عالية الإنتاجية قياس خارج الخلية DNA الإصدار والكمي NET تشكيل في العدلات الإنسان<em&gt; في المختبر</em

Summary

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Abstract

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation.

Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

Introduction

NET formation is a novel mechanism by which neutrophils fight pathogens.¹ The core of NETs is nuclear DNA.¹ This DNA network is associated with neutrophil granule proteins and histones.¹ The main form of NET formation requires the death of neutrophils characterized by chromatin decondensation, disappearance of granular and nuclear membranes, translocation of neutrophils elastase to the nucleus, citrullination of histones and finally the spill of DNA-based NETs.² NETs entrap and kill a wide variety of microbes and are an essential part of the innate immune weapon repertoire. Uncontrolled NET formation has, however, been linked to numerous autoinflammatory diseases.^3,4 Despite their increasingly established relevance, little is known about the mechanism and regulation of NET release.

Neutrophils dying by releasing NETs are different from apoptotic or necrotic neutrophils.^3,5 NET-releasing neutrophils show several features that are characteristic for NET formation. Granule components are associated with DNA in NETs.¹ Myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE) are both found in primary granules in resting cells but are translocated to the nucleus to bind to DNA in NETs.¹ MPO-DNA and HNE-DNA complexes are specific for NETs, do not occur in apoptotic or necrotic neutrophils.^1,3,5 Chromatin decondensation is another feature typical for NETosis.² NET release also requires citrullination of histones by peptidyl aminidase 4 (PAD4).⁶ Citrullinated histones are hallmarks of neutrophils that underwent NET release.⁶

Here three methods are introduced that in combination provide excellent tools to quantitate NETs on a high-throughput scale. The first assay has been used on the field with different changes and quantitates extracellular DNA release in a microplate format. The second and third assays provide confirmation of NETs by measuring NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes.

Protocol

وافق مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة جورجيا دراسة موضوع الإنسان لجمع الدم المحيطي من المتطوعين الأصحاء (أوغ # 2012-10769-06). وقعت ^5،7،8 متطوعي شكل الموافقة المسبقة المطلوبة قبل سحب الدم. البحث المنجز في هذه المقالة هو في الامتثال للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للبحوث الطبية التي تجرى على البشر من إعلان هلسنكي.

1. عزل العدلات من الدم المحيطي الإنسان (الشكل 1)

ملاحظة: هناك عدة طرق لعزل العدلات من الدم المحيطي. وينص البروتوكول التالية احتمال واحد. هذا البروتوكول ينتج أعدادا كبيرة من العدلات غير المفعلة البشرية القادرة على إطلاق المستجدة على التحفيز الخارجي. استخدام 40 مل من الدم الكامل تم الحصول عليها من المتطوعين الأصحاء بواسطة بزل الوريد. ^7،9

1. قسامة 20 مل من الدم الى اثنين من أنابيب مخروطية 50 مل. إضافة 10 مل 6٪ ديكستران. المزيج بلطف.
2. بعد 20 دقيقة من نقل الكريات البيض-ريكح المرحلة العليا من دون أخذ أي خلايا الدم الحمراء مكعبات في نظيفة أنابيب مخروطية 50 مل، وملء مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
3. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج 10 دقيقة. Resuspend بيليه في 4 مل العقيمة برنامج تلفزيوني.
4. إعداد 5 خطوات Percoll التدرج من 85٪ -80٪ ​​-75٪ -70٪ -65٪ في غضون 15 مل أنابيب مخروطية وطبقة 2 مل تعليق الكريات البيض على رأس كل منهما التدرج.
5. الطرد المركزي 800 x ج لمدة 30 دقيقة مع الفرامل خارج.
6. جمع كل الخلايا (العدلات) في الطبقات في 75٪ / 80٪ و 70٪ واجهة / 75٪.
7. غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني (350 x ج، 10 دقيقة، RT) وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.

2. قياس حركية خارج الخلية DNA الإصدار باستخدام صفيحة مقياس التألق

ملاحظة: هذه الطريقة يمكن قياس التغيرات في مضان من غشاء كتيمة صبغ يدل على الافراج عن الحمض النووي على شكل صفيحة 96-جيدا ملزم الحمض النووي (الشكل 2).

1. إعداد تعليق العدلات في المتوسط ​​فحص (HBSS +1٪ (ت / ت) ذاتي المصل + 5 الجلوكوز ملم) بتركيز 2 × 10 ⁶ خلية / مل.
2. إضافة 5 مكرومول / L للغشاء كتيمة صبغ الحمض النووي ملزم. المزيج بلطف.
3. العدلات الإنسان قسامة (50 ميكرولتر / جيد) على 96-جيدا الأسود، أسفل شفافة microplates. تأكد من وسيلة فحص يغطي الجزء السفلي بأكمله من البئر. إن لم يكن، اضغط على لوحة بلطف على الجانب.
4. الاحماء لوحة تحتوي العدلات لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
5. في هذه الأثناء إعداد الحلول من المحفزات في ضعف تركيزات النهائية لاستخدامها (في 37 ° C فحص الحار المتوسطة). كما تستخدم عنصر تحكم NET إيجابية العدلات الإنسان مع 100 نيوتن متر phorbol-ميريستيت خلات (سلطة النقد الفلسطينية) لمدة 4 ساعة لإطلاق سراح القصوى NET. ^5،8 سلطة النقد الفلسطينية التحفيز لمدة 4 ساعة يضمن أقصى الإفراج NET في حين لا تزال عفوية تشكيل NET انخفاض ^5،8.
6. إعداد مقياس التألق صفيحة لقياس (4 ساعات، 37 درجة مئوية، 530 نانومتر لإثارة و 590 نانومتر للانبعاثات).
7. تحفيز العدلات بإضافة 50 ميكرولتر حل حافزا ل50 تعليق العدلة ميكرولتر. استخدام 0.5 ميكروغرام / مل سابونين في بئر واحدة لقياس القصوى إشارة إطلاق الحمض النووي.
8. وضع لوحة في القارئ وقياس التغيرات في مضان لمدة 4 ساعة في كل دقيقة 2 مع أي اهتزاز.
9. لتحليل البيانات، وحساب الزيادات طبيعية في مضان مع مرور الوقت.
   1. مضان خط الأساس طرح من القيم نقطة النهاية لجميع الآبار بما في ذلك سابونين (الشكل 2A، B). وينبغي أن يكون الارتفاع في مضان سابونين أعلى إشارة. يشار إليها باسم "الافراج عن الحمض النووي القصوى" (الشكل 2A).
   2. حساب النسب المئوية لإطلاق الحمض النووي في العينات المجهولة بقسمة زيادات في مضان من العينات المجهولة من قبل الافراج عن الحمض النووي القصوى.
   3. النتائج متوسط ​​مكررات وتمثل هذه الاتهامات بأنها "٪ من إطلاق الحمض النووي القصوى" (الشكل 2C).

3. الكميات من نموذج NETأوجه من الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي والحمض النووي HNE-ELISA فحوصات

ملاحظة: هذه المقايسات المعدلة (MPO-DNA) أو المنشأة (HNE-DNA) في المختبر لدينا quantitate تشكيل NET عن طريق قياس مستويات MPO-DNA والمجمعات HNE-DNA ^5.

1. معطف 96-جيدا قدرة لوحات ELISA بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة القبض على (50 ميكرولتر / جيد) ملزمة عالية: مكافحة MPO (1: 2000 تمييع) أو مكافحة HNE (1: 2000).
2. لوحات غسل ELISA ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (200 ميكرولتر / جيد) ومنعها مع 5٪ BSA و 0.1٪ ألبومين المصل البشري لمدة 2 ساعة على RT (200 ميكرولتر / جيد). يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
3. العدلات البذور على 96-جيدا microplates في مناطق ذات كثافة من 100000 خلية / جيدا في 100 متوسطة ميكرولتر الفحص، وتحفيز تشكيل NET. احتضان الخلايا: 4 ساعات لمدة 37 درجة مئوية.
4. إجراء عملية الهضم الدناز محدود بإضافة 2 U / الدناز ميليلتر supernatants العدلة، مزجها جيدا. الاحتفاظ بها في RT.
5. وقف الدناز بعد 15 دقيقة وذلك بإضافة 11 ميكرولتر 25 ملي EGTA (تركيز النهائي 2.5 ملم). اخلط جيدا. جمع سوpernatants في أنابيب microfuge نظيفة. عينات تدور لتخلص من حطام خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نقل supernatants بهم في أنابيب microfuge نظيفة. الاحتفاظ بها على الجليد حتى جاهزة.
6. استخدام قسامة من معدة مسبقا "المعيار NET".
   ملاحظة: المعايير NET هي مزيج من supernatants هضم الدناز العدلات حفز سلطة النقد الفلسطينية، تم الحصول عليها من لا يقل عن 5 مختلف الجهات المانحة الإنسان ومستقلة.
   1. لاستخدام نفس المعايير لفترة طويلة، وجمع وقسامة كمية كبيرة من supernatants العدلة من كل جهة مانحة فردية. وجمع على سبيل المثال 2 مل من supernatants هضم الدناز العدلات حفز سلطة النقد الفلسطينية، يؤدي في 200 قسامات (10 ميكرولتر لكل منهما) ما يكفي ل 200 لوحات ELISA. تم العثور على البيانات التي تميز مستوى NET في الشكل (5).
   2. تحفيز العدلات الإنسان مع 100 نيوتن متر سلطة النقد الفلسطينية لمدة 4 ساعة وتطبيق الدناز هضم لsupernatants وفقا خطوات 3،4-3،5.
   3. جمع وحمام سباحة، قسامة (10 ميكرولتر) ومجاناsupernatants زي (-20 درجة مئوية) العدلات.
   4. لإعداد "NET-المعيار"، ذوبان قسامة واحد / المانحة تم الحصول عليها من لا يقل عن خمسة المانحين منفصلة، ​​مزجها والاحتفاظ بها على الجليد.
   5. تجاهل عينات إذابة واستخدام الطازجة للتجربة القادمة.
   6. إعداد 1: التخفيف المتسلسل 2 للمستوى NET في برنامج تلفزيوني + EGTA.
7. تمييع عينات هضمها DNase1 (معيار وsupernatants غير معروف) 20 ضعفا في برنامج تلفزيوني + EGTA وقسامة لهم على لوحات ELISA المغلفة مع الأجسام المضادة القبض عليه.
8. احتضان لوحات ELISA أكثر من ليلة في 4 درجات مئوية، وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
9. تطبيق حل الكشف عن الأجسام المضادة (100 ميكرولتر / جيد): الحصان الفجل البيروكسيداز مترافق الأجسام المضادة لمكافحة الحمض النووي (1: 500، والماوس). احتضان لمدة 1 ساعة في الظلام.
10. بعد أربعة يغسل مع برنامج تلفزيوني إضافة تمب البيروكسيديز الركيزة: 100 ميكرولتر / جيد و 30 دقيقة. تلوين الأزرق هو مؤشر للنشاط البيروكسيديز (المستجدة الحالية).
11. وقف رد الفعل من خلال إضافة 100 ميكرولتر / جيد 1 M حمض الهيدروكلوريك. السوف حلول الزرقاء تتحول الصفراء (الشكل 5A).
12. قراءة الامتصاصية في 450 نانومتر باستخدام مضواء صفيحة.
13. لتحليل البيانات، وحساب كمية MPO-DNA أو المجمعات HNE-DNA بالمقارنة مع مستوى NET.
    1. طرح الخلفية قيمة الكثافة الضوئية للوسط الفحص من جميع العينات.
    2. رسم القيم الامتصاصية (المحور السيني) من العينات القياسية مخففة ضد محتواها النسبي NET (Y-محور) (الشكل 5A).
    3. باستخدام مجموعة nonsaturated من هذا المنحنى القياسي إنشاء خط الاتجاه (استخدم تناسب أفضل الهائل من البرامج المستخدمة) (الشكل 5A). معادلة هذا الخط يحدد تحويل القيم OD من الكمية مبالغ المستجدة.
    4. إدراج القيم OD قياس من المجاهيل في المعادلة خط الاتجاه من 3.13.3 من شأنها أن تعطي كمية المستجدة في عينة مجهولة كنسبة مئوية من المعايير NET (الشكل 5A).
    5. حسابمتوسطات مكررات (يثلث) وتقديم البيانات النهائية بأنها "كمية MPO-DNA أو المجمعات HNE الحمض النووي (٪ من المعيار)" (الشكل 5C).

النتائج

الأرقام في هذه المخطوطة تصف طريقة العزلة العدلة والإجراءات التجريبية، ونتائج ممثل الحالية مع شرح لتحليل البيانات. يبين الشكل 1 في خطوات متتابعة من إعداد العدلات البشري. ويمثل هذا البروتوكول واحد فقط طريقة ممكنة من العزلة العدلة. انه يعطي ك...

Discussion

تمثل المستجدة آلية جديدة رائعة التي العدلات قتل مسببات الأمراض. ¹ على الرغم من أن الأدب والمستجدة تم التوسع بشكل مستمر على مدى السنوات العشر الماضية منذ اكتشافهم، عدة أسئلة هامة تتعلق دورها في علم الأحياء، وآلية وتنظيم لا تزال غير واضحة. المنهجية المناسبة لابد ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x coated
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)	Millipore	07-496	1:2,000x coated
DNase-1	Roche	10-104-159-001	1 µg/ml used for digestion
20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Eon Microplate Spectrophotometer	Biotek
Gen5 All-in-One microplate software	Biotek		analytical tool (ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0.2% final concentration/volume
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Use 10 mM final concentration.
1 M glucose	Sigma		Use 5 mM final concentration.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final used
ELISA Plate	Greiner bio-one	655061
Conical tubes 15 ml	Thermoscientific	339650
Conical tubes 50 ml	Thermoscientific	339652
Percoll (pH 8.5-9.5)	Sigma	P 1644	Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 media	Corning Cellgro	17-105-CV
96 well assay plate black plate clear bottom	Costar	3603