Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu<em&gt; İn Vitro</em

Özet

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Özet

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation.

Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

Giriş

NET formation is a novel mechanism by which neutrophils fight pathogens.¹ The core of NETs is nuclear DNA.¹ This DNA network is associated with neutrophil granule proteins and histones.¹ The main form of NET formation requires the death of neutrophils characterized by chromatin decondensation, disappearance of granular and nuclear membranes, translocation of neutrophils elastase to the nucleus, citrullination of histones and finally the spill of DNA-based NETs.² NETs entrap and kill a wide variety of microbes and are an essential part of the innate immune weapon repertoire. Uncontrolled NET formation has, however, been linked to numerous autoinflammatory diseases.^3,4 Despite their increasingly established relevance, little is known about the mechanism and regulation of NET release.

Neutrophils dying by releasing NETs are different from apoptotic or necrotic neutrophils.^3,5 NET-releasing neutrophils show several features that are characteristic for NET formation. Granule components are associated with DNA in NETs.¹ Myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE) are both found in primary granules in resting cells but are translocated to the nucleus to bind to DNA in NETs.¹ MPO-DNA and HNE-DNA complexes are specific for NETs, do not occur in apoptotic or necrotic neutrophils.^1,3,5 Chromatin decondensation is another feature typical for NETosis.² NET release also requires citrullination of histones by peptidyl aminidase 4 (PAD4).⁶ Citrullinated histones are hallmarks of neutrophils that underwent NET release.⁶

Here three methods are introduced that in combination provide excellent tools to quantitate NETs on a high-throughput scale. The first assay has been used on the field with different changes and quantitates extracellular DNA release in a microplate format. The second and third assays provide confirmation of NETs by measuring NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes.

Protokol

Georgia Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu sağlıklı gönüllülere (UGA # 2012-10769-06) periferik kan toplamak için insan konu çalışmayı onayladı. ^5,7,8 Gönüllüler kan beraberlik önce gerekli bilgilendirilmiş onam formunu imzaladı. Bu makalede yapılan araştırmalar Helsinki Bildirgesi'nin insan denekler üzerinde tıbbi araştırmalar için etik kurallarına uygun olduğunu.

Periferik İnsan Kanı adlı Nötrofiller 1. izolasyonu (Şekil 1)

Not: Periferik kan nötrofillerin izole edilmesi için çeşitli yollar vardır. Aşağıdaki protokol, bir imkanı sağlar. Bu protokol, dış uyarım üzerine NET'leri salabilen aktif olmayan, insan nötrofil sayıda verir. 40 ml delme ile sağlıklı gönüllülerden elde edilen tam kan kullanın. ^7,9

1. iki adet 50 ml konik tüpler içine kısım 20 ml kan. 10 mi% 6 Dekstran ekleyin. hafifçe karıştırın.
2. 20 dakika transferi lökosit ric sonratemiz 50 ml'lik konik tüpler içine herhangi peletlenmiş kırmızı kan hücrelerinin alarak ve steril PBS ile doldurmak olmadan h üst faz.
3. 400 x g'de 10 dakika santrifüje. 4 ml süspanse pelet PBS steril.
4. % 85 5-adım Percoll degrade hazırlayın -80% -75% -70% -65% iki 15 ml konik tüpler ve katman 2 ml lökosit süspansiyonu her degrade üstünde.
5. frenler kapalı olarak 30 dakika boyunca Santrifüj 800 xg.
6. tüm hücreler% 75 /% 80 tabakalarında (nötrofilleri) ve% 70 /% 75 arayüzü toplayın.
7. PBS içinde iki kez (350 xg, 10 dakika, RT) hücre yıkayın ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.

Bir Mikroplaka florimetrede Kullanarak Hücre dışı DNA Yayın Kinetiği 2. Ölçüm

Not: Bu yöntem, bir zara-geçirmeyen DNA bağlayıcı 96 oyuklu bir mikro-plaka biçiminde DNA serbest gösterge boya (Şekil 2) arasında floresan değişikliklerin ölçülmesini sağlar.

1. + Deney ortamı içinde nötrofil bir süspansiyonu (HBSS hazırlanması2 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir konsantrasyonda,% 1 (h / h) otolog serum + 5 mM glükoz).
2. Zarın geçirgenlik göstermediği bir DNA bağlayıcı boya 5 umol / L ekleyin. hafifçe karıştırın.
3. Kısım İnsan nötrofilleri (50 ul / oyuk) 96 çukurlu mikrolevhaların siyah şeffaf dibine. Emin deney ortamı kuyunun tüm alt kapsar emin olun. Değilse, yan hafifçe plaka dokunun.
4. 37 ° C'de 10 dakika süreyle plaka içeren nötrofillerin ısıtın.
5. Bu sırada nihai konsantrasyonlarının iki katı uyaranların çözümler hazırlamak kullanılmak üzere (37 ° C sıcak bir deney ortamı içinde). Pozitif NET kontrolü maksimum NET salınımını tetiklemek için 4 saat boyunca 100 nM forbol-miristat-asetat (PMA) insan nötrofilleri kullanmak spontan NET oluşumu düşük ^5,8 kalır. 4 saat boyunca ^5,8 PMA uyarımı maksimal NET salınımını sağlar.
6. Ölçme (4 saat, 37 ° C, uyarma için 530 nm ve emisyon 590 nm) için mikroplak florimetresi hazırlayın.
7. 50 ul nötrofil süspansiyonlar 50 ul uyaran çözeltisi ilave edilerek nötrofillerin uyarırlar. Maksimal bir DNA salma sinyalinin ölçülmesi de bir 0.5 ug / ml saponin kullanın.
8. okuyucusunda plaka koyun ve hiçbir çalkalanarak her 2 dakikada 4 saat floresan değişiklikleri ölçer.
9. Veri analizi için, zamanla floresan normalize artışlar hesaplar.
   1. Saponin dahil olmak üzere tüm kuyuları için son nokta değerleri çıkarınız, taban floresans (Şekil 2A, B). saponin floresan artış en yüksek sinyal olmalıdır. Bu "olarak maksimum DNA serbest" (Şekil 2A) olarak ifade edilir.
   2. maksimal DNA salınımı ile bilinmeyen numunelerin floresan artışlar bölerek bilinmeyen örneklerinde DNA sürümü yüzdelerini hesaplayınız.
   3. Çoğaltır ortalama sonuçları ve "maksimal DNA sürüm%" (Şekil 2C) olarak sunuyoruz.

NET Formu 3. kantitasyonuMPO-DNA ve HNE-DNA ELISA tahlilleri ile tirme

Not: laboratuvarımızda Bu tahliller, modifiye edilmiş (MPO-DNA) ya da kuruldu (HNE-DNA) MPO-DNA ve HNE-DNA kompleksleri seviyeleri ölçülerek NET oluşumu miktarının ^5.

1. Ceket 96 oyuklu yüksek bağlama gece boyunca antikorlarla (50 ul / kuyucuk) kapasitesi ELISA plakaları: Anti-MPO (1: 2000 seyreltme) ya da anti-HNE (1: 2,000).
2. PBS ile yıkayın ELISA plakaları, üç kez (200 ul / oyuk) ve oda sıcaklığında 2 saat süre ile% 5 BSA ve% 0.1 insan serum albümini ile bloke (200 ul / oyuk). PBS ile üç kez yıkanır.
3. Tohum 96 oyuklu mikro / göz 100 ul deney ortamı içinde 100,000 hücre yoğunluğunda nötrofiller ve NET oluşumunu uyarır. hücreleri inkübe: 37 ° C 4 saat.
4. iyice karıştırın, nötrofil Süpernatantları 2 U / ml DNaz ekleyerek sınırlı DNase sindirim gerçekleştirin. Oda sıcaklığında tutun.
5. 11 ul 25 mM EGTA (nihai konsantrasyon 2.5 mM) eklenerek 15 dakika sonra DNase durdurun. İyice karıştırın. SU toplayınTemiz mikrofuj tüpleri içerisinde pernatants. Spin örnekleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de hücre enkaz kurtulmak için. Temiz mikrofuge'de tüpler içine onların süpernatantlar aktarın. hazır olana kadar buz üzerinde saklayın.
6. önceden hazırlanmış "NET standart" bir kısım kullanın.
   Not: NET standardı en az 5 farklı, bağımsız insan vericilerden elde edilen PMA ile uyarılmış nötrofil DNaz ile sindirilmiş yüzer bir karışımıdır.
   1. , Uzun bir süre aynı standart kullanmak toplamak ve her donörden nötrofil süpernatantlar büyük bir ses bölmeyin için. Örneğin PMA ile uyarılan nötrofil DNaz ile sindirilmiş yüzer 2 ml toplama 200 alikotları 200 ELISA plakaları için yeterli (10 ul her) neden olur. NET standart karakterize eden veriler, Şekil 5'de görülmektedir.
   2. 4 saat boyunca 100 nM PMA insan nötrofilleri uyarır ve DNaz adımları 3,4-3,5 göre kendi süpernatanlanna sindirmek geçerlidir.
   3. Toplama, havuz alikotu (10 ul) ve serbestze (-20 ° C), nötrofil süpernatanlar.
   4. en az beş ayrı donörlerden elde edilen bir kısım / donör çözülme, "standart NET" hazırlamak için, bunları karıştırın ve buz üzerinde saklayın.
   5. çözülmüş örnekleri atın ve bir sonraki deney için taze olanları kullanın.
   6. PBS + EGTA NET-standart 2 seri seyreltme: 1 hazırlayın.
7. DNase1-sindirilmiş örnekleri (standart ve bilinmeyen süpernatantlar) PBS + EGTA içinde 20-kat seyreltilir ve yakalama antikorları ile kaplanmış ELISA plakaları üzerinde bunları kısım.
8. 4 ° C'de gece boyunca ELISA inkübe edin ve PBS ile uygun üç kez yıkayın.
9. Algılama antikoru solüsyonu halinde (100 ul / oyuk): turp peroksidaz konjuge anti-DNA antikoru (1: 500, fare). Karanlıkta 1 saat süreyle inkübe edin.
10. PBS ile dört kez yıkamadan sonra, TMB peroksidazı substrat ekleyin: 100 ul / oyuk, 30 dak. Mavi bir renk peroksidaz aktivitesi (mevcut NET) için bir göstergesidir.
11. de 100 ul / 1 M HCI ilave ederek reaksiyonu durdurun.mavi çözümler sarı (Şekil 5A) dönecek.
12. bir mikro-fotometre kullanılarak 450 nm'de absorbansı okumak.
13. Veri analizi için, NET standardına göre MPO-DNA veya HNE-DNA kompleksleri miktarını hesaplayın.
    1. bütün örneklerden, deney ortamı GEÇMİŞİ optik yoğunluk değeri çıkarın.
    2. Nispi net içeriği (Y-ekseni) (Şekil 5A) karşı seyreltilmiş standart numunelerin absorbans değerlerine (X-ekseni) çizilir.
    3. Bu standart eğrinin nonsaturated aralığını kullanarak (Şekil 5A) (kullanılan yazılım en iyi üstel uyum kullanın) bir trend çizgisi kurmak. Bu eğilim çizgisinin denklemi NET'ler miktarda nicel OD değerlerinin dönüşüm belirler.
    4. NET-standart (Şekil 5A) yüzdesi olarak bilinmeyen numunedeki NET'ler miktarda verecektir 3.13.3 den trend çizgisi denklemi içine bilinmeyenler ölçülen OD değerlerini yerleştirin.
    5. Hesaplamakçoğaltır (üç kez) ortalamaları ve (Şekil 5C) "MPO-DNA veya HNE-DNA kompleksleri (standardın%) miktarı" olarak son verileri sunmak.

Sonuçlar

Bu yazıda rakamlar. Nötrofil izolasyon, deneysel prosedürler ve veri analizi açıklama ile mevcut temsilcisi sonuçları yöntemi tarif 1 insan nötrofil hazırlık ardışık adımları göstermektedir. Bu protokol nötrofil izolasyon tek olası yolu temsil eder. Bu stimülasyon üzerine NET'leri salabilen nötrofillerin istirahat büyük miktarda verir. Floresan bazlı DNA salınım testi nasıl çalıştığını 2 gösteriler...

Tartışmalar

NET'ler NET'ler edebiyat sürekli, biyoloji, mekanizma ve yönetmelik rollerine ilişkin birkaç önemli soru belirsizliğini koruyor onların keşfinden bu yana geçen on yıllar içinde genişleyen olmasına rağmen patojenleri öldürmek. ¹ nötrofil hangi büyüleyici yeni bir mekanizma temsil etmektedir. Uygun metodoloji NET'leri, bu çok benzersiz antimikrobiyal mekanizma ölçmek için geliştirilmiş olmalıdır. Bu makalede, bir yüksek verimli bir şekilde netler ölçmek için kullanıl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x coated
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)	Millipore	07-496	1:2,000x coated
DNase-1	Roche	10-104-159-001	1 µg/ml used for digestion
20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Eon Microplate Spectrophotometer	Biotek
Gen5 All-in-One microplate software	Biotek		analytical tool (ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0.2% final concentration/volume
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Use 10 mM final concentration.
1 M glucose	Sigma		Use 5 mM final concentration.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final used
ELISA Plate	Greiner bio-one	655061
Conical tubes 15 ml	Thermoscientific	339650
Conical tubes 50 ml	Thermoscientific	339652
Percoll (pH 8.5-9.5)	Sigma	P 1644	Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 media	Corning Cellgro	17-105-CV
96 well assay plate black plate clear bottom	Costar	3603