. En sub-confluencia, dividir las células a una proporción de 1: 5. Nota: El desprendimiento de las células endoteliales es un paso crítico.
   1. Recoger las células con RT accutase. Retire los medios de comunicación, enjuagar con PBS y añadir 1 ml de accutase por 25 cm ^2.
   2. Incubar el matraz a temperatura ambiente durante 2-10 min hasta que las células se han desprendido. Dispersar las células y transferirlos a la aplicación deseada. Nota: Un neutralización química de la accutase no se requiere, ya que tiene lugar cuando las células sembradas se almacenan en la incubadora a 37 ° C. Sin embargo, accutase actividad también se puede disminuir mediante la adición de DMEM que contiene FCS.

3. Cámara Boyden

Nota: Los ensayos de cámara de Boyden se llevan a cabo mediante el uso de sistemas de inserción de tereftalato de polietileno de luz opaca con 8 micras de tamaño de poro.

1. Pre-coat los insertos de filtro (que caben dentro de pocillos de cultivo celular, creando así una cámara de Boyden) mediante la adición de 500 l de 0,1% de gelatina disueltos en 0,1 M PBS durante al menos 30 min.
2. Si las células son de estar expuestos a productos químicos tóxicos, exponer de acuerdo con el diseño experimental específico antes de la recolección de células. Nota: Las células fueron expuestas a 12,5 g clorambucil / ml DMEMdurante 24 horas. Con respecto al diseño experimental específica, las instrucciones pueden variar.
3. Cosecha CEE y determinar el número de células mediante el uso de una cámara de celular contando. Nota: Los dispositivos automáticos de conteo pueden utilizarse, pero deben usarse con precaución: el recuento de células manual es más precisa y es muy recomendable.
4. Añadir 500 l medio de cultivo celular en el compartimiento de la cámara inferior de la cámara de Boyden.
5. Agregar exactamente 10 ⁴ 500 CEE en medio de cultivo celular l por elemento filtrante en el compartimiento de la cámara superior. Eliminar las burbujas.
6. Incubar los insertos de filtro en la incubadora durante exactamente 8 horas.
7. Enjuagar con PBS una vez y reemplazar el medio con 0,5 ml 4% de paraformaldehído en ambos compartimientos durante 25 min para la fijación celular. Lavar el filtro ampliamente pero por lo menos 3 veces con 0,1 M PBS.
8. Extirpar las membranas con un bisturí.
9. Monte la membrana entre dos cubreobjetos de vidrio con medio de montaje que contiene DAPI para stainin nuclearg. Preste atención a la orientación. Asegúrese de que sólo las células que han migrado hacia el lateral del compartimento inferior de la membrana se cuentan.
10. Recuento de células que han migrado hacia el lateral del compartimento inferior de la membrana con un microscopio de fluorescencia a una ampliación de 400X. No confunda poros de la membrana con células migraron (Figura 1A, 1B). Investigar un número razonable de réplicas biológicas (al menos 3 repeticiones biológica por condición).

4. Curación de Heridas Ensayo

1. Dependiendo del equipo disponible, elegir con cuidado las placas de cultivo celular o placas: Cuando se utiliza la microscopía DIC, evitar la superficie de plástico placas de cultivo basados ​​o placas bien pero utilizar dispositivos basados ​​vidrio en su lugar.
   Nota: Si se utiliza la microscopía de contraste de fase, basada en platos de plástico también se pueden utilizar.
2. Cultivar CEE en un dispositivo de cultivo celular adecuado (por ejemplo, 4 cm con fondo de cristal placa de Petri adecuado para imágenes de células vivas) Hasta 80% de confluencia. Importante: no cultivar las células para completar confluencia.
3. Raspe las monocapas con 10 puntas de pipeta estériles l. Empuje la punta suavemente sin demasiada presión sobre la superficie del plato y moverlo en línea recta suavemente de un lado a other.Wash las células dos veces con 0,1 M PBS para eliminar las células desprendidas.
4. Añadir un volumen suficiente de medio a la placa de cultivo. En su caso, añadir compuestos que deben ser investigados.
   Nota: 1,5 ml de medio que contiene 15 ng / ml alfa se añadió ácido linolénico.
5. Monte la placa de cultivo con un microscopio capaz de imágenes de células vivas. Asegúrese de 5% de _CO2, 37 ° C y una atmósfera húmeda.
   Nota: La humidificación es especialmente importante para evitar la evaporación medio.
6. Adquirir imágenes con lapso de tiempo de más de 24 horas a intervalos de 10 min. Plan de archivos de gran tamaño. Nota: Una resolución de 512 x 512 píxeles suele ser suficiente; Sin embargo, se recomienda el uso de imágenes de al menos 1024 x 1,024.
7. Mida la anchura del hueco en t = 0 horas y en t = 24 h utilizando la herramienta de longitud del software suministrado con el microscopio o el uso de software de código abierto (por ejemplo, ImageJ). Nota: En general, el software específico de adquisición y análisis de imagen es proporcionada por el fabricante. Por lo tanto, para los detalles técnicos relacionados con el uso del software, consulte el manual.

Seguimiento 5. celular

1. Dependiendo del equipo disponible, elegir con cuidado las placas de cultivo celular o placas: Cuando se utiliza la microscopía DIC, evitar la superficie de plástico placas de cultivo basados ​​o placas bien pero utilizar dispositivos basados ​​vidrio en su lugar.
   Nota: Si se utiliza la microscopía de contraste de fase, basada en platos de plástico también se pueden utilizar.
2. Semilla de 5 x 10 ⁴ CEE en DMEM complementado en un dispositivo de cultivo celular adecuado (por ejemplo, placa de 24 pocillos múltiples) y cultivar las células con 5% de CO ₂ a 37 ° C y 95% de humedad durante 1-2 días.
3. Cuando las células han crecido hasta un 80% De confluencia, retire los medios y la cultura de las células con los nuevos medios de comunicación en la presencia de las sustancias de ensayo respectivos (por ejemplo, 12,5 g clorambucil / ml de DMEM). Siempre incluir células de control (tratados con el disolvente, por ejemplo, etanol) a 37 ° C durante un cierto período de tiempo (24 hr, dependiendo del sistema de ensayo individual).
4. Montar la placa de cultivo bajo un microscopio capaz de formación de imágenes en vivo de células (37 ° C, 5% de CO ₂ y 95% de humedad). Adquirir imágenes con lapso de tiempo de más de 24 horas a intervalos predefinidos. Adquirir imágenes a intervalos de 10 min.
5. Realizar seguimiento manual del CEE, por el uso del plugin de ImageJ MTrackJ. Elija 10 células al azar desde el campo de visión y un seguimiento de sus movimientos mediante la adición de un punto de datos por cada punto en el tiempo con el "Añadir" mando de MTrackJ.

Nota: MTrackJ está disponible de forma gratuita en y ImageJ es availab [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le a [Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. Un manual detallado sobre el plugin MTrackJ está disponible en "http://www.imagescience.org".

6. Imágenes de células vivas / Evaluación de la membrana mitocondrial Potencial

1. Cultivar CEE en un dispositivo de cultivo celular adecuado (por ejemplo, 4 cm de vidrio placa de Petri fondo adecuado para imágenes de células vivas) hasta una confluencia del 80%.
   Importante: No cultivar las células para completar confluencia.
2. En su caso, exponer las células a los productos químicos. Nota: Las células fueron expuestas a 12,5 mg / ml clorambucil durante 24 horas. Con respecto al diseño experimental específica, las instrucciones pueden variar.
3. Preparar una solución madre 10 mM de tetrametilrodamina (TMRM) en DMSO. Proteger de la luz. Nota: La solución madre se puede almacenar a -20 ° C.
4. Diluir la solución madre en medio de cultivo celular a una solución de trabajo con una concentración de 10 micras (1: 1000 dilución). Proteger de la luzy utilizar tan pronto como sea posible. Nota: La solución de trabajo se puede mantener a temperatura ambiente durante algún tiempo (> 1 hr), sin embargo, es muy recomendable preparación de una solución de trabajo fresco.
5. Añadir 2 l de la solución de trabajo de 1 ml de medio (solución) de carga fresca de cultivo celular.
6. Cargar las células mediante la sustitución del medio de cultivo celular con la solución de carga. Incubar durante 15 minutos a 37 ° C, 5% de CO ₂ y el ambiente humidificado (incubadora). Precaución: Casi todos los indicadores de fluorescencia son exportados por las células a través del tiempo de vida; por lo tanto, evitar la carga prolongada o retardada análisis.
7. Sin lavado, colocar el plato con un microscopio adecuado para imágenes de células vivas. Importante: los indicadores de fluorescencia son muy sensibles a la luz, por lo tanto, evitar la exposición a la luz innecesaria.
8. Adquirir imágenes sin cambiar los parámetros de adquisición para asegurar la comparabilidad entre las diferentes imágenes.

Resultados

La exposición dérmica a los agentes alquilantes provoca eritema, formación de ampollas y la ulceración dérmica que está asociada con un trastorno de cicatrización de la herida. La cicatrización de heridas requiere vasculogénesis y angiogénesis, que se basa en la migración de las células endoteliales. Migración cuantitativa se puede evaluar mediante el uso del ensayo de cámara de Boyden. Como se muestra en la Figura 1C de la exposición a la CEE clorambucil agente alquilante dado lugar a un...

Discusión

La exposición dérmica a productos químicos tóxicos a menudo resulta en el trastorno de la cicatrización de heridas graves. Los mecanismos subyacentes son en gran parte desconocido. La cicatrización de heridas es un proceso complejo que consta de diferentes fases (hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación). La migración celular está involucrado en cada fase, sin embargo, es de suma importancia para la formación del tejido de granulación. Aquí, los nuevos vasos sanguíneos se forman ya sea por an...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Boyden Chamber
Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm	Corning Incorporated	#351151
Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm	Life Sciences	#351152
(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)
Wound  healing assay
Glass bottom dishes	Word Precision Instruments, Inc.	#FD35-100
Assessment of mitochondrial potential
TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)	Life Technologies	#T669
Cell culture
Accutase	PAA, Pasching, Austria	# L11-007
α-Linolenic acid	Fluka (Sigma), Steinheim, Germany	# L2376
Chlorambucil	Fluka (Sigma), Steinheim, Germany	# 23125
Gelatin	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	# G2500-100G