Évaluation de la migration des cellules endothéliales après une exposition à des produits chimiques toxiques

Résumé

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Résumé

L'exposition à des substances chimiques (y compris les agents alkylants de guerre chimiques tels que les moutardes à l'azote et soufre) provoque une grande variété de symptômes cliniques, y compris le trouble de guérison de la plaie. Le processus physiologique de cicatrisation de la plaie est très complexe. La formation de tissu de granulation est une étape clé dans ce processus résultant dans un avant fermeture de la plaie et de fournir un réseau de nouveaux vaisseaux sanguins capillaires - soit par vasculogenèse (formation de roman) ou angiogenèse (la germination des navires existants). Les deux vasculo- et nécessitent une angiogenèse fonctionnel, la migration dirigée des cellules endothéliales. Ainsi, l'enquête du début de cellules endothéliales (CEE) la migration est important de comprendre la physiopathologie de la plaie chimique induite par les troubles de guérison et de potentiellement identifier de nouvelles stratégies d'intervention thérapeutique.

Nous avons évalué la guérison des plaies après alkylation exposition de l'agent et testé des composés candidats potentiels pour traitement. Nous avons utilisé un ensemble de techniques décrites dans ce protocole. Une chambre de Boyden modifiée pour enquêter quantitativement chimiokinèse des CEE est décrite. En outre, l'utilisation de la cicatrisation dosage en combinaison avec l'analyse de piste afin d'évaluer qualitativement la migration est illustré. Enfin, nous démontrons l'utilisation de la TMRM de colorant fluorescent pour l'enquête du potentiel de membrane mitochondriale pour identifier les mécanismes sous-jacents de la migration cellulaire perturbé. Le protocole suivant décrit les techniques de base qui ont été adaptés pour l'étude des CEE.

Introduction

La migration cellulaire est important dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques y compris le développement, diverses maladies, et la cicatrisation après une blessure de la peau.

Après une lésion de la peau, une inflammation des tissus durs supprime granulation et endommagées ou nécrotiques préliminaire fermeture de plaie et permet la formation d'un réseau de nouveaux capillaires à travers la vasculogenèse (formation novel) ou l'angiogenèse (bourgeonnement de vésicules existants) ^3.1. Les deux vasculo- et nécessitent une angiogenèse migration des cellules endothéliales. Le réseau croissant de vaisseaux sanguins est essentielle pour le transport de l'oxygène et des nutriments à la prolifération des kératinocytes qui subissent finalement kératinisation, former un nouvel épithélium et de fournir fermeture de la plaie.

La migration des cellules endothéliales avec facultés affaiblies est une cause sous-jacente de cicatrisation ^4,5 trouble. Ainsi, les méthodes pour évaluer la migration des cellules endothéliales premiers sont nécessaires pour explorer le pathophysiolgie des troubles de la migration cellulaire et d'identifier de nouvelles stratégies d'intervention thérapeutique.

L'exposition cutanée aux agents alkylants (par exemple, de soufre et d'azote moutardes) provoque la cicatrisation trouble ^6. Ces composés ont été utilisés comme agents de guerre chimique dans plusieurs conflits dans le 20ème siècle et restent raison de vives préoccupations en raison de stocks existants dans des régions politiquement instables et la synthèse relativement simple. Bien que le gaz moutarde a été synthétisé pour la première en 1822, la pathologie moléculaire et clinique de l'exposition SM ne soit pas compris dans le détail et aucun antidote pour l'exposition SM a été identifié.

Plusieurs études ont été menées afin de comprendre et de modéliser la guérison des plaies après une exposition de SM et de tester des composés candidats potentiels capables de réserver cet effet. Schmidt et al. (2009) ont testé l'effet de chlorambucil, un composé alkylant avec des propriétés similaires à SM dans mousoi modèles de corps embryoïdes et trouvé une dramatique, réduction parfois plus de 99% dans la formation de vaisseaux ^7. Cet effet indésirable est le plus prononcé à un stade de développement qui, dans des conditions physiologiques, est dominé par la prolifération et la migration des cellules précurseurs endothéliales vasculaires. Ainsi, ces cellules ont été identifiés comme étant particulièrement sensible aux agents d'alkylation. Steinritz et al. (2010) ont testé piégeurs de formes réactives de l'oxygène (ROS), en particulier, la N-acétylcystéine (NAC) et de l'acide alpha-linolénique (ALA) pour leur capacité à réduire la toxicité SM dans les modèles de l'organisme de la souris embryoïdes et en particulier, à restaurer la formation de vaisseaux ^8. Effets protecteurs temporaires ont été observés, ce qui indique que la formation excessive ROS était susceptible de contribuer aux effets néfastes de SM sur la cicatrisation. Ces effets ne sont pas permanentes et les deux composés candidats peuvent ne pas être capable de restaurer la formation des vaisseaux et la cicatrisation dans le long terme ^8. However, ces expériences ont été menées dans un modèle 3D complexe qui a fait de permettre une enquête de la migration cellulaire. Ainsi, nous avons ensuite testé CNA et de l'ALA pour les effets bénéfiques sur la migration des cellules de la CEE qui ont un rôle clé dans le processus de la formation de vaisseaux ^9.

En outre, il est prouvé que la polarité cellulaire est nécessaire pour la migration des cellules. Dysfonction mitochondriale conduisant à la formation de ROS a été montré à porter atteinte à la polarité cellulaire et peut donc nuire à la migration cellulaire. Par conséquent, imagerie des cellules vivantes à l'égard de la fonction mitochondriale a été effectuée et les effets de charognards ROS ont été examinés. Le protocole suivant décrit les exigences générales pour la culture de la CEE, le dosage de la chambre de Boyden, la cicatrisation dosage y compris l'analyse de suivi de la cellule et l'utilisation de TMRM pour l'évaluation de la fonction mitochondriale en détail. Les aspects importants de protocoles expérimentaux pour la culture et la migration CEE sont mis en évidence.

Protocole

Le protocole suivant décrit les techniques pour l'enquête de début de la migration des cellules endothéliales. La bonne culture des cellules endothéliales vasculaires nécessite pré-revêtement de flacons de culture cellulaire avec la gélatine pour assurer la prolifération et l'entretien d'un phénotype endothélial.

1. Pré-revêtement de flacons de culture cellulaire

1. Dissoudre la gélatine dans du PBS 0,1 M à une concentration finale de 0,1%.
2. Autoclave la solution avec des paramètres pour autoclavage liquide (pour plus de détails voir les instructions de l'autoclave spécifique).
3. Ajouter un volume suffisant de la solution de gélatine à l'autoclave dans un ballon de culture cellulaire stérile (par exemple, au moins 5 ml pour un flacon de culture de cellules T25).
4. Transférer les flacons dans un incubateur (37 ° C, 5% CO ₂ ne soit pas requis, mais ne gêne pas) pendant au moins 30 min.
5. Retirer la solution de gélatine restant. Utilisez les flacons pré-enduit ensuite (voir la culture de cellules) ou sdéchiré dans des conditions stériles jusqu'à utilisation.

2. Culture cellulaire des premières cellules endothéliales

Note: cellule souche embryonnaire dérivée des cellules endothéliales début (CEE) ont été obtenues à partir des corps embryoïdes murins différenciées par tri magnétique de cellules activées de la fraction de cellules positives PECAM-1 comme décrit précédemment ^10,11.

1. Culture CEE sur des boîtes de culture de cellules revêtues de gélatine dans du DMEM supplémenté avec 15% de FCS, 50 U / ml de pénicilline, 50 U / ml de streptomycine, 200 uM de L-glutamine, 100 pM de ß-mercaptoéthanol et 1% d'acides aminés non essentiels. Poignée cellules dans des conditions stériles. Cultiver les cellules avec 5% de _CO2 à 37 ° C et 95% d'humidité jusqu'à ce que la sous-confluence (max. 80%).
2. Au sous-confluence, les cellules à séparer un rapport de 1: 5. Remarque: Le détachement des cellules endothéliales est une étape critique.
   1. Récolter les cellules avec RT Accutase. Retirez les médias, rincer avec du PBS et ajouter 1 ml de Accutase par 25 cm ^2.
   2. Incuber le flacon à température ambiante pendant 2-10 min jusqu'à ce que les cellules ont détaché. Disperser les cellules et de les transférer à l'application souhaitée. Remarque: Une neutralisation chimique de l'Accutase est pas nécessaire, car il a lieu lorsque les cellules ensemencées sont stockés dans l'incubateur à 37 ° C. Cependant, Accutase activité peut également être diminuée par l'addition du milieu DMEM contenant du FCS.

3. Boyden Chambre

Remarque: Les dosages de la chambre de Boyden sont effectuées en utilisant des systèmes d'insertion de polyéthylène téréphtalate opaque à la lumière 8 um de taille de pore.

1. Pré-enduire les inserts de filtre (qui coupe à l'intérieur des puits de culture de cellules, créant ainsi une chambre de Boyden) en ajoutant 500 ul de 0,1% de gélatine dissous dans 0,1 M de PBS pendant au moins 30 min.
2. Si les cellules doivent être exposées à des produits chimiques toxiques, selon exposer à la conception expérimentale spécifique avant la récolte des cellules. Note: Les cellules ont été exposées à 12,5 ug chlorambucil / ml de DMEMpendant 24 heures. En ce qui concerne la conception expérimentale spécifique, des instructions peuvent varier.
3. Récolte CEE et déterminer le nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage de cellules. Remarque: Les appareils de comptage automatiques peuvent être utilisés, mais doivent être utilisés avec prudence: le comptage manuel des cellules est plus précise et est fortement recommandé.
4. Ajouter 500 pi de milieu de culture de cellules dans le compartiment de la chambre inférieure de la chambre de Boyden.
5. Ajouter exactement 10 ⁴ 500 ul CEE dans un milieu de culture de cellules par insert de filtre dans le compartiment de la chambre supérieure. Éliminer les bulles.
6. Incuber les inserts de filtre dans l'incubateur pendant exactement 8 h.
7. Rincer une fois avec du PBS et remplacer le milieu par 0,5 ml de paraformaldehyde à 4% dans les deux compartiments pendant 25 minutes pour la fixation des cellules. Laver le filtre largement mais au moins trois fois avec du PBS 0,1 M.
8. Exciser les membranes avec un scalpel.
9. Monter la membrane entre deux lamelles de verre avec un milieu de montage contenant DAPI pour stainin nucléaireg. Faites attention à l'orientation. Assurez-vous que seules les cellules qui ont migré vers le côté du compartiment inférieur de la membrane sont comptées.
10. Compter les cellules qui ont migré vers le côté du compartiment inférieur de la membrane avec un microscope à fluorescence à un grossissement de 400X. Ne confondez pas les pores de la membrane avec des cellules migrées (Figure 1A, 1B). Enquêter sur un nombre raisonnable de répétitions biologiques (au moins 3 répétitions biologiques par condition).

4. Wound Healing Assay

1. Selon l'équipement disponible, choisissez avec soin les plats ou des plaques de culture cellulaire: Lorsque vous utilisez microscopie DIC, éviter des boîtes de culture à base de surface en plastique ou des plaques ainsi, mais utiliser des dispositifs à base de verre à la place.
   Remarque: Si en utilisant la microscopie à contraste de phase, plats de plastique à base peuvent également être utilisés.
2. Cultiver CEE dans un dispositif de culture de cellules approprié (par exemple, 4 cm à fond de verre boîte de Pétri approprié pour l'imagerie des cellules vivantes) Jusqu'à 80% de confluence. Important: ne pas cultiver les cellules pour compléter confluence.
3. Grattez les monocouches avec stériles 10 conseils ul de pipettes. Poussez la pointe doucement sans trop de pression sur la surface de la boîte et de le déplacer en ligne droite en douceur d'un côté à l'other.Wash les cellules deux fois avec 0,1 M de PBS pour éliminer les cellules individuelles.
4. Ajouter un volume suffisant de milieu de la boîte de culture. Le cas échéant, ajouter des composés qui devraient être étudiés.
   Note: 1,5 ml de milieu contenant 15 ng / ml alpha a été ajouté de l'acide linolénique.
5. Monter la boîte de culture sous un microscope capable d'imagerie des cellules vivantes. Veiller à 5% de CO _2, 37 ° C et une atmosphère humidifiée.
   Remarque: L'humidification est particulièrement important pour éviter l'évaporation moyenne.
6. Acquérir les images de time-lapse de plus de 24 heures à intervalles de 10 minutes. Plan pour les grandes tailles de fichiers. Remarque: Une résolution de 512 x 512 pixels est généralement suffisant; Toutefois, nous vous recommandons d'utiliser des images d'au moins 1024 x 1,024.
7. Mesurer la largeur de la fente à t = 0 h et à t = 24 h en utilisant l'outil de longueur du logiciel fourni avec le microscope ou utiliser des logiciels open-source (par exemple, ImageJ). Remarque: Dans le logiciel générale d'acquisition et d'analyse d'image spécifique est fourni par le fabricant. Par conséquent, pour les détails techniques concernant l'utilisation du logiciel, reportez-vous au manuel.

Suivi 5. cellulaire

1. Selon l'équipement disponible, choisissez avec soin les plats ou des plaques de culture cellulaire: Lorsque vous utilisez microscopie DIC, éviter des boîtes de culture à base de surface en plastique ou des plaques ainsi, mais utiliser des dispositifs à base de verre à la place.
   Remarque: Si en utilisant la microscopie à contraste de phase, plats de plastique à base peuvent également être utilisés.
2. Seed 5 x 10 ⁴ CEE complétée DMEM dans un dispositif de culture de cellules approprié (par exemple, plaque de 24 puits multiples) et de cultiver les cellules avec 5% de CO ₂ à 37 ° C et 95% d'humidité pendant 1-2 jours.
3. Lorsque les cellules ont grandi à un 80% De confluence, retirez les médias et la culture des cellules avec les nouveaux médias dans la présence de substances d'essai respectifs (par exemple, 12,5 pg chlorambucil / ml DMEM). Toujours inclure les cellules de contrôle (traitées avec le solvant, par exemple l'éthanol) à 37 ° C pendant une certaine période de temps (24 heures, selon le système de test individuel).
4. Monter la boîte de culture sous un microscope capable de l'imagerie des cellules vivantes (37 ° C, 5% de CO ₂ et 95% d'humidité). Acquérir les images de time-lapse de plus de 24 heures à des intervalles prédéfinis. Acquérir des images à intervalles de 10 min.
5. Effectuer le suivi manuellement des CEE par l'utilisation du plugin ImageJ MTrackJ. Choisissez 10 cellules au hasard dans le champ de vision et de suivre leurs mouvements en ajoutant un point de données par point dans le temps en utilisant le "Ajouter" commandement de MTrackJ.

Remarque: MTrackJ est disponible gratuitement à et ImageJ est disp [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le à [Rasband, imagej. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. Un manuel détaillé sur le plugin MTrackJ est disponible au "http://www.imagescience.org".

6. imagerie de cellules vivantes / évaluation du potentiel de membrane mitochondriale

1. Cultiver CEE dans un dispositif de culture de cellules approprié (par exemple, 4 cm bas boîte de Pétri en verre approprié pour l'imagerie de cellules vivantes) jusqu'à une confluence de 80%.
   Important: Ne pas cultiver les cellules pour compléter confluence.
2. Le cas échéant, exposer les cellules à des produits chimiques. Note: Les cellules ont été exposées à 12,5 pg / ml pendant 24 heures chlorambucil. En ce qui concerne la conception expérimentale spécifique, des instructions peuvent varier.
3. Préparer une solution à 10 mM du stock de tétraméthylrhodamine (TMRM) dans le DMSO. Protéger de la lumière. Remarque: La solution stock peut être conservé à -20 ° C.
4. Diluer la solution mère dans un milieu de culture de cellules à une solution de travail avec une concentration de 10 uM (1: 1000 dilution). Protéger de la lumièreet d'utiliser dès que possible. Remarque: La solution de travail peut être conservé à température ambiante pendant un certain temps (> 1 h), cependant, la préparation d'une solution de travail frais est fortement recommandée.
5. Ajouter 2 ul de la solution de travail à 1 ml de milieu (solution de charge) de culture cellulaire frais.
6. Charger les cellules en remplaçant le milieu de culture de cellules avec la solution de charge. Incuber pendant 15 min à 37 ° C, 5% CO ₂ et une atmosphère humidifiée (incubateur). Attention: Presque tous les indicateurs de fluorescence sont exportés par les cellules plus de temps à vivre; donc éviter de chargement prolongée ou retardée analyse.
7. Sans lavage, placez le plat sous un microscope convenant pour l'imagerie de cellules vivantes. Important: indicateurs de fluorescence sont très sensibles à la lumière, par conséquent, éviter l'exposition inutile de lumière.
8. Acquérir des images sans modifier les paramètres d'acquisition pour assurer la comparabilité entre les différentes images.

Résultats

L'exposition cutanée à des agents d'alkylation provoque l'érythème, la formation de cloques et une ulcération cutanée qui est associé à un trouble de la cicatrisation des plaies. La cicatrisation des plaies nécessite vasculogénèse angiogenèse et qui sont basées sur la migration des cellules endothéliales. Quantitative migration peut être évaluée en utilisant le dosage de la chambre de Boyden. Comme le montre la figure 1C de l'exposition de la CEE au chlorambucil agent al...

Discussion

L'exposition cutanée à des produits chimiques toxiques se traduit souvent par des troubles de cicatrisation sévère. Les mécanismes sous-jacents sont largement inconnues. La cicatrisation des plaies est un processus complexe qui se compose de différentes phases (hémostase, inflammation, prolifération et remodelage). La migration cellulaire est impliquée dans toutes les étapes, cependant, il est de la plus haute importance pour la formation du tissu de granulation. Ici, de nouveaux vaisseaux sanguins sont fo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Boyden Chamber
Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm	Corning Incorporated	#351151
Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm	Life Sciences	#351152
(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)
Wound  healing assay
Glass bottom dishes	Word Precision Instruments, Inc.	#FD35-100
Assessment of mitochondrial potential
TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)	Life Technologies	#T669
Cell culture
Accutase	PAA, Pasching, Austria	# L11-007
α-Linolenic acid	Fluka (Sigma), Steinheim, Germany	# L2376
Chlorambucil	Fluka (Sigma), Steinheim, Germany	# 23125
Gelatin	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	# G2500-100G