세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성<em&gt; 체외</em

요약

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

초록

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation.

Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

서문

NET formation is a novel mechanism by which neutrophils fight pathogens.¹ The core of NETs is nuclear DNA.¹ This DNA network is associated with neutrophil granule proteins and histones.¹ The main form of NET formation requires the death of neutrophils characterized by chromatin decondensation, disappearance of granular and nuclear membranes, translocation of neutrophils elastase to the nucleus, citrullination of histones and finally the spill of DNA-based NETs.² NETs entrap and kill a wide variety of microbes and are an essential part of the innate immune weapon repertoire. Uncontrolled NET formation has, however, been linked to numerous autoinflammatory diseases.^3,4 Despite their increasingly established relevance, little is known about the mechanism and regulation of NET release.

Neutrophils dying by releasing NETs are different from apoptotic or necrotic neutrophils.^3,5 NET-releasing neutrophils show several features that are characteristic for NET formation. Granule components are associated with DNA in NETs.¹ Myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE) are both found in primary granules in resting cells but are translocated to the nucleus to bind to DNA in NETs.¹ MPO-DNA and HNE-DNA complexes are specific for NETs, do not occur in apoptotic or necrotic neutrophils.^1,3,5 Chromatin decondensation is another feature typical for NETosis.² NET release also requires citrullination of histones by peptidyl aminidase 4 (PAD4).⁶ Citrullinated histones are hallmarks of neutrophils that underwent NET release.⁶

Here three methods are introduced that in combination provide excellent tools to quantitate NETs on a high-throughput scale. The first assay has been used on the field with different changes and quantitates extracellular DNA release in a microplate format. The second and third assays provide confirmation of NETs by measuring NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes.

프로토콜

조지아 대학의 임상 시험 심사위원회는 건강한 지원자 (UGA 번호 2012-10769-06)에서 말초 혈액을 수집하는 인간 대상 연구를 승인했다. ^5,7,8 자원 봉사자 혈액 그리기 전에 필요한 정보 동의서에 서명했다. 이 문서에서 수행 된 연구는 헬싱키 선언의 인체를 이용한 의학 연구에 대한 윤리 지침을 준수합니다.

주변 인간의 혈액에서 호중구의 1. 분리 (그림 1)

주 : 말초 혈액 호중구를 분리하는 방법에는 여러 가지가있다. 다음 프로토콜은 하나의 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 외부 자극에 그물을 방출 할 수있는 비 - 활성화 인간 호중구 다수 산출한다. 40 ml의 정맥 천자에 의한 건강한 지원자에서 얻은 전체 혈액을 사용합니다. ^7,9

1. 두 50 ML 원뿔 튜브로 나누어지는 20 ml의 혈액입니다. 10 ml의 6 % 덱스 트란을 추가합니다. 부드럽게 섞는다.
2. 20 분 이전 백혈구 후에 RIC깨끗한 50 ML 원뿔 튜브에 어떤 펠렛 적혈구를 복용하고, 멸균 PBS로를 작성하지 않고 시간 상위 단계입니다.
3. 400 XG에 10 분 원심 분리기. 4 용액에 재현 탁 펠렛은 PBS를 멸균.
4. 85 %의 5 단계 퍼콜 구배를 준비 -80 % -75 % -70 % -65 %이 15 ML 원뿔 튜브 및 레이어 2 ㎖의 백혈구 서스펜션의 각 그라데이션의 상단에.
5. 브레이크 해제와 함께 30 분 동안 원심 분리기 800 XG.
6. 모든 셀 75 % / 80 %에서 레이어 (호중구) 70 % / 75 % 인터페이스를 수집합니다.
7. PBS에 두 번 (350 XG, 10 분, RT)을 세포를 씻으과 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.

마이크로 플레이트 형광 계를 사용하여 세포 외 DNA 자료의 속도론 2. 측정

참고 :이 방법은 막 불 투과성 DNA 결합 96 웰 마이크로 포맷에 DNA 자료를 나타내는 염료 (그림 2)의 형광의 변화를 측정 할 수 있습니다.

1. + 분석 매체에서 호중구의 현탁액 (HBSS 준비2 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 농도에서 1 % (v / v)의자가 혈청 + 5 mM의 포도당).
2. 막 투과성 DNA 결합 염료의 5 μmol / L를 추가합니다. 부드럽게 섞는다.
3. 나누어지는 인간 호중구 (50 μL / 웰) 마이크로 96 웰 블랙, 투명 바닥 위에. 확인 분석 배지를 웰의 전체 바닥을 포함합니다. 그렇지 않은 경우, 측면에 부드럽게 판을 누릅니다.
4. 37 ° C에서 10 분간 플레이트 포함 호중구을 따뜻하게.
5. 한편 최종 농도의 두 배에 자극의 솔루션을 준비하는 것은 사용되는 (37 ° C 따뜻한 분석 매체에서). 긍정적 인 NET 컨트롤이 최대 NET 자료를 트리거하기 위해 4 시간 동안 100 나노 포르 - 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)와 인간 호중구를 사용할 때 자발적 NET 형성이 낮은 ^{5,8 남아있다.} 4 시간 동안 ^5,8 PMA 자극은 최대 NET 자료를 보장합니다.
6. 측정 (4 시간, 37 ° C, 여기에 대한 530 nm의 및 배출을위한 590 ㎚)에 대한 마이크로 형광 계를 준비​​합니다.
7. 50 μL 호중구 현탁액 50 μL 자극 용액을 첨가하여 호중구를 자극한다. 최대 DNA 해제 신호를 측정하기 위해 잘 한 0.5 μg의 / ㎖ 사포닌을 사용합니다.
8. 리더 플레이트를 놓고없이 진탕 매 2 분에서 4 시간 동안 형광의 변화를 측정한다.
9. 데이터 분석을 위해, 시간에 따른 형광의 증가 정규화를 계산한다.
   1. 사포닌을 포함한 모든 우물 용 엔드 포인트 값에서 빼기 기준 형광 (그림 2A, B). 사포닌 형광 상승이 가장 높은 신호이어야한다. 이것은 "DNA 최대 방출"(도 2A)로 지칭된다.
   2. 최대 DNA 릴리스 미지 시료의 형광의 증가를 분할하여 미지 시료에서 DNA 방출의 비율을 계산합니다.
   3. 복제의 평균 결과는 "최대 DNA의 출시 %"(그림 2C)로 제시.

NET 양식 3. 정량MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석 실험에 의해 ATION

참고 : 우리의 실험실에서이 분석 수정 (MPO-DNA) 또는 설립 (HNE-DNA)를 MPO-DNA와 HNE-DNA 복합체의 수준을 측정하여 NET 형성을 정량 ^5.

1. 코트 96 웰 높은 결합 하룻밤 캡처 항체 (50 μL / 웰) 용량 ELISA 플레이트 : 안티 - MPO (1 : 2,000 희석) 또는 안티 HNE (1 : 2,000).
2. PBS로 세척 ELISA 플레이트는 세 번 (200 μL / 웰)와 RT에서 2 시간 동안 5 % BSA 및 0.1 % 인간 혈청 알부민을 블록 (200 μL / 웰). PBS로 3 회 세척 할 것.
3. 시드 96 웰 마이크로 / 웰로 100 ㎕를 분석 배지 중 100,000 세포의 밀도로 호중구 및 NET 형성을 자극한다. 세포를 품어 : 37 ° C 4 시간.
4. 그들을 잘 혼합, 호중구 상층 액 2 U / ㎖ DNase를 추가하여 제한된 DNase의 소화를 수행합니다. 실온에서 보관하십시오.
5. 11 μL 25 밀리미터 EGTA (최종 농도 2.5 mm)를 추가하여 15 분 후 DNase의를 중지합니다. 잘 섞다. 스와 수집청소의 microfuge 튜브 pernatants. 스핀 샘플 RT에서 5 분 동안 300 XG에서 세포 파편을 제거한다. 청소의 microfuge 튜브에 자신의 상층 액을 전송합니다. 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오.
6. 이전에 준비 "NET 표준"의 나누어지는을 사용합니다.
   주 : NET-표준은 적어도 5 개의 다른 독립적 인 인간 공여자로부터 수득 PMA 자극 호중구의 DNase 소화 상등액의 혼합이다.
   1. 오랫동안 동일한 표준을 사용하여 수집하고 각 공여자로부터 호중구 상청액 대량 나누어지는한다. 예를 들어 PMA 자극 호중구의 DNase의 소화 상층 액을 2 ㎖를 수집하는 것은 200 분량 씩 200 ELISA 플레이트에 충분한 (10 μL 각)가 발생합니다. 인터넷 표준을 특성화 데이터는 그림 5에서 발견된다.
   2. 4 시간 동안 100 nm의 PMA와 인간 호중구를 자극하고 DNase의이 단계 3.4-3.5있어서 자신의 상층 액을 소화 적용됩니다.
   3. 수집, 수영장, 나누어지는 (10 μL) 무료ZE (-20 ° C) 호중구 상층 액.
   4. 적어도 5 개의 개별 기증자로부터 획득 한 나누어지는 / 기증자 해동, "표준 NET의"를 준비하려면를 혼합하고 얼음에 보관하십시오.
   5. 해동 샘플을 취소하고 다음 실험을 위해 신선한 것을 사용합니다.
   6. PBS + EGTA에서 NET-표준의 2 용액을 희석 : 1을 준비합니다.
7. DNase1 소화 시료 (표준 및 알 수없는 상층 액) PBS + EGTA 20 배 희석 캡처 항체로 코팅 된 ELISA 플레이트에 그들을 나누어지는.
8. 4 ° C에서 밤새 ELISA 플레이트를 품어 PBS로 세 번 씻는다.
9. 검출 항체 용액을 적용 (100 μL / 웰) : 말 래 디쉬 퍼 옥시다아제 접합 항 DNA 항체 (1 : 500, 마우스). 어둠 속에서 1 시간 동안 품어.
10. PBS와 네 세척 후 TMB 퍼 옥시 다제 기판을 추가 : 100 μL / 웰, 30 분. 블루 착색은 퍼 옥시 다제 활성 (현재 그물)에 대한 표시입니다.
11. 잘 100 μL / 1 M 염산을 첨가하여 반응을 중지합니다. 그만큼블루 솔루션은 노란색 (그림 5A)를 설정합니다.
12. 마이크로 광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 참조하십시오.
13. 데이터 분석을 위해, NET 표준에 비해 MPO-DNA 또는 HNE-DNA 복합체의 양을 계산한다.
    1. 모든 샘플에서 분석 배지의 배경 광 밀도 값을 뺀다.
    2. 상대 NET 콘텐츠 (Y 축) (도 5a)에 대한 희석하여 표준 시료의 흡광도 값 (X 축)을 그린다.
    3. 이 표준 곡선의 nonsaturated 범위를 사용하면 (그림 5A) (사용되는 소프트웨어에서 최상의 지수 맞게 사용) 추세선을 설정합니다. 이 추세선 방정식 그물의 양을 양적하기 OD 값의 변환을 결정한다.
    4. 인터넷 표준 (그림 5A)의 비율로 미지 시료에 그물의 양을 줄 것이다 3.13.3에서 추세 줄 식으로 미지의 측정 된 OD 값을 삽입합니다.
    5. 계산하다복제 (삼중)의 평균 (그림 5C) "MPO-DNA 또는 HNE-DNA 복합체 (표준의 %)의 양"으로 최종 데이터를 제시한다.

결과

이 원고의 수치. 호중구 격리, 실험 절차 및 데이터 분석의 설명과 함께 현재 대표적인 결과의 방법을 서술 한 인간 호중구 준비의 순차적 인 단계를 보여줍니다. 이 프로토콜은 호중구 격리의 하나의 가능한 방법을 나타냅니다. 그것은 자극에 그물을 방출 할 수있는 호중구 휴식의 많은 양을 산출한다. 형광 기반의 DNA 자료 분석의 작동 방식

토론

그물 그물의 문학은 지속적으로, 생물학,기구 및 규제에서의 역할에 관한 몇 가지 중요한 질문이 불분명 남아 자신의 발견 이후 지난 10 년에 걸쳐 확대되고 있지만 병원균을 죽인다. ¹ 호중구하는 매혹적인 새로운 메커니즘을 나타냅니다. 적절한 방법은 그물이 매우 독특한 항균 메카니즘을 측정하기 위해 개발되어야한다. 이 문서는 높은 처리량 방식으로 그물을 정량하는 데 사용할 수?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x coated
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)	Millipore	07-496	1:2,000x coated
DNase-1	Roche	10-104-159-001	1 µg/ml used for digestion
20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Eon Microplate Spectrophotometer	Biotek
Gen5 All-in-One microplate software	Biotek		analytical tool (ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0.2% final concentration/volume
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Use 10 mM final concentration.
1 M glucose	Sigma		Use 5 mM final concentration.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final used
ELISA Plate	Greiner bio-one	655061
Conical tubes 15 ml	Thermoscientific	339650
Conical tubes 50 ml	Thermoscientific	339652
Percoll (pH 8.5-9.5)	Sigma	P 1644	Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 media	Corning Cellgro	17-105-CV
96 well assay plate black plate clear bottom	Costar	3603